3단계 연속 발효법으로 제조한 섬애약쑥 식초의 품질 특성신정연

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3단계 연속 발효법으로 제조한 섬애약쑥 식초의 품질 특성

신정연¹․신지현²․강민정²․강재란²․최진상¹․서원택¹․신정혜²

1경남과학기술대학교 식품과학부

2(재)남해마늘연구소

Quality Characteristics of Seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) Vinegar Using a Three-Step Continuous Fermentation Method

Jeong Yeon Shin¹, Ji Hyeon Shin², Min Jung Kang², Jae Ran Kang², Jin Sang Choi¹, Weon Teak Seo¹, and Jung Hye Shin²

1Department of Food Technology, Gyeongnam National University of Science and Technology

2Namhae Garlic Research Institute

ABSTRACT This study was conducted to develop fermented foods using Artemisia argyi H. (seomaeyaksuk) and identify its activity. Vinegar was completed through a three-step fermentation process (lactic acid fermentation, alcoholic fermentation, and acetic acid fermentation). A sikhye added with 15% seomaeyaksuk water extract was used as the fermentation substance. Each sikhye was added with 0, 0.25, 0.5, and 1.0% monosodium glutamic acid (MSG) to enhance γ-aminobutyric acid (GABA) content and then fermented at 30°C for 3 days with Lactobacillus brevis (KI271266).

GABA content increased with fermentation period and was the highest in the MSG 1.0%-added sample (354.38 mg/L).

Saccharomyces cerevisiae starter was inoculated for alcohol fermentation and analyzed at 0, 2, 4, and 6 days. During alcohol fermentation, alcohol content was 1.75∼5.35% at 2 days, and was the highest in the 0.25% MSG-added group. After 6 days of alcohol fermentation, Acetobacter pasteurianus A8 was inoculated for acetic acid fermentation for 20 days. Samples were taken at 4-day intervals. pH level decreased while acid content gradually increased during fermentation. Seven kinds of organic acids were detected, and acetic acid content was most abundant. GABA contents were higher 6.5- and 14-fold higher in the MSG 0.25%- and 1.0%-added samples, respectively, compared to the non-MSG sample. After completion of acetic acid fermentation, the total polyphenol content of vinegar was higher in the MSG 1.0%-added sample compared to the 0∼0.5% MSG-added samples. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity was also higher in the 1.0% MSG-added sample than others. Based of these results, we confirmed that the addition of MSG enhanced GABA contents and antioxidant activity as a result of the complex action of vinegar itself, the active ingredient of seomaeyaksuk, and new products of the fermentation process.

Key words: seomaeyaksuk, GABA, Lactobacillus brevis, vinegar, acetic acid fermentation

Received 16 October 2017; Accepted 28 November 2017 Corresponding author: Jung-Hye Shin, Namhae Garlic Research Institute, Namhae, Gyeongnam 52430, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-55-860-8947

서 론

독특한 향취를 가지며, 식용, 색소 등의 소재로 널리 사용 되어온 국화과(Compositae)의 쑥속(Artemisia)에 속하는 쑥(Artemisia princeps var. orientalis)은 구황작물로도 가 치가 커 우리의 생활 속과 매우 친숙한 식물이다(1). 쑥은 다년생 초본식물로 한국이나 중국, 일본 등 아시아 지역과 유럽지역 등에서 주로 산과 들에 자생하는데, 번식력이 강하 여 그 종류는 2,000여 종에 달하며 우리나라에는 약 300여 종이 자생하고 있다(2). 예로부터 쑥의 줄기는 약용으로, 어 린잎은 술, 쑥밥, 쑥국수, 쑥경단, 쑥차, 떡, 국, 무침, 나물

등으로 식용에 이용되어 왔으며, 민간요법과 한방에서는 쑥 의 전초를 말려 진정, 경련, 마비 및 전신강직 등의 치료와 복통, 토혈, 만성간염, 동맥경화, 부인병, 식욕부진 및 만성 위장염 등의 질병에 적용하여 왔다(1).

현대인의 식품소비 트렌드는 기존의 식품첨가물이 함유 된 식품류보다는 자연식품을 그대로 섭취하거나, 가공기술 을 통해 기존의 식품성분 중 유용성분만을 분리하거나, 생물 전환을 통해 유용성분을 증가시켜 섭취하는 방향으로 변화 하고 있다. 식품 중의 유용성분을 증가시키는 대표적인 가공 방법 중 하나인 발효는 효모, 유산균 및 초산균 등 발효균주 를 이용하여 식품에 물리적 조작을 최소화함으로써 유용성 분을 얻을 수 있는 장점이 있다(3).

대표적인 발효식품인 유산균 발효 식품은 다양한 식물성 원료의 주스나 추출물을 활용하여 개발되고 있으며, 그 특성 에 따라 생리활성 기능에도 차이를 보이는 것으로 보고되고

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있는데, 그 예로 인삼열매 추출물을 유산균 발효함으로써 사포닌 함량과 항산화 활성이 증가하였다는 보고가 있으며 (4), Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum과 같 은 유산균주는 발효 과정을 통해 γ-aminobutyric acid (GABA) 등의 생리활성 물질의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(5).

음료로도 인기가 높은 식초는 특유의 신맛과 방향을 가진 식품으로 유기산, 당류, 아미노산 등을 함유하고 있는 대표 적인 발효식품이다(6). 식초는 소화액의 분비 촉진에 따른 소화촉진 효과, 피로에 의해 축적된 lactic acid 분해에 따른 피로회복 및 숙취해소, 혈중 콜레스테롤 저하에 따른 동맥경 화와 고혈압 등 심혈관계 질환의 예방, 체지방 감소 등의 효과를 가지는 것으로 알려져 있어 건강 지향적인 현대인으 로부터 선호되고 있는 식품 중 하나이다(7-9). 식초의 이러 한 기능성을 강화하고자 다양한 재료를 첨가하여 발효한 연 구들이 진행되어 있는데, Hong 등(10)은 오이식초를 제조 하여 식초의 숙취해소 기능성을 강화하고자 하였다. Kim 등(11)은 미나리 발효액을 첨가한 식초를 제조한 결과 산화 적 손상에 대한 뇌신경 세포의 보호효과가 있음을 확인하였 으며, Ann 등(12)은 홍삼식초의 체중감소 효과를 규명함으 로써 식초의 비만억제 기능성을 확인한 바 있다.

한편 GABA는 자연계에 널리 분포하는 비단백질 구성 아 미노산으로 사람에 있어서는 신경계와 혈액에 함유되어 있 는데 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 신경전달물질(ace- tylcholine)을 증가시키고, 뇌기능을 촉진시키는 등의 효과 가 있는 것으로 알려져 있다(13). 이외에도 성장 호르몬의 분비 조절, 통증 완화, 고혈압 저하 효과 및 이뇨 효과 등 여러 생리작용이 보고되고 있다(14,15). GABA는 생리활성 기능이 매우 우수한 소재로서 각광을 받고 있으며, 이러한 기능성을 기반으로 GABA 함량이 증진된 발아현미(14), 유 산균 발효에 의한 GABA 함유 토마토 페이스트(16), 오미자 열매 추출물의 고농도 GABA 함유 발효음료(17) 등 GABA 성분을 식품, 식품첨가물 및 화장품 소재로 이용하려는 시도 가 다양하게 이루어지고 있다.

본 연구에서는 2013년 산림청에 품종보호 등록(제 42호) 된 남해군의 고유 쑥 품종인 섬애약쑥 추출물을 이용하여 쑥 식초를 제조함에 있어 그 기능성을 강화하는 방안으로 GABA 함량이 증가한 발효 조건을 확립하고자 하였다. 즉 당의 함량이 낮은 섬애약쑥 물 추출물을 발효를 위한 기질로 활용하고자 쑥 추출물이 첨가된 식혜를 제조한 후 GABA 함량 증가를 위해 monosodium glutamate(MSG)를 비율별 로 첨가한 다음 유산균 발효를 실시하였으며, 이어서 알코올 발효 및 초산 발효를 단계별로 거치면서 식초를 제조함에 있어 단계별 발효에서 주요 이화학적 특성을 분석하였으며, 완성된 쑥 식초의 항산화 활성을 비교하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 쑥 추출물의 제조

실험에 사용된 섬애약쑥(seomaeyaksuk, Artemisia argyi H.)은 6월경 경남 남해군 설천면에서 재배되고 있는 것 을 채취하여 이물질을 제거한 후, 흐르는 물에서 2회 세척하 였다. 이를 18~24°C의 그늘지고 바람이 잘 통하는 실내에 서 매일 1회씩 위치를 바꾸거나 뒤집어 주면서 14일간 자연 건조 시켰다. 건조가 완료된 섬애약쑥은 비닐 팩에 담아 흡 습을 방지하여 상온에 보관하면서 시료로 사용하였다.

식혜 제조를 위한 맥아는 푸른들 농산(주)(Andong, Ko- rea)의 제품을 구입하여 균일하게 체질한 후 고운분말을 사 용하였고, 시판되는 고성 청결미를 이용하여 고두밥을 지어 식혜 제조에 이용하였다.

쑥 식혜 제조에 사용된 쑥 추출물은 건조된 쑥의 무게 대 비 10배의 정제수를 가하여 2시간 이상 침지시켜 충분히 수화시킨 후 autoclave를 이용하여 121°C에서 30분간 고 온 추출하여 제조하였다. 추출물은 cheese cloth로 여과하 여 사용하였다.

유산균, 알코올 및 초산 발효 균주 및 종 배양

유산균 발효 균주는 일반 가정에서 수거한 김치 70여 종 에서 분리한 유산균 약 200여 종 중 TLC plate(TLC Silica gel 60 F254, Glass plates 20×20 cm, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 상에서 GABA 표준물질과 동일한 Rf 값을 나타내는 물질을 가장 많이 생성한 균주 LAB86GA 를 분리하여 사용하였다. 분리된 균주는 Genbank의 공지서 열과 서열 상동성을 비교한 결과 100% Lactobacillus brevis(KI271266)로 일치하여 동일한 균주로 확인되었다.

LAB86GA 균주는 Lactobacilli MRS 액체배지에서 종 배양 하여 유산균 발효물 제조에 사용하였다.

알코올 발효에는 Saccharomyces cerevisiae(KCCM 11251)를 사용하였으며, 균주는 YPDA(0.5% yeast extract, 0.5% peptone, 2% dextrose, 1.5% agar) 배지에서 계대배양 하면서 사용하였다. 초산 발효 균주는 본 연구진이 식초로부터 분리하여 보관 중인 Acetobacter pasteurianus A8을 사용하였으며, GYCEA(3% glucose, 0.5% yeast extract, 1% CaCO₂, 4% ethanol, 1.5% agar) 배지에서 계대 배양 하였다. 알코올 발효와 초산 발효 균주의 종 배양은 고운체에 친 엿기름 분말 200 g을 정제수 1 L에 현탁시켜 60°C에서 2시간 동안 당화시킨 후 여과하여 제조한 엿기름 당화액에 각각의 균주를 접종한 다음 30°C의 진탕배양기 (IS-971RF model, Jeiotech Co., Seoul, Korea)에서 160 rpm으로 3일간 진탕배양 하였다.

3단계 연속 발효물의 제조

쑥 식혜 제조를 위해 고두밥 100 g에 정제수 500 mL를 가하고 여기에 엿기름 분말을 총 무게 대비 10%, 쑥 추출액

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을 15% 첨가한 후 충분히 혼합하였다. 이것을 60±3°C의 항온수조 내에서 내용물이 모두 잠기게 중탕하면서 5시간 동안 당화시킨 다음 90°C 이상에서 10분간 가열하여 쑥 식 혜를 완성하였다.

GABA 함량이 증가한 유산균 발효물을 제조하기 위하여 가열해 당화가 완료된 쑥 식혜를 무균대에서 자연냉각시켜 약 30°C가 되면 각각 MSG(Samchun Pure Chemical Ltd., Pyeongtaek, Korea)를 쑥 식혜의 총 부피 대비 0, 0.25, 0.5 및 1.0%씩 첨가한 후 종 배양한 유산균주를 당화액의 5%(v/v) 비율로 접종하여 30°C에서 배양하면서 접종 직후 (0시간), 12, 24 및 72시간에 시료를 각각 취하여 GABA 함량을 측정하였다.

알코올 발효물의 제조는 3일간 유산균 발효를 거친 쑥 식혜 기질에 종 배양한 S. cerevisiae(KCCM 11251)를 각 5%씩 접종한 후, 30±3°C에서 6일간 정치배양 하여 알코올 발효를 실시하였다. 이때 대조군은 유산균 발효를 거치지 않은 쑥 식혜를 사용하였으며, 쑥 추출물을 첨가하지 않고 식혜를 제조한 후 유산균 발효한 것을 양성대조군으로 하여 알코올 발효를 진행하였으며, 2일 간격으로 시료를 취하였 다.

초산 발효물의 제조는 6일간의 알코올 발효가 완료된 각 각의 발효물에 종 배양한 초산균을 5%(v/v) 접종하여 30±

3°C에서 20일간 정치배양 하면서 4일 간격으로 시료를 취 하여 이화학적 특성을 분석하였다.

알코올 농도 측정

알코올 발효된 시료 50 mL에 증류수 100 mL를 가하고 환류냉각기를 이용하여 수증기 증류한 증류액 30 mL에 다 시 증류수를 가하여 50 mL로 만든 액을 디지털주정계(MT- 830, Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 알코올 농도를 측정하였다.

pH 및 산도 측정

pH와 산도는 시료 5 g에 증류수를 가해 50 mL로 만든 다음 잘 혼합한 후 여과지(Advantec No. 2, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 여액을 시료로 하여 자동적정기(G20 compact titrator, Mettler Toledo, Gre- ifensee, Switzerland)로 동시에 측정하였다. 적정산도는 0.1 N NaOH 용액으로 시료액의 pH가 8.4가 될 때까지 적정 하여 초산 양으로 환산하였다.

GABA 정량

GABA의 함량은 효소분석 방법을 이용하여 정량하였다 (18). 액상 시료 1 mL에 70 mM LaCl3 1 mL를 가하여 15분 동안 잘 섞어준 후 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다.

상등액 400 μL를 취하여 0.1 M KOH 160 μL를 미리 넣어둔 centrifuge tube에 넣어 5분간 교반하였다. 다시 4,000 rpm 에서 5분간 원심분리 한 상등액 50 μL에 0.5 M K₄P₂O₇완충

용액(pH 8.6) 50 μL와 4 mM NADP 150 μL를 첨가한 후 2.0 unit/mL GABase 50 μL를 혼합하여 340 nm에서 흡광 도를 측정하였으며(initial A), 20 mM의 α-ketoglutarate를 50 μL 넣고 25°C에서 60분 동안 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도를 측정하였다(final A). 농도별 GABA(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)를 동일한 조건에서 분석한 표준 검량곡선에 측정된 흡광도(final A－initial A)를 대입하여 생성된 GABA 함량을 산출하였다.

유기산의 함량

각각의 시료를 여과지로 여과한 여액을 취하여 0.45 μm membrane filter로 재여과한 다음 HPLC(Agilent 1260 infinity, Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였다.

분석용 칼럼은 Watchers 120 ODS-BP(4.6×250 mm, 5 μm, Watchers, Daiso Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) 를 사용하였고, 이동상 용매는 0.1% H₃PO₄ 수용액을 0.5 mL/min의 속도로 주입하였으며, 분석온도는 30°C를 유지 하였고, 10 μL의 시료를 주입하여 210 nm에서 UV 검출기 를 이용하여 검출하였다. 총 10종의 유기산(citric acid, oxalic acid, tartaric acid, formic acid, malic acid, lactic acid, acetic acid, fumaric acid, succinic acid, propionic acid) 표준물질을 시료와 동일한 조건에서 분석하여 머무름 시간을 비교해 확인하였으며, 각각의 검량곡선으로부터 그 함량을 산출하였다.

총 폴리페놀 화합물의 함량

초산 발효가 완료된 식초의 총 폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Ciocalteu법(19)으로 측정하였다. 시료를 3,000 rpm 으로 15분간 원심분리 한 상등액 0.5 mL와 25% Na2CO3

용액 0.5 mL를 혼합하여 3분간 정치시켰다. 다시 2 N- Folin-Ciocalteu phenol 시약 0.25 mL를 첨가하여 혼합한 다음 30°C에서 1시간 동안 정치시켜 발색시켰다. 발색된 청색을 분광광도계를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물의 함량은 gallic acid (Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부 터 산출하여 시료 g당 mg GAE(mg of gallic acid equivalents)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성

Blois(20)의 방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(C₁₈H₁₂N₅O₆, DPPH) 라디칼 소거 활성에 의한 항산 화 활성을 측정하였다. 에탄올로 1.5×10^-4M 농도가 되도 록 조절한 DPPH 용액 0.8 mL에 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 한 발효 완료된 식초 상등액 0.2 mL를 가하고 10 초간 균질화시킨 다음 실온에서 30분간 방치한 후 분광광도 계로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료 대신에 증류수 0.2 mL를 가하여 동일하게 실험하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 시료첨가군에 대한 음성대조군

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Table 1. Changes in GABA content of lactic acid fermented sikhye added with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different ratio of MSG (mg/L)

Fermentation period (days)

MSG addition ratio (%)

0 0.25 0.5 1.0

0 1 2 3

ND 12.29±1.30âA 34.48±0.18âB 47.50±0.54âC

ND 101.25±1.88^bA 173.44±1.62^bB 200.42±6.86^bC

ND 131.46±0.95^cA 201.88±3.31^cB 260.10±3.43^cC

ND 162.92±0.18^dA 257.81±5.41^dB 354.38±1.62^dC Each value is a mean±standard deviation of 5 samples. ND: not detected.

Means with different small letters (a-d) in the same row are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Means with different capital letters (A-C) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Table 2. Changes in alcohol contents during alcohol fermentation of sikhye prepared with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different amount of MSG by lactic acid fermentation (%)

Fermentation period (days)

0 0.25 0.5 1.0 Control Positive control

0 2 4 6

0^A 4.15±0.00^cdB 4.90±0.07^dC 5.85±0.07^dD

0Â 5.35±0.05êB 5.55±0.07êC 5.85±0.10^dD

0^A 3.60±0.10^bB 4.60±0.14^cC 4.95±0.07^bD

0Â 1.75±0.35âB 3.17±0.00âC 4.21±0.00âD

0^A 4.25±0.00^dB 5.90±0.00^fC 6.95±0.07^eC

0^A 3.90±0.07^cB 4.23±0.07^bC 5.25±0.07^cD Control: sikhye added with seomaeyaksuk extract that was not performed lactic acid fermentation.

Positive control: sikhye not added with seomaeyaksuk extract that was fermented by lactic acid bacteria (LABGA86).

Each value is a mean±standard deviation of 3 samples.

Means with different small letters (a-f) in the same row are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Means with different capital letters (A-D) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

의 흡광도 비를 백분율로 표시하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 실험으로 부터 얻은 결과는 SPSS 12.0(Statistical Package for Social Science, IBM Co., Endicott, NY, USA)을 사용하여 분석하였다. 결과값은 실험군당 평균±표준편차로 표시하였 고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 시행하였다.

결과 및 고찰

유산균 발효 중 GABA의 함량 변화

3일간 유산균 발효를 진행하면서 일자별로 시료를 각각 취하여 GABA 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 유산 균 접종 직후에는 GABA 함량이 낮아 모든 시료에서 검출되 지 않았으나 발효 1일부터 그 함량은 증가하여 무첨가군에서 도 12.29 mg/L로 정량되었으며, 발효가 진행되면서 그 함 량은 점차 증가하는 경향을 나타내었다. MSG의 첨가 농도 가 높을수록 GABA의 생성량이 증가하였으며, MSG를 첨가 하지 않은 대조군의 경우에도 발효기간이 증가할수록 GABA 함량이 증가하였는데, 이는 식혜의 원료로 사용된 쑥과 맥아 추출물 중의 글루탐산이 유산균에 의해 GABA로 전환됨으 로써 그 함량이 증가한 것으로 판단된다. 발효 3일에 MSG 무첨가군의 GABA 함량은 47.5 mg/L였으나 0.25% 첨가군

은 200.42 mg/L로 4.2배가 증가하였고, 0.5% 첨가군에서 는 5.5배가 증가하여 GABA가 생성된 절대량은 MSG 첨가 비율에 큰 영향이 없었다. 이를 통해 유산균에 의한 글루탐 산의 GABA로의 전환율은 발효초기에 높고 발효기간이 경 과함에 따라 낮아지지만 생성된 GABA의 양이 누적됨으로 인해 발효기간이 경과할수록 최종 생성량은 더 증가함을 알 수 있었다.

유산균은 발효 과정에서 산성화 스트레스에 대한 방어 수 단으로 glutamate로부터 탈탄산에 의한 효소적 반응에 의 해 세포 내 proton을 소비하면서 GABA를 생산하여 발효물 의 산도를 유지 또는 감소시키는데, 당의 함량이 제한된 조 건에서는 질소원으로 작용하는 MSG의 함량이 높을 때 GABA 전환이 효율적인 것으로 보고되어 있다(17,21). 본 연구의 결과에서도 발효 기질 중의 탄소원은 한정되어 있으 므로 MSG의 함량이 높았던 시료에서 GABA의 생성량이 더 높아 동일한 경향이었다.

알코올 발효 과정 중 알코올 함량의 변화

MSG를 비율별로 첨가한 유산균 발효물을 기질로 하여 알코올 발효를 진행하면서 알코올 생성량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 2일 간격으로 알코올 함량을 분석한 결과 발효 2일에는 1.75~5.35%의 알코올이 생성되었다. 알코올 의 함량은 발효기간이 경과함에 따라 점차 증가하여 최종 발효 6일에는 4.21~6.95%의 알코올이 생성되었는데, MSG 의 첨가 비율이 0.25%일 때는 MSG 무첨가 시료와의 차이 가 없었다. 쑥 식혜에 MSG를 첨가하고 유산균 발효한 후

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Table 3. Changes in pH during acetic acid fermentation of sikhye prepared with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different ratio of MSG

Fermentation day

0 4 8 12 16 20

3.32±0.01^aE 3.28±0.00^cD 3.11±0.02^bC 3.09±0.01^bBC 3.07±0.03^cB 3.01±0.03^dA

3.44±0.01^cC 3.47±0.01^dD 3.43±0.01^dC 3.20±0.02^cB 3.19±0.01^dB 3.16±0.01^eA

3.40±0.01^bB 3.57±0.02^fC 3.51±0.07^dC 3.41±0.01^dB 3.37±0.08^eB 3.26±0.02^fA

3.50±0.02^dF 3.13±0.03^bE 2.98±0.02^aD 2.84±0.01^aC 2.79±0.02^bB 2.75±0.01^bA

3.35±0.02^aC 3.51±0.01^eD 3.42±0.09^cC 3.13±0.07^bB 3.03±0.01^cA 2.95±0.01^cA

3.51±0.03^dE 3.02±0.01âD 3.00±0.01âD 2.81±0.02âC 2.66±0.01âB 2.61±0.01âA Control: sikhye added with seomaeyaksuk extract that was not performed lactic acid fermentation.

Means with different small letters (a-f) in the same row are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Means with different capital letters (A-F) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

알코올 발효를 진행하였을 때 MSG의 첨가 비율이 높을수록 알코올 생성량은 적어지는 경향을 나타내었는데, 알코올 발 효 2일차에 MSG 0.25% 첨가군의 알코올 생성량은 5.35%

로 모든 시료 중에서 알코올 생성량이 가장 많았으며, 1.0%

첨가군에서는 1.75%의 알코올이 생성되어 가장 낮은 함량 이었다.

발효에서 알코올 생성속도는 여러 인자의 영향을 받는데, Jo 등(22)은 보당을 위한 부재료로 설탕, 꿀, 포도당을 첨가 하였을 때는 알코올 함량에 큰 차이가 없으나 과당과 프락토 올리고당을 사용하였을 때는 알코올 함량이 약 1% 정도 더 낮아 첨가한 당이 영향을 미침을 보고한 바 있다. 과실주 제조 시 초기 당도를 동일하게 하였을 때 원료에 따라서 알 코올 함량은 10.4~13.2%로 서로 상이하여 원료가 알코올 함량에 영향을 미친다는 보고(23)도 있다. 본 연구의 결과에 서 알코올 발효 전 유산균 발효가 완료된 시료의 고형분 함 량은 16.23~16.73 brix, 환원당의 함량은 13.26~14.49 g/100 mL의 범위로 시료 간의 차이가 크지 않아(data not shown), 탄소원으로 작용한 당의 영향보다는 유산균 발효 에 영향을 미치는 MSG의 첨가 정도가 알코올의 생성속도나 최종 생성량에 영향을 미치는 주된 인자인 것으로 추정된다.

한편 초산 발효에서는 초기 알코올 함량이 균의 생육과 밀접한 상관성을 가지는데 알코올 함량이 높을 경우 균의 생육을 느리게 하여 유도기를 길게 만들고, 산 생성능을 떨 어뜨리지만 적정한 알코올 농도는 초기의 빠른 산 증가와 더불어 pH 감소를 통해 잡균의 번식을 억제하는 효과를 나 타내므로 5~7% 정도가 적절한 것으로 보고되어 있는데 (24), 본 연구의 결과에서는 6일 정도 알코올 발효를 실시함 으로써 초산 발효에 적절한 알코올이 생성되었다.

초산 발효 중 pH의 변화

20일간 초산 발효 동안 4일 간격으로 시료를 취하여 pH 변화를 분석한 결과(Table 3) 발효 초기의 변화 양상은 시료 에 따라 다소 차이가 있었으나 발효기간의 경과와 더불어 점차 낮아지는 경향이었다. 즉 MSG 0.25%와 0.5% 첨가군, 대조군의 경우 발효 전보다 발효 4일에 pH가 미량 증가하였

다가 감소하였으나 여타 실험군에서는 이러한 변화 없이 지 속해서 감소하는 경향이었다. 발효 초기 3.32~3.51이던 pH 는 발효 20일 후 2.61~3.26으로 감소하였는데, MSG 무첨 가군과 0.25 및 0.5% 첨가군보다 MSG 1% 첨가군, 대조군 및 양성대조군의 pH가 유의적으로 더 낮았다.

흑마늘의 첨가량을 달리하여 제조한 식초에서 pH는 알코 올 발효 직후에는 4.47~4.56의 범위로 흑마늘의 첨가량에 따른 차이가 없었으나 초산 발효가 진행되면서 점차 감소하 여 발효 완료 후에는 3.66~3.81의 범위였는데, 이는 초산 발효가 진행됨에 따라 생성된 유기산의 양이 증가하기 때문 이라는 보고(25)가 본 연구의 결과와도 일치하는 경향이었 다. 하지만 pH 범위의 절대 값에는 차이가 있었는데, 이는 오미자를 소재로 하여 여러 조건에서 식초를 발효하면서 pH 와 산도의 변화를 분석한 결과에 따르면 발효균주, 초기 알 코올 함량, 종초의 투입량, 오미자 추출액의 농도에 따라 각 기 상이한 변화의 양상을 보인다는 보고(26)로 미루어 볼 때 발효 조건이 서로 상이하기 때문으로 생각된다.

초산 발효 중 산도의 변화

알코올 발효를 거쳐 4.21~6.95%의 알코올을 함유하는 발효물을 초산 발효시키면서 산도의 변화를 분석한 결과 (Table 4) pH와 상반되는 양상을 보여 발효 초기 0.42~

1.41%이던 것이 발효 4일까지는 발효 전에 비해 큰 차이가 없었으나 발효 8일에 1.7~2.9배 정도 급격히 증가하여 2.52

~4.67%였다. 모든 시료에서 산도는 발효기간의 경과와 더 불어 점차 증가하여 발효 20일에는 4.88~6.17%의 범위였 다.

식초에서 산도는 중요한 품질 지표 중의 하나로 그 산도에 따라 4~5%는 저산도, 6~7%는 일반산도, 12~14%는 2배 산도, 18~19%는 3배 산도로 구분하고 있는데(27), 이 기준 으로 볼 때 본 연구의 결과에서 생산된 식초의 산도는 4.88

~6.17%로 저산도 또는 일반산도 식초에 해당하였다.

주정의 첨가 여부에 따라 구분한 시판 현미 식초의 산도는 주정 무첨가 발효 현미식초에서 5.62~6.85%의 범위로 제 조사에 따라 값의 차이가 있었지만 주정을 첨가하여 발효하

(6)

Table 4. Changes in acidity during acetic acid fermentation of sikhye prepared with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different ratio of MSG (%)

Fermentation day

0 4 8 12 16 20

1.06±0.01^cA 1.61±0.01^cB 3.35±0.05^cC 4.02±0.10^bD 4.55±0.14^aE 4.88±0.01^aF

1.06±0.01^cA 1.50±0.06^bB 2.52±0.04^aC 4.69±0.02^cD 5.56±0.12^cE 5.65±0.24^cE

1.22±0.02^dA 1.95±0.03êB 3.73±0.15^dC 3.87±0.01âC 4.38±0.17âD 4.99±0.03âE

1.41±0.01êA 1.83±0.02^dB 4.67±0.03êC 6.00±0.03êD 6.08±0.03êE 6.17±0.01^dF

0.72±0.00^bA 1.63±0.01^cB 3.31±0.03^cC 4.97±0.01^dD 5.10±0.01^bE 5.44±0.03^bF

0.42±0.03^aA 0.92±0.01^aB 2.70±0.05^bC 4.98±0.04^dD 5.87±0.01^dE 5.98±0.07^dF Control: sikhye added with seomaeyaksuk extract that was not performed lactic acid fermentation.

Means with different small letters (a-e) in the same row are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Means with different capital letters (A-F)in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

였을 때는 6.22~6.44%로 차이가 적었는데, 현미식초는 현 미의 첨가량이 높을수록 총 산도가 높아지므로 현미의 배합 비, 제조법 및 최종 제품의 희석도 등이 영향을 미치기 때문 에 동일 식초라도 총 산도는 차이가 있다고 보고되어 있다 (28). 본 연구 결과에서는 유산균 발효공정의 유무와 첨가되 는 MSG 함량에 따른 초기 산도의 차이가 발효 동안의 산도 변화에 영향을 미친 것으로 생각된다.

초산 발효 중 유기산의 변화

Table 5는 초산 발효기간 동안 유기산의 함량을 분석한 결과이다. 유기산은 총 7종이 검출되었는데, 이 중 acetic acid가 발효기간 동안 가장 큰 증가를 보였고, 다음으로 succinic acid였다. Acetic acid는 식초의 주된 산으로써 식 초에 신맛을 제공하게 되는데, 발효 초기 296.70~886.62 mg/100 mL이던 것이 대부분의 시료에서 발효 12일까지 급격히 증가하여 2,619.73~4,521.29 mg/100 mL였고, 그 이후부터는 완만하게 증가하였다. 발효가 완료된 20일에 acetic acid의 함량은 3,377.00~5,472.52 mg/100 mL였 으며, 다음으로 함량이 높았던 succinic acid의 경우 대조군 과 MSG 0.25% 및 0.5% 첨가군에서는 발효기간의 경과와 더불어 감소하는 경향을 보였다.

유기산 중 acetic acid, succinic acid 및 oxalic acid는 발효기간 동안 모든 시료에서 검출되었으나 여타 유기산은 일부 시료에서는 검출되지 않았고, lactic acid의 경우 일부 시료에서는 발효기간의 경과와 더불어 그 함량이 감소하다 가 일정기간 이후부터는 불검출되는 경향을 보였다. MSG 1.0% 첨가군과 양성대조군에서는 다른 시료들에 비해 검출 된 유기산의 수도 적었는데 MSG 1.0% 첨가군에서 lactic acid는 발효 8일 이후에는 검출되지 않았으며, 양성대조군 에서는 발효초기부터 검출되지 않았다.

식초 발효 시 유기산은 원료 중에 다량 함유되어 있던 유 기산의 함량이 감소하거나 소실되기도 하고 그 함량이 월등 히 증가하기도 하는데, Lee 등(29)은 식초 발효 시 acetic acid가 대부분을 차지하고 있고 다음으로 malic acid의 함 량이 높으며, citric acid의 함량은 증가하지만 lactic acid와

succinic acid의 함량은 감소하고 일부 유기산은 감소하다 가 다시 증가하는 등 뚜렷한 경향을 보이지 않았다고 보고한 바 있다. 쌀과 해당화를 이용한 식초에서는 malic acid, lactic acid, formic acid 및 acetic acid가 검출되는데, acetic acid보다 lactic acid의 함량이 더 높으며 malic acid는 일부 시료에서 거의 변화가 없다가 발효 말기에는 검출되지 않으 며, formic acid는 발효 말기에만 검출되는 시료가 있다고 보고되어 있다(30). 본 연구의 결과도 이들 보고와 동일한 경향으로 유기산의 함량이나 검출되는 종류 및 발효기간에 따른 함량의 변화에 차이가 있었는데, 이는 쑥 추출물의 첨 가 여부, MSG의 첨가 농도 및 유산균 발효 여부가 당화와 3단계의 발효 과정 중에 복합적으로 영향을 미쳤기 때문으 로 생각된다.

식초에는 acetic acid를 포함한 citric acid, succinic acid, lactic acid, tartaric acid 등 당 분해 과정인 TCA cycle에서 볼 수 있는 대부분의 유기산이 함유되어 있어 생 체 조직 내에서 호기적으로 쉽게 분해 가능하며, 생리적 상 태에 따라 필요한 물질로 쉽게 전환될 수 있어 생체의 균형 을 유지하는 데 도움이 되는 장점이 있다(25). 이러한 점을 고려할 때 MSG 1.0% 첨가군이나 양성대조군에 비해 다양 한 유기산이 검출된 여타 시료들의 맛이 더 풍부하고, 더 높은 기능성을 기대할 수 있을 것으로 추측된다.

초산 발효 중 GABA의 변화

20일간 초산 발효한 식초 중의 GABA 함량을 분석한 결과 는 Table 6과 같다. 유산균 발효 후 47.50~354.38 mg/L이 던 GABA 함량은 알코올 발효를 거치면서 그 함량이 더 증 가하여 알코올 발효가 완료된 초산 발효 0일차에는 238.12

~605.63 mg/L였다. 이는 유산균 발효 종료 후 GABA 함량 보다 약 1.7~5.0배가 더 증가한 양이었으며, MSG의 첨가 비율이 높을수록 GABA 함량이 더 높았다.

20일간의 초산 발효 완료 후 MSG 무첨가군에서는 3.96 mg/L의 GABA가 검출되었으며, MSG의 첨가량이 증가함 에 따라 그 함량은 유의적으로 증가하였다. MSG 0.5% 첨가 군의 GABA 함량은 45.83 mg/L로 MSG 0.25% 첨가군보다

(7)

(8)

Table 6. Changes in GABA contents during acetic acid fermentation of sikhye prepared with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different ratio of MSG (mg/L)

Fermentation day MSG addition ratio (%)

0 0.25 0.5 1

0 4 8 12 16 20

238.12±9.92âF 180.62±7.23âE 101.25±5.21âD 31.88±3.12âC 14.38±1.25âB 3.96±0.95âA

485.94±11.21^bF 455.94±10.11^bE 392.81±8.87^bD 242.19±6.21^bC 145.94±4.30^bB 25.63±0.54^bA

562.19±13.21^cF 478.13±14.62^cE 424.38±12.14^cD 343.75±7.47^cC 210.31±5.13^cB 45.83±2.19^cA

605.63±11.23^dF 526.25±15.02^dE 482.50±13.55^dD 375.00±10.21^dC 246.25±8.95^dB 56.54±0.51^dA Control: sikhye added with seomaeyaksuk extract that was not performed lactic acid fermentation.

Means with different small letters (a-d) in the same row are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Means with different capital letters (A-F) in the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

A A

AB

B B B

0 10 20 30 40 50

0 0.25 0.5 1.0 Control Positive Control MSG added ratio (%)

Total pheonlic compounds . (mg/g, GAE) .

Fig. 1. Total polyphenol compounds contents of 20 days acetic acid fermented sikhye prepared with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different ratio of MSG. GAE: gallic acid equivalents. Control: sikhye added with seomaeyaksuk extract that was not performed lactic acid fermentation. Positive control: sikhye not added with seomaeyaksuk extract that was fermented by lactic acid bacteria (LABGA86). Means with different letters (A,B) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

B B B B

A A

0 20 40 60 80 100

0 0.25 0.5 1.0 Control Positive Control MSG added ratio (%)

DPPH radical scavenging . activiy (%) .

Fig. 2. DPPH radical scavenging activity of 20 days acetic acid fermented sikhye prepared with seomaeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract and different ratio of MSG. Control: sikhye added with seomaeyaksuk extract that was not performed lactic acid fermentation. Positive control: sikhye not added with seomaeyaksuk extract that was fermented by lactic acid bacteria (LABGA 86). Means with different letters (A,B) above the bars are sig- nificantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

약 1.8배 더 높았고, MSG 1.0% 첨가군에서는 56.54 mg/L 로 정량되어 0.5% 첨가군보다 약 1.2배 더 높은 함량이었다.

이처럼 MSG의 첨가 비율이 높아지면서 GABA의 함량이 증가하지만 MSG 첨가 농도에 비례하여 그 양이 증가하지는 않았고 유산균 발효와 알코올 발효를 거치는 동안 증가한 GABA 함량은 초산 발효 과정 중에는 지속해서 감소하는 경향을 나타내었다. 초산 발효 전에 비해 초산 발효가 완료 된 후 남아있는 GABA의 잔존율을 산출해 보면 MSG 무첨 가군은 8.34%, MSG 0.25, 0.5 및 1.0% 첨가군은 각각 12.8, 17.62 및 15.96%로 MSG 0.5% 첨가군에서 가장 잔 존율이 높았다.

초산 발효에서 유리아미노산의 함량은 원료 중에 있던 것 이 발효 과정을 거치면서 38~60% 정도가 소모되어 감소하 는데 아미노산 중 glutamic acid, aspartic acid, proline의 감소가 특히 크다는 보고로 미루어 볼 때(31), 본 연구의 결과에서 발효기간의 경과와 더불어 GABA 함량이 감소한 것도 발효 과정을 통해 아미노산의 함량이 감소하였기 때문 으로 추정된다.

Na 등(32)은 식초 중에 GABA 함량이 비교적 높은 것으 로 알려진 감식초는 22.27 mg/kg, 무화과식초는 27.22 mg/kg이 검출되어 기능성이 풍부한 식초로의 활용 가능성 을 제안한 바 있다. 본 연구의 결과에서 최종발효 완료된 식초 중의 GABA 함량은 MSG 0.25% 이상을 첨가함으로써 이들의 연구 결과와 유사한 함량을 나타내었다. 유산균 발효 를 통해 증가한 GABA 함량이 초산 발효를 거치면서 감소하 는 경향을 나타내었으나 MSG의 적정 첨가를 통해 발효 과 정에서 감소하고도 일정 수준의 GABA가 잔존하도록 하는 것이 가능함을 확인하였으며, 쑥 식초 자체의 기능성과 더불 어 GABA를 통해 기능성 또한 강화될 것으로 기대된다.

초산 발효물의 총 페놀화합물 함량 및 DPPH 라디칼 소거 활성

식혜 제조를 위한 당화와 유산균 발효, 알코올 발효 및 초산 발효를 순차적으로 거쳐서 발효 완료된 쑥 식초 중의 총 페놀화합물 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 분석한 결과는

(9)

각각 Fig. 1 및 2와 같다.

MSG 첨가 비율을 달리하여 제조한 쑥 식초의 총 페놀화 합물 함량은 MSG 무첨가군과 0.25 및 0.5% 첨가군 간에는 32.85~36.20 mg GAE/g으로 유의적인 차이가 없었으며, MSG 1% 첨가군과 대조군, 양성대조군은 38.53~38.90 mg GAE/g으로 서로 유의적인 차이가 없었다.

DPPH 라디칼 소거 활성(Fig. 2)의 경우 MSG 무첨가군과 0.25% 첨가군은 각각 72.98%와 72.16%로 유의적인 차이 가 없었으며, 이들을 제외한 다른 실험군들은 85.39~87.79

%의 범위로 서로 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

이러한 결과는 총 페놀화합물의 함량과 유사한 경향으로 페 놀화합물이 높은 시료에서 DPPH 라디칼 소거 활성도 더 높았다.

페놀화합물의 함량과 DPPH 라디칼 소거 활성은 비례관 계를 나타내는데, 식초의 경우 발효를 통해 총 페놀화합물의 함량이 감소한 경우에도 항산화력은 큰 변화를 보이지 않는 데 이는 caffeic acid나 chlorogenic acid와 같은 페놀산의 항산화력 차이와 유기산과 같이 발효를 통해 증가한 성분들 의 함께 영향을 미치기 때문이라고 보고되어 있다(29).

요 약

섬애약쑥 추출물을 이용하여 식초를 제조함에 있어 γ- aminobutyric acid(GABA)의 함량을 증대시킬 수 있는 발 효조건을 확립하고자 섬애약쑥 추출물을 첨가하여 제조한 식혜를 발효원으로 하고, MSG를 첨가하여 유산균 발효, 알 코올 발효 및 초산 발효를 차례로 진행하여 식초를 제조하였 다. 섬애약쑥 물 추출물이 15% 첨가된 쑥 식혜에 MSG를 0, 0.25, 0.5 및 1.0% 첨가하고, 김치로부터 분리 동정한 GABA 함량 증대 효과가 있는 유산균인 Lactobacillus brevis(KI271266)를 접종하여 3일간 발효하였다. MSG의 첨 가 농도가 높을수록 GABA의 함량도 높았으며, 발효기간이 경과할수록 그 함량도 증가하여 3일간의 발효 완료 후 MSG 1.0% 첨가군에서는 354.38 mg/L로 가장 높은 함량이었다.

유산균 발효물에 종 배양한 Saccharomyces cerevisiae를 5% 접종하여 6일간 정치배양 하였으며, 알코올 발효 후 초 산균을 접종하여 20일간 정치발효 시키면서 4일 간격으로 시료를 취하여 이화학적 특성 변화를 분석하였다. 초산 발효 동안 pH는 점차 감소하여 발효 20일 후에 2.61~3.26의 범 위였고, 이와 상반되게 산도는 점차 증가하여 4.88~6.17%

였다. 유기산은 총 7종이 검출되었는데 acetic acid의 함량 이 가장 큰 폭으로 증가하였고, 다음으로 succinic acid가 함량도 높고 발효기간 동안 증가율도 높았다. 초산 발효 동 안 GABA 함량은 점차 감소하는 경향이었는데, 발효 20일 에 MSG 무첨가군보다 0.25% 첨가군에서는 약 6.5배, 1.0%

첨가군에서는 약 14배 더 높은 함량이었다. 발효 완료된 식 초의 총 페놀화합물 함량은 MSG 0~0.5% 첨가군보다 1.0%

첨가군에서 더 높았으며, 이들 시료에서 DPPH 라디칼 소거

활성도 더 높았다. 이상의 결과로 보아 3단계 연속발효를 거쳐 GABA 함량이 높은 섬애약쑥 식초를 제조할 수 있었으 며, 이러한 과정을 거쳐 제조된 식초는 식초 자체의 활성, 쑥 자체에 함유되어 있던 유효성분 및 발효 과정에서 새로이 생성된 성분들이 복합적으로 작용하여 생리활성이 더 우수 할 것으로 기대된다.

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