서
론
인간의 피부색은 멜라닌 및 카로틴과 같은 색소 성분 과 혈관의 분포, 각질층의 두께 등에 의해서 결정된다. 피부 표피 기저층의 melanocyte에서 합성 되는 멜라닌 은 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소로 자외선을 차 단하는 기능을 갖고 있지만 이것이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 멜라닌 생성에 이상이 발생하면 melasma,freckle 및 hyperpigmentation을 유발하게 된다 (Curto et al. 1999). 최근에는 tyrosinase뿐만 아니라 tyrosinase relat-ed protein-1 (TRP-1), tyrosinase relatrelat-ed protein-2 (TRP-2) 등과 같은 단백질을 이용하여 멜라닌 합성 억제에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다 (Parvze et al. 2006). 현재 산업적으로 주로 사용되는 미백 원료는 Arbutin, Kojic acid, Vitiamin C 등의 물질이 대표적이고 천연물로 는 상백피, 닥나무, 감초 등의 식물 추출물이 널리 알려 져 있다 (Park et al. 2009). 글루칸은 알파글루칸과 베타글루칸으로 분류되며, 알 파글루칸은 일반적으로 식물의 전분에 존재하고, 베타글 ─ ─ 233 ──
감마선 조사가 베타글루칸의 미백활성에 미치는 영향
김재훈∙성낙윤∙정필문∙송범석∙최종일∙변의홍1∙김진규∙이주운* 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소, 1충남대학교 의학과Effect of Gamma-Irradiation on the Whitening Activity
of
β-Glucan
Jae-Hun Kim, Nak-Yun Sung, Pil-Moon Jung, Beom-Seok Song, Jong-il Choi, Eui-Hong Byun1, Jin-Kyu Kim and Ju-Woon Lee*
Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea
1Department of Microbiology, College of Medicine, Chungnam National University,
Daejeon 301-747, Korea
Abstract-- This study evaluated the change in whitening activity of ββ-glucan by gamma-irradiation. Tyrosinase inhibition was significantly increased in the samples with 30, 50, 100 kGy irradiated ββ-glucan. Melanin synthesis of irradiated ββ-glucan was measured from B16BL6 melanoma cell line treated with αα-melanin stimulating hormone. Melanin synthesis was increased in the αα-melanin stimulating hormone added group. However, it was decreased in the groups of 30, 50 and 100 kGy gamma-irradiated ββ-glucan treated with αα-melanin stimulating hormone. These results indicate that gamma irradiated ββ-glucan may elevate the whitening activity. Therefore, gamma-irradiated ββ-glucan could be used for nutraceutical foods in cosmetic industry.
Key words : ββ-glucan, Gamma irradiation, Whitening activity, Tyrosinase, Melanin synthesis
* Corresponding authors: Ju-Woon Lee, Tel. +82-42-570-3204, Fax. +82-42-570-3207, E-mail. [email protected]
루칸은 곡물, 버섯, 및 효모의 세포벽 내에 존재하는 것 으로 알려져 있다. 베타글루칸은 알파글루칸과 다르게 비특이적 면역반응을 나타내어 소화기관 내에 흡수시 체 내 면역기능을 획기적으로 증진시키는 것으로 알려져 있 고, 베타글루칸의 주요한 의학적인 효능은 면역기능을 강화시키는 것으로, 천연 면역조절제로서 주목받고 있으 며, 현재 항암, 항알레르기, 항균, 항바이러스, 항응고, 상 처치유, 미백활성 등의 많은 연구 결과들이 보고되어 지 고 있다 (Reynolds et al. 1980; DiLuzio 1983). 또한 선진국 에서는 화장품, 면역활성 및 항암 보조제, 피부 재생을 위한 치료제, 식이섬유나 식품 첨가제 등 다양한 분야에 서 베타글루칸이 응용되고 있다 (Dziezak 1987; Donizis 1996). 이러한 베타글루칸의 효능은, 분자량 및 분지도 그리고 이와 연관된 분자구조와 관련이 있는 것으로 알 려져 있다 (Browder et al. 1987). 그러나, 생물체에서 추출 되거나 세포 외로 생산되는 천연 베타글루칸은 대부분은 약리적으로 최적인 분지도, 분자량 조건을 충분히 충족 시키지 못하고 있다 (Shin and Lee 2003). 따라서 저분자 베타글루칸을 제조하기 위한 많은 연구들이 현재 진행되 고 있다. 그중 Byun 등 (Byun et al. 2008)의 연구에 따르 면 감마선의 조사는 베타글루칸을 효과적으로 저분자화 시키고, 점도의 감소와 용해도를 증가시킨다고 보고되고 있다. 또한 감마선이 조사된 베타글루칸은 대식세포 및 비장세포 등의 면역세포를 활성화시키는 능력이 증가하 는 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 다양한 연구에 도 불구하고 감마선이 조사된 베타글루칸의 미백활성에 관한 연구는 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 감 마선 조사된 베타글루칸의 미백활성의 변화에 관하여 알 아보았다.
재료 및 방법
1. 베타글루칸의 제조 및 감마선 조사본 실험에 사용한 베타글루칸은 Black Yeast
(Aureoba-sidium sp.)에서 분리된 총 다당류와 베타글루칸 함량이
각각 97.2%과 80% 이상인 것을 ACE BIOTECH (Repu-blic of Korea)에서 제공받아 이용하였다. 분말형태의 베 타글루칸을 100 mg ml-1(10%, w/v)의 농도로 증류수에
용해하여 감마선 조사를 실시하였다. 감마선의 조사는 한국원자력연구원 방사선과학연구소 (Jeongeup, Republic of Korea)내 선원 11.1 PBq, 60Co 감마선 조사시설 (point
source AECL, IR-79, MDS Nordion International Co. Ltd., Ottawa,ON, Canada)을 이용하여 실온 (22±1�C)에서 시
간당 10 kGy의 선량률로 각각 10, 30, 50, 100 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 흡수선량의 확인은 alanine dosimeter (5 mm, Bruker Instruments, Rheinstetten, Ger-many)를 사용하였다. 조사된 베타글루칸 용액은 4�C 냉 장상태로 보관하며 실험에 사용 하였다.
2. Tyrosinase 억제 활성 측정
Tyrosinase 활성 억제능은 tyrosinase의 작용 결과 생 성되는 dopachrome을 비색법을 이용하여 측정하였다 (Flurkey 1991). Sigma 사에서 구입한 효소액 (mushroom tyrosinase, 100 unit m1-1)을 0.2 ml, 기질로서 L-DOPA 0.4
ml, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8) 0.2 ml의 혼
합액에 시료 0.2 ml을 첨가한 후 37�C에서 15분간 반응 시켜 475 nm에서 측정하고 dopachrome의 변화를 저해능 으로 환산하였다. Tyrosinase 저해능은 다음의 환산식에 의하여 계산되었다. A-C 저해능 (%)==·1-mmmmmm ‚×100 B A: 효소액을 첨가한 시료처리구 B: 효소액을 첨가하지 않은 시료처리구 C: 효소액 대신 증류수를 첨가한 흡광도 3. 세포배양
B16BL6 melanoma 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin, streptomysin (100 IU ml-1, 100μg ml-1)을 함유
한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 용액으 로 37�C로 유지되는 5% CO2배양기에서 배양하였다.
4. 세포독성평가
감마선 조사된 베타글루칸의 세포독성에 관하여 알아 보기 위하여 마우스 유래의 melanocyte인 B16BL6 cell line을 한국 세포주 은행 (KCLB, Republic of Korea)으로 부터 구입하여 사용하였다. 세포주에 대한 세포독성은 각각의 세포주를 1×104cells well-1씩 96 well plate에 90
μl씩 분주하고 0에서 100 kGy로 감마선 조사된 베타글 루칸을 62.5, 125, 250, 500μg ml-1의 농도로 처리하여 37�C, 5% CO2조건하에서 72시간 동안 배양하여 MTT 분석을 통해 감마선 조사된 베타글루칸의 세포 독성을 산출하였다. MTT assay는 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide용액 (5 mg ml-1)를 30μl 씩 첨가하고 2시간 동안 배양한 후 배양 상등액를 제거하 고 생성된 formazan crystal을 dimethyl sulfoxide (DMSO)
에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5. Melanin 생성 억제능 측정
B16BL6 세포를 이용한 melanin 생성 억제능 측정 시
phenol red가 없는 DMEM을 사용하여 6 well plate에 3× 104cells ml-1로 분주하고 2시간이 지난 뒤 세포가 plate 에 완전히 부착된 것을 확인한 후 0에서 100 kGy로 감
마선 조사된 베타글루칸을 500μg ml-1의 농도로 처리하
였다. 12시간 후 melanin 생성을 촉진하기 위하여 1μM
α-melanocyte stimulating hormone (MSH, Sigma)를 처리 하여 melanin 생성 반응을 촉진시켰다. 72시간 배양이 끝 나면 1% Triton X-100 (Sigma)을 함유한 10 mM phosphate buffer (pH 6.8)를 100μl를 가하고 5분간 교반한 후 원심 분리하여 cell pellet을 멜라닌 정량에 사용하였다. 분리 된 pellet을 1N NaOH 100μl와 증류수 200 μl를 가하고 60�C에서 1시간 반응하여 완전히 녹인 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준물질(Sigma)로 얻은 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산 출하였다. 멜라닌 생성량은 표준물질 대비 μg ml-1로 표 기하였다 (Park et al. 2004). 6. 통계처리
이상의 실험에서 얻어진 결과는 Statistical Package for Social Sciences (SPSS, 10.0)를 이용하여 One Way ANOVA
test로 분석하였으며, 시료간의 유의성은 Duncan’s multi-ple range test로 p⁄0.05 수준에서 비교하였다.
결과 및 고찰
1. 감마선 조사된 베타글루칸의 Tyrosinase 억제 활성
Tyrosinase는 피부 기저층에 있는 melanocyte의 mela-nosome에서 tyrosine 혹은 DOPA (dihydroxyphenylala-nine)를 기질로 하여 피부의 색소 성분인 melanin을 생 합성하는 데 있어서 key enzyme으로 작용하는 효소이다 (Yang et al. 2008). 조사선량별 베타글루칸의 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 조사선 량별 베타글루칸의 tyrosinase 저해능은 각각의 처리농도 (250, 500μg ml-1)에서 30 kGy 이상의 선량에서 유의적
(p⁄0.05)으로 증가하였고, 30 kGy, 50 kGy 및 100 kGy 그 룹들 사이에서는 유의적인 변화를 나타내지 않았다. Byun 등 (Byun et al. 2008)의 연구에 의하면 감마선의 조사는 당과 당 사이를 연결하는 Glycosidic bond를 절단함으로 써 베타글루칸의 분자량을 유의적으로 감소시킨다고 보 고하고 있다. 또한 베타글루칸의 약리학적인 효능은 분 자량 및 분지도 그리고 이와 연관된 3차원적인 분자구 조에 따라서 다양한 차이를 보인다고 보고하고 있다 (Browder et al. 1987). 따라서 본 연구결과에서도 감마선 의 선량에 따른 Tyrosinase의 억제 활성이 변하는 것은 감마선 조사에 따른 베타글루칸의 물리적인 변화와 밀 접한 연관이 있다고 사료된다.
2. B16BL6 melanoma cell을 이용한 melanin 생성 억제능
세포내 멜라닌의 합성은 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), cyc-lic adenosine monophosphate (cAMP), adrenocorticotropic hormone (ACTH), forskolin 및 α-melanocyte stimulating hormone (MSH) 등의 다양한 인자들에 의해서 조절된 다 (Creiner et al. 1973; Busca and Ballotti 2000). 그 중
α-MSH를 처리하여 melanin 형성을 촉진시키는 melano-genesis 과정을 이용하는 방법이 대표적으로 사용된다. Fig. 2는 melanin 생성 억제능 평가에 앞서 감마선 조사 된 베타글루칸의 B16BL6 세포에 대한 세포독성을 평가 하여 나타내었다. Melanin 생성 억제능 평가에서와 같이 72시간 배양 후 세포독성을 관찰한 결과 62.5, 125, 250, 500μg ml-1의 농도에 대하여 감마선 조사된 베타글루칸 의 세포독성이 관찰되지 않았다. 따라서 Melanin 생성 억제능 평가 실험에서 감마선 조사 및 비조사된 베타글 루칸의 농도를 500μg ml-1로 고정하여 평가하였다. 감마 선 조사구 및 비조사구에 대한 melanin 생성 억제 측정 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 무처리군(non-treated group)
에 비하여α-MSH 처리군에서 melanin의 농도가 유의적
(p⁄0.05)으로 증가한 것으로 보아 α-MSH에 의한 mela-Fig. 1. Tyrosinase inhibition activity of gamma irradiated (10, 30,
50, 100 kGy) and non irradiated (0 kGy) β-Glucan. a-bValues with different letters differ significantly (p⁄0.05) at the concentration of 250μg ml-1. A-BValues with different letters differ significantly (p⁄0.05) at the concentration of 500μg ml-1. 40 30 20 10 0 b b a a a B B A A A 0 10 30 50 100 0 10 30 50 100
Irradiation dose (kGy)
Tyrosinase inhibition activity
(%) Concentration at 250μg ml-1 Concentration at 500μg ml-1
nogenesis가 성공적으로 유도되었음을 보여준다. 또한 양성대조구로 사용한 kojic acid 처리그룹에서 melanin 농 도가 유의적으로 감소하는 것이 관찰되었으며, 베타글루 칸의 조사 선량에 따른 melanin 생성 억제 효과는 30 kGy에서 나타나기 시작하여 100 kGy 처리구에서 가장 높은 억제 효과를 나타내었다. Sung et al. (2009)의 연구 에 의하면 감마선 조사 기술을 이용하여 제조한 저분자 베타글루칸의 처리는 비조사구인 고분자 베타글루칸보 다 대식세포, 비장세포 및 장관 면역세포인 peyer’s patch 등의 면역세포 활성화시키는 능력이 뛰어난 것으로 보 고하고 있다. 또한 Kim et al. (2009)의 연구에 의하면 방 사선 조사된 저분자 베타글루칸을 마우스에 일정기간 동안 투여하였을 때 면역활성이 증가되고, Earvin et al. (2002)은 인공장막을 통한 연구에서 작은 분자량의 물질 은 세포내 흡수가 빨라 빠른 효과를 기대할 수 있다고 보고하였다. 이러한 결과로 미루어 보아 melanin 생성 억 제능이 감마선 조사구인 100 kGy에서 최대로 증가한 것 은 감마선 조사에 의한 분자량의 감소에 따른 영향이라 고 사료된다.
결
론
감마선 조사에 따른 베타글루칸의 미백활성 변화를 분석한 결과, 감마선 조사된 베타글루칸은 tyrosinase 활 성 저하 및 세포내 melanin 생성 억제 효과가 증가하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 감마선 조사에 의한 베타글루칸의 물리적인 변화의 원인으로 사료되며, 특히 감마선 조사에 따른 분자량 감소가 주된 역할을 한 것이 라고 판단된다. 따라서 감마선 조사 기술은 미백효과가 증가된 저분자 베타글루칸 생산을 위한 효과적인 방법이 라고 사료된다.사
사
본 연구는 한국원자력연구원 기본사업 및 교육과학기 술부 원자력연구개발사업을 통해 수행되었으며, 그 지원 에 감사드립니다.참 고 문 헌
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Fig. 3. Inhibitory effect of melanin synthesis by gamma irradiated (10, 30, 50, 100 kGy) and non irradiated (0 kGy) β-glucan treatment in B16BL6 melanoma cell treated with α-MSH. 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Normal α-MSH Kojic acid 0 kGy 10 kGy 30 kGy 50 kGy 100 kGy Melanin concentration (μ g ml -1) α-MSH (1 μM) with sample (500 μg ml-1) a f e b b c c d
Fig. 2. Cell survival (%) in B16BL6 melanoma cell line treated with gamma irradiated (10, 30, 50, 100 kGy) and non irradiated (0 kGy) β-Glucan. 120 100 80 Non-treated 62.5 125 250 500 β-Glucan concentration (μg ml-1) B16BL6 survival (%) 0 kGy 10 kGy 30 kGy 50 kGy 100 kGy
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Manuscript Received: August 24, 2010 Revision Accepted: August 30, 2010
