환경시료 내 핵산을 이용한 박테리아 측정 바이오센서 동향
원 지 영⋅민 준 홍*,†
서강대학교 화공생명공학과, *경원대학교 바이오나노대학
Nucleic Acid Biosensors for the Detection of Bacteria in Environmental Samples
Ji Yeong Won and Junhong Min*,†
Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Sogang University
*College of Bionano Technology, Kyungwon University
Abstract: 바이오물질 수용장치와 신호 변환장치로 구성된 바이오센서는 분석하고자 하는 물질을 인식 가능한 신호로 변환하여 그 신호를 감지하는 장치로써 복잡한 물질의 분석을 항체나 핵산을 이용하여, 보다 더 선택적으로 검출할 수 있게 한다. 박테리아를 측정하는 경우에도 핵산 및 단백질을 이용한 다양한 분석방법이 개발되어 왔고, 바이오센서 에 대한 수요가 가장 많은 의료분야 뿐만 아니라 환경분야에서도 신속하고 효율적으로 측정해야 하는 필요성이 대두 되고 있다. 최근에는 환경호르몬, 폐수의 중금속, 음용수나 환경식수의 박테리아 진단을 위한 센서의 개발이 진행되면 서 바이오센서의 비중이 점차적으로 늘고 있는 실정이다. 따라서 본 고에서는 핵산을 이용하여 다양한 환경시료에서 박테리아를 측정하는 방법에 대해서 논의하고자 한다.
Keywords: bacteria detection, RNA, amplification, Bacteria adsorption, biosensor
1. 서 론
1)
외부로부터 받은 화학적/물리적 자극을 감지할 수 있는 생명소자를 개발하기 위한 연구가 끊임없 이 진행되어 오면서 목적하는 물질의 존재 유무 또는 농도 등을 비례적으로 감지하고 전기적 신호 로 변환하여 수치화 하는 센서가 개발되었다[1].
바이오센서는 효소, 미생물, 동식물의 조직 등 생물이 가지고 있는 기능을 이용하여 물질의 상태 와 농도를 측정하는 생물학적 분석장치로써, 측정 하고자 하는 대상을 인식하는 바이오물질 수용장 치와 인식된 대상을 물리적으로 측정 가능한 신호 로 변환하여 진단하는 신호 변환장치로 구성된다 [2]. 바이오물질 수용장치는 효소, 항체, nucleic acid, cell 등이 대표적이며, 신호변환방법으로 형 광, SPR, QCM, 전기화학적 방법, 기계적 방법 등 이 있다[3].
† 주저자 (E-mail: [email protected])
바이오센서 전체 시장의 80%를 차지하고 있는 혈당 센서는 혈액 내에서 산화 효소 반응에 의해 생기는 글루코스의 전기화학적 신호를 감지/측정 하는 효소를 이용한 센서의 대표적인 예이다.
최근에는 다양한 항체를 이용한 면역센서를 개 발하는 연구가 진행되어 혈액시료 내에 다양한 물 질을 측정할 수 있는 센서들이 개발되었다[4].
이러한 바이오센서는 마이크로어레이 형태로 개발이 진행되면서, 다양한 기술들이 개발되었다.
마이크로어레이는 대상 유전자나 단백질을 감지 하기 위하여 수천 혹은 수만개 이상의 DNA나 단 백질과 같은 생물 분자를 어레이 형태로 칩에 배 열, 부착하여 분석 대상물질과의 결합양상을 분석 하는 센서이다[5]. 탐침이나, 효소, 항체 등의 단백 질, 또는 그 이외의 리간드를 고체 표면에 고밀도 로 결합된 칩이 개발되면서, 표면물질과 특이적으 로 상호작용하는 생체분자들의 존재, 기능 및 역 할들을 다양한 분석방법을 이용하여 대량으로 신
속하게 분석이 가능하게 되었다. 그러나, 사용 가 능한 시료의 처리 공정이 매우 단조로워 사용 범 위가 제한되고 있는 실정이다[6].
핵산 및 단백질을 이용한 바이오센서 및 바이오 칩은 대부분이 시료 전처리 기술이 요구되기 때문 에 이를 자동화하기 위하여, 시료가 오염되는 것 을 방지하고 적은 시료에서 높은 검측감도를 구현 하는 랩온어칩(Lab-on-a-chip, LOC) 기술이 개발 되었다. LOC은 MEMS기술을 이용하여 칩 위에 미세유체 채널을 만들어 생물 및 화학시료의 분리 및 정제, 혼합, 반응, 세척, 검출 등 다양한 작업을 하나의 칩 위에서 수행 가능하게 개발된 것이다.
또한 다양한 샘플을 아주 적은 양만으로 연속적으 로 분석할 수 있는 방법으로, 고속 처리 분석을 가 능하게 하는 장점을 가지고 있다[7,8].
바이오센서의 응용 분야별 시장은 가정진단, POC 등 현장진단 분야가 가장 큰 비중을 차지하 고 있으며, 수요가 가장 많은 분야는 의료부문이 다. 최근에는 소형 바이오센서 개발로 인해 자유 로운 이동이 가능하고 즉각적인 감지가 가능하게 됨과 동시에, 소비자들의 건강과 웰빙에 관한 관 심이 고조되면서 식품분석용과 환경용 등 그 사용 이 점차 확대되고 있다[9,10].
음용수 등 식수원에 존재하는 바이러스 및 박테 리아를 측정하는 방법으로는 DNA/RNA 등 핵산 을 이용하는 핵산기반기술(Gene-based technolo- gy)과 특이 항체를 이용하는 항체기반 기술(anti- body-based technology)이 있다. 핵산기반기술은 PCR의 강력한 시료 증폭 기술에 의해 진단 감도 를 높일 수 있어 고감도 병원균 유무 측정에 주로 사용되고 있으며, 이러한 핵산을 이용한 분자진단 시장은 현재 핵산칩 어레이와 real time PCR 기기 로 양분된다[11,12].
하지만, 핵산을 이용하는 방법은 Figure 1에서 보여지듯이, 높은 감도와 특이도를 가지고 있음에 도 불구하고, 다양하고 복잡한 시료전처리기술이 요구되어진다. 그러므로, 본 고에서는 먼저, 핵산 측정을 위해 필요한 시료전처리 기술(세포의 파 괴, 핵산 정제/농축, 핵산 증폭)을 단순화시킬 수
Figure 1. 핵산기반 및 항체기반 바이오센서 측정공정 비교.
있는 연구에 대해 소개하고자 한다.
2. 세포파괴공정
바이오 칩 내에서 세포의 용해는 낮은 에너지로 보다 빠르게 세포 내부의 물질의 변질을 줄이고 높은 효율로 추출하고자 하는 것을 목적으로 하는 다양한 방법들이 개발되어왔다.
대표적으로 사용되는 기술은 에너지의 종류에 따라 기계적․물리적․화학적, 그리고 전기적 방 법들로 구성되는데, 비드 밀링을 이용한 분쇄, 그 리고 노즐을 이용한 분쇄와 같은 기계적인 방법, 초음파와 같은 물리적인 방법, 리소자임과 같은 효소를 이용하는 방법들이 있다[13].
최근에는 레이저를 이용하여 세포를 용해시켜 원하는 분석물질을 얻고자 하는 연구가 진행되어 그 중 일부는 상업화되었다. 대표적인 것으로는 순간적 펄스의 레이저 에너지를 이용하여 세포를 용해시키는 방식으로, 레이저 광원이 다양하고, 각 각의 원리가 레이저 광원에 따라 다르다는 것이 특징이다. 가장 많이 사용되는 고체상태 레이저인 YAG 레이저는 순간적으로 세포에 열을 발생시키 고 화학반응을 일으켜 세포를 증발시키는데, 피부 각질의 제거를 위해 이미 상용화되어 널리 사용되 고 있는 방식이다[14].
물리적인 방법 중에 대표되는 것은 초음파를 사 용하여 세포를 변화시키는 기술이다. 매질 내에 있 는 기포를 물리적으로 활성화시키는데 있어, 초음 파의 에너지를 높이고 주파수를 증가시키면 활성 화된 기포가 세포와 충돌하여 용해시킬 수 있다.
Lysis method Principle Strengths Weaknesses Mechanical method Mechanical friction, crush Simple of system design Difficulties of integration
Chemical method Enzyme Chemicals Simple of system design Various chemicals Micro valve/pump required
Laser lysis Thermal, chemical lysis
using laser Universal High power
Sonication Sonication power easy to integrate High power
Thermal lysis Thermal PCR compatible High power
Electroporation lysis Using high voltage easy to integrate Sophisticated design Table 1. 세포 파괴 공정
이 방법은 단시간에 세포를 파괴할 수 있고, 대용 량의 시료에도 적용이 가능하나, 그 물리적 강도가 높으면 단백질 및 핵산의 파괴 가능성이 있다[15].
열을 이용하여 세포를 용해시키는 방법은 매우 범용적으로 사용되고 있다. 열선을 이용하여 세포 를 직접적으로 접촉시켜 태우는 방식으로 수용액 속의 박테리아를 용해시키는데 효과적이며, 장비 의 제작비가 저렴하고 단시간 내에 세포를 용해시 킬 수 있는 장점이 있다. 그러나 90℃ 이상의 열을 가할 시에는 추출하고자 하는 단백질이나 핵산에 손상을 줄 수 있다는 단점이 있다[16].
최근에는 micro induction을 이용한 세포파괴기 술이 개발되었는데[17] 이 기술은 일정한 범위 내 에서 금속을 가열할 수 있으므로 온도 변화나 온 도 유지 등 생물공정에서 유용하게 사용될 수 있 다. 보통 음식을 가열하거나 조리할 때 많이 사용 되는 기술로, 금속의 종류, Induction의 주파수 등 을 최적화하여, 미세유체 내에서 유체가 수 초 내 에 가열되고, 이로 인해 박테리아를 쉽게 파괴할 수 있다. 이를 이용하면 가열장치를 유체 내에 삽 입하고 이를 전원에 연결해야 하는 등 미세유체 칩이 가지고 있는 큰 문제점을 해결할 수 있다.
3. 핵산 농축/정제공정
핵산을 농축, 정제하는 기술은 액상을 기반으로 한 기술에서 고체상을 기반으로 한 기술로 발전하 였다. 이는 고체상 기반 기술로 인해 핵산의 정제
및 농축의 효율 증대 및 공정시간은 감소하였으 나, 카오트로픽 염이나 에탄올과 같은 유기용매를 사용하고, 표면의 특성을 변화시키기 위해 표면의 처리 공정이 요구되는 등 증폭공정에 문제를 일으 킬 수 있는 단점을 가지고 있다[18].
3.1. 페놀-클로로포름 침전법
1900년대 초부터 세포로부터 핵산을 분리하기 위한 다양한 방법이 고안되었다. 다량의 DNA를 추출, 정제하기 위하여 아직까지 각 연구실에서 많이 사용하는 방법은 페놀-클로로포름을 이용한 침전법이다. 이 방법은 DNA를 포함한 수용액상 을 분리하고 알코올을 이용하여 침전시키는 방법 으로, 페놀-클로로포름을 이용하여 세포 용해물로 부터 핵산을 분리/정제하기 위하여 개발되었다[19].
액체상을 이용한 핵산 정제 방법은 시료가 대용 량일 때 유용하나, 정제/농축 시간이 많이 걸리고, 처리 과정이 복잡하여 사용자의 정교한 기술 습득 이 요구될 뿐만 아니라, 유기용매 사용에 의한 오 염의 위험이 있다.
3.2. Boom Technology
1993년에 boom에 의해 재정립된 최초의 고체 상 기반의 핵산 정제/농축 기술인 boom techno- logy는 현재 고체상 핵산 정제 기술의 핵심 원천 기술로 사용되고 있다. 이 기술은 카오트로픽 염 인 guanidine hydrochloride, guanidine thiocyan- ate, sodium iodide 등이 물 분자 네트워크를 붕괴
Technology Surface Salt Solvent Step Companies
Boom Silica Chaotropic salt Ethanol 3
Qiagen Biomerieux BD science Macherey-Nagal
SPRI Carboxyl group modified PEG, NaCl Ethanol 3 Agencourt
CST Aromatic group modified No specific salt 3 Invitrogen
Promega
CCT Sand-clay Mg, EDTA Ethanol 3 Molzym
5IBT alumina No specific salt Ethanol 2 Xtrana
Table 2. 핵산 및 박테리아 농축/정제 공정
하여 표면에 있는 물 분자를 제거하면, silica 표면 에 있는 히드록시기와 용액 내에 있는 양이온 분 자가 치환된다. 그러므로 표면의 극성이 양극화 되어 음극을 띄는 핵산의 흡착이 가능하게 된다.
이 기술은 최초의 고체상을 이용한 핵산 정제 방 법일 뿐만 아니라, 그 효율 또한 높기 때문에 대형 바이오 시약 회사인 qiagen, biomerieux, BD bio- science 등에서 사용하고 있다[20].
이처럼 카오트로픽 염 및 에탄올을 사용하는 기 술은 정제/농축 효율이 높고 사용이 편리하나, 카 오트로픽 염 및 에탄올을 제거하기 위하여 높은 수준의 에너지가 필요하다는 단점이 있다. 따라서 boom technology를 소형 시스템에 사용하기 위해 서는 단계의 감소, 높은 회전 에너지 생성 방법, 용액 교환 방법 등 카오트로픽 염 및 에탄올의 세 척방법이 개발되어야 한다. 그러나 오랫동안 이를 해결하기 위한 방법은 제시된 적이 없었으며 그 대 신, 카오트로픽 염 및 에탄올을 사용하지 않고 핵 산을 정제/농축하는 새로운 방법이 개발되고 있다.
3.3. SPRI (Solid Phase Reversible Immo- bilization)
1994년에 Hawkins에 의해 고안된 이 방법은 생 물공정에 적합한 물질을 사용하여 표면에 DNA를 흡탈착시키는 방법이다. 이는 카오트로픽 염 대신 PEG와 일반 염을 사용하고, Boom techonolgy가 실리카 표면을 사용하는 반면, SPRI 기술은 카르 복실 표면을 사용한다. 카르복실 표면은 실리카
표면처럼 낮은 pH에서는 표면의 극성이 중성이 되나, pH가 올라가면 작용기가 COO-가 되면서 음극이 되기 때문에 DNA를 쉽게 방출할 수 있다.
여기서 NaCl은 염석 효과를 일으키며, PEG는 DNA가 표면에 접근할 수 있는 기회를 증가시킨 다. 이 방법은 카오트로픽 염을 사용하지 않기 때 문에 마이크로 플루이딕을 사용하는 소형 시스템 에 적합한 방법으로 여겨지나, PEG의 사용으로 인해 용액의 점도가 증가함으로써 용액 조절이 어 렵고, NaCl의 높은 농도로 인하여 세척 시간이 길 어진다는 단점이 있다. PEG을 사용하지 않기 위 해서는 DNA의 효율적인 흡착을 위해 그 표면을 양성화시켜야 한다[21].
3.4. CST (Charge Switch Technology) 1999년에 개발된 이 기술은 유기용매나 세척을 필요로 하는 염 및 PEG를 사용하지 않으면서 핵 산의 흡착 효율을 증대시키기 위한 기술로, 표면 의 극성을 pH를 이용하여 바꿔주는, 표면을 개질 한 마이크로 입자를 이용한다. 코팅되는 물질은 보통 pyridine, imidazole과 같은 방향족 아로마틱 화합물이나 카르복실 그룹이 포함된 물질과 혼합 시킨 것이다. 이 기술은 다른 여타의 물질은 사용 하지 않고 오로지 표면의 극성을 변화시키는 물질 을 사용하여 핵산을 흡착, 탈착시킨다.
SPRI 방법에서는 PEG를 사용하여 표면의 핵산 흡착 효율을 증대시켰으나, CST 방법에는 표면의 극성을 중성에서 양극성으로 바꿔줌으로써 흡착
효율을 증가시킨다. 따라서 흡착을 위한 카오트로 픽 염이나 PEG가 필요하지 않다. 그러나 중성의 상태에서 DNA가 탈착 효율이 그다지 높지 않기 때문에 이를 위하여 또 다른 에너지를 필요하게 된다[22].
3.5. CCT (Charge Complexation Technology) 극성 복합체형성 기술은 타 기술과 달리 흡착된 핵산을 방출할 때 EDTA를 사용한다. 이 기술은 boom technology에서 사용하는 실리카나 SPRI나 CST기술에서 사용하는 코팅된 극성 표면이 아닌 사질 점토(sand-clay)를 이용한 필터를 이용한다.
DNA를 흡착하는 방식은 boom technology에서 사 용하는 직접 흡착이긴 하지만 CST나 SPRI의 직 접적인 극성 작용이 아니라 Mg2+와 같은 2가 양이 온을 이용하여 음극 핵산 복합체를 이용한 방식이 다. 세척용액은 기존의 boom technology처럼 에탄 올을 이용하고, 흡착된 핵산과 표면 사이에 존재 하는 Mg2+를 제거하기 위해 EDTA를 이용한 EDTA-Mg2+복합체를 형성시켜 핵산을 표면에서 분리한다[23].
Molzym 사가 보유하고 있는 이 기술은 상대적 으로 타 기술과 달리, 후속 공정에 영향을 주거나 표면을 코팅하는 방법을 사용하지 않는다. 이처럼 표면의 개조 없이 필요한 성질의 용액을 투입하는 방식을 개발한다면, 병원균 검측 소형 시스템이 가능하리라 사료된다. 하지만 이 기술 역시 3종 용 액을 사용하는 기본 형식을 취하고 있고, 세척 단 계 시, 70% 에탄올을 사용하기 때문에 소형 시스 템의 적용이 어렵다.
3.6. Irreversible Binding Technology Xtrana 사에서 개발한 이 기술은 앞에서 설명한 기술과 달리, 2단계의 공정을 사용한다. 이 기술에 서 사용하는 표면은 핵산을 비가역적으로 흡착시 켜, 세척한 후에 후속공정인 핵산 증폭공정에 이 용된다.
튜브 내면을 알루미나와 같은 핵산이 잘 흡착하 는 표면으로 코팅하고 시료를 주입한다. 핵산이
Table 3. 핵산 증폭 및 신호 증폭 공정
Method Technique Company
Target Amp.
PCR Roche Molecular Systems
TMA Gen-Probe Inc.
NASBA BioMerieux
SDA Becton Dickinson
LiPA Innogenetics Diagnostics
RCA Qiagen
Probe Amp.
LCR Abbott Laboratories CPT ID Biomedical Dorp.
Invader Assay Third Wave Molecular Diagnositics
Signal Amp.
bDNA Technology Bayer Diagnostics Hybrid Capture Qiagen (Digene) Hybridization Protein
Assay Gen-Probe Inc.
표면 내부에 흡착되면 시료 용액을 버리고 세척하 는데, 이 때 비가역적으로 흡착된 핵산은 탈착되 지 않고 튜브내면에 존재하게 된다. 그 후 후속공 정인 핵산 증폭 공정을 그 튜브에서 바로 수행하 면 된다[24].
이 기술의 장점은 핵산 탈착단계 없이 직접 증폭 함으로써, 2단계로 핵산을 정제/농축하는 것으로 흡착되었던 핵산의 손실을 막고, 공정의 수를 줄임 으로써 소형 시스템에 직접적으로 이용이 가능하 다. 하지만, 비가역적으로 흡착된 핵산을 증폭하기 어려워 핵산 증폭 효율이 급감하는 단점이 있다.
4. 시료 증폭 공정
핵산을 이용하는 기술이 광범위하게 이용되는 가장 큰 이유는 핵산 증폭 기술의 발달이다. PCR 은 핵산 증폭의 대표적인 기술로써, 핵산을 이용 한 박테리아 및 바이러스 측정에 있어 높은 특이 성과 선택성을 가지고 있다. 이러한 핵산 증폭 방 법에는 RT-PCR, RCA, NASBA, SDA, TMA, LCR 등이 있다. 그 중에서 RCA 기술은 이론적으 로 현존하는 기술 중 가장 민감도가 높은 기술로,
하나의 프라이머를 신장시켜 반응을 하거나 원형 의 형태로 제작하여 반복되는 시퀀스를 가진 생성 물로 증폭하는 기술이며 현재 단백질 측정을 포함 한 다양한 분야에 응용되고 있다.
RNA 증폭 기술은 RT-PCR, NASBA, TMA 등 이며, 이 중에서 NASBA와 TMA는 항온 반응에 의한 핵산 증폭으로, 증폭 생성물이 RNA라는 것 등 기술적 특성이 매우 유사하다[25].
4.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) 유전자와 유전자 활성에 대한 연구를 가능하게 함에 있어 혁신적인 방법으로 인정받은 gene cloning 기술의 개발과 함께 1980년대 후반에 개 발된 PCR은 매우 간단한 기술로, 생물학과 유전 학 발달에 지대한 역할을 하고 있으며, 그 외 더 넓은 영역에서도 많이 응용되고 있다.
PCR은 DNA 주형의 증폭에만 제한되어 있는 것이 아니다. RNA 분자가 우선 단일 가닥의 cDNA 로 역전사 효소에 의해 전환되면 증폭될 수 있다.
이후에 Taq polymerase를 첨가하여 standard tech- nique과 동일한 방법으로 사용되며, 이는 Northern blotting에 의한 방법보다 훨씬 민감도가 높다고 할 수 있다[26].
4.2. RCA (Rolling Circle Amplification) 이 기술은 PCR과 달리, 항온에서 증폭이 이루 어지는 단일온도 증폭 방법이다. Molecular Staging 사에서 1995년에 개발된 기술로써, PCR과 달리 증폭뿐만 아니라 측정에서도 많이 쓰이는, 현존하 는 초고감도 증폭방법이다. 두 개의 프라이머를 사용하고 있으며, 그 중 하나의 프라이머는 타겟 과 혼성화반응을 일으키고, 신장반응이 일어남으 로써 원형이 된다. 그리고 또 하나의 프라이머는 원형화 프라이머와 혼성화 반응을 일으키고, 이에 polymerase가 반응하면서 원형의 프라이머가 가 지고 있는 시퀀스가 계속 증폭하게 된다[27].
이 방법은 PCR과 비교할 때, 다중반응에 이로 우며, 최고의 장점으로는 증폭 시, 오차가 적다는 것이다. 그러므로 정제되지 않은 시료나 또는 그
양이 극히 적을 때 사용하는 적합한 방법이다. 이 증폭기술은 현재 Qiagen 사에서도 제품으로 출시 하고 있으며 PCR과 함께 DNA를 증폭하여 병원 균 및 기타 검측을 위한 기술로 널리 사용되고 있다.
4.3. LCR (Ligase Chain Reaction)
LCR은 타겟 증폭 기술인 PCR과 비슷하지만, 조금 다른 탐침 증폭기술로 분류되고 있는 기술이 다. PCR 기술은 프라이머 혼성화 반응이 일어나 고 polymerase 효소에 의해 amplicon을 합성하는 방법이지만, LCR은 보통 PCR처럼 증폭의 기준이 프라이머와 상보적인 시퀀스를 가지고 있는 부분 을 증폭하는 것보다는 단일가닥 핵산의 차이를 검 증하고자 할 때 주로 사용된다[28].
프라이머를 신장반응하게 되면, 핵산의 아주 작 은 차이를 측정할 수 있어서 돌연변이 또는 특정 시퀀스의 문제점을 쉽게 발견할 수 있는 장점이 있으나, 신장반응이 느리고 그로 인한 증폭효율이 떨어진다는 단점이 있다. 또한 제작된 amplicon의 길이가 주입하여 준 프라이머의 길이의 두 배이기 때문에 증폭 후 남아있는 프라이머와 amplicon의 차이를 구별하기 힘들다. 이러한 기술은 현재 Abbot laboratories 사에서 개발하고 제품을 출시하고 있다.
4.4. SDA (Strand Displacement Amplification) BD사에서 개발한 이 기술은 PCR이 가지고 있 는 프라이머의 혼성화반응에서 혼성화 오차를 감 소시키기 위하여 개발된 기술로써, 현재 PCR 와 함께 병원균 감염에서 흔히 사용하는 기술이다.
SDA는 현재 두 가지 큰 방향으로 사용되고 있 다. 먼저 restriction enzyme을 사용하는 경우이다.
이것은 프라이머의 양 끝에 제한효소 시퀀스를 넣 어주고 프라이머가 반응을 한 후, polymerase에 의 한 반응이 일어나고 있을 때, 제한효소에 의해 잘 려진 프라이머가 같이 반응을 하여 증폭이 되는 경우이다. 이 경우 양 끝에는 네 종류의 프라이머 가 반응을 하는 효율을 나타내며 이로 인해 프라 이머의 혼성화 반응을 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또 하나의 경우는 처음부터 양 끝에 다른 시
퀀스를 가지고 있는 프라이머와 기존 PCR에서 사 용하는 프라이머를 직접 주입하여, 증폭하고자 하 는 시퀀스의 양 끝에 새로운 시퀀스를 포함시키게 하는 경우이다. 이 경우에는 부가적으로 첨가된 시퀀스를 이용하여 후 공정인 측정공정에 직접적 으로 사용할 수 있다[29].
4.5. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) & TMA (Transcription Mediated Amplification)
현재 BioMerieux사에서 기술을 보유하는 있는 NASBA와 Gen-Probe 사에서 기술을 보유하고 있 는 TMA는 RNA를 중점적으로 이용하는 증폭기 술로, 기능상 매우 비슷하다. 이러한 기술은 RNA specific 한 기술로써 현재 가장 많이 사용하고 있 으며, 특징으로는 프라이머 한곳에 T7 polymerase 가 작용할 수 있는 promoter sequence를 보유하고 있다는 것이다. 이 기술이 현재 각광받고 있는 이 유 중에 하나는 단일온도에서 수행되기 때문에, PCR처럼 온도 조절기가 필요하지 않고, 간단하게 RNA를 specific하게 증폭할 수 있다는 것으로, virus 검사나 살아있는 박테리아 검사 시 유용한 검사법으로 알려져 있다[30,31].
기본적으로 NASBA와 같이 RTase를 사용하는 증폭방법은 다수의 효소를 사용하게 되고, 이로 인 한 반응이 조금 까다롭다는 단점이 있으나, RNA 의 재현성이 있는 방법으로 현재 많이 사용되고 있고, 항온 반응에 의한 핵산 증폭방법으로 chip 내부에서 RNA 증폭 시 온도조절이 매우 용이하 며, 장치 설치 비용이 매우 저렴하다.
이처럼 핵산기반기술을 이용하여 병원균을 측 정하고자 할 때는 원하는 병원균을 특이적으로 검 측할 수 있어야 하므로 시료 증폭기술이 필수적이 다. 현재 많은 회사에서 자신만의 증폭기술을 보 유하고 있으며, 그 방법을 이용하여 다양한 병원 균을 검측할 수 있는 분석법이나, 그에 따른 kit가 개발되고, 제품화되고 있다.
5. 시료 측정 공정
바이오 센서 개발에 있어 가장 중요한 것은 표 적을 인식하고 효율적으로 신호를 검출할 수 있는 기술이다. 질병 또는 병원균 관련 표지 DNA, RNA, 항체를 효과적으로 검출하기 위한 기술은 센서표 면/생체분자와 표적과의 상호작용을 통해, 시료로 부터 표적을 선택적으로 검출할 수 있어야 할 뿐 아니라 표적의 포획을 높은 감도와 저잡음으로 관 찰자에게 보고 할 수 있는 기작이 필수적으로 요 구된다. 이를 위하여 현재 대부분의 바이오센서에 서 표적 검출을 위한 신호로 보편적으로 채택되고 있는 것은 전기적․자기적․광학적 신호가 있다[32].
5.1. 전기적 신호 이용 기술
전기적 신호는 가장 높은 감도를 나타내는 검출 신호 중의 하나로서 표적 분자와의 결합에 의해 전류와 같은 전도성 차이를 나타내는 신호를 모니 터 하여 표적의 유무를 판별하는 기작을 사용한 다. 이 경우 감지부의 크기의 일반적인 크기가 나 노 수준으로 극소형화 하게 되면 시료 내에 존재 하는 극소량의 표적에 대해서도 검출 가능토록 감 도 개선이 가능하다. 이를 위해서는 SWNT (single well carbon nanotube)나 실리콘 나노튜브 등과 같 은 반도체적 특성을 가지는 나노 구조체를 트랜지 스터 형태로 제작, 그 표면에 특이성을 가지는 항 체나 DNA를 부착하여 해당 표적의 유무에 따라 전기적 특성 변화를 측정함으로써, 시료 내의 표 적을 검출하면 된다.
전기적 신호는 일반적으로 높은 감도를 구현할 수 있으나, 자기적 신호와 더불어 분석기기 제작 에 고난이도의 기술을 필요로 하고, 현장에서 사 용되기에 적당한 규모로 제작되기에는 어려움이 있다. 또한 탄소나노튜브와 실리콘 나노튜브를 이 용한 고감도 바이오센서 제작의 예에서 보고된 바 와 같이, 표적분자와 포획분자와의 결합 전후에서 발생하는 미세한 전기적 특성 변화가 전기적 신호 에 영향을 미치고, 시료 용액 내의 염도와 같은 시 료의 조성에 대한 재현성을 확보하는 데 어려움을
Figure 2. 단일챔버를 이용한 박테리아 측정 개념도
겪고 있다[33].
5.2. 표면 플라즈몬(Surface Plasmon) 기반 기술 전기적 신호는 뛰어난 민감도를 가지는 장점에 도 불구하고 시료의 상태에 따라 재현성 문제가 제기되고 있다. 이를 개선하기 위한 노력으로 최 근 금나노입자나 양자점(quantum dot)과 같은 무 기나노입자의 광학적 성질을 이용한 신호 검출 방 법이 널리 연구되고 있다. 무기 나노 입자가 나노 크기로 줄어들게 되면, 모양과 크기에 따라 양자 제한 효과에 의한 광학적 특성이 크게 달라진다.
금나노 입자는 주로 금속 표면에서 일어나는 광 신호 증폭현상인 표면 플라즈몬 현상을 기초로 하 여 신호 검출에 이용된다. 금나노 입자의 경우 생 안정성이 뛰어나고, Au-thiol간의 선택적인 화학 결합으로 인해 생체분자의 표지가 용이하다는 장 점으로 인해 대부분의 바이오센서 제작에 있어 적 절한 플랫폼을 제공한다. 그러나 표적 물질에 대 한 정량적인 분석이 어렵다는 단점때문에 주로 정 성분석이나 제한적인 정량분석으로 이용된다[34].
5.3. 형광기반기술
형광과 같은 광학적 신호는 표적을 인식할 수 있는 탐침 생체분자에 직접 부착하여 표적과 포획 분자간의 상호작용으로 인해 시료 내 표적존재의 유무를 판별할 수 있어 재현성이 높다. 이뿐 아니 라, 이미 상용화되어 있는 많은 생체분자가 부착 된 형광물질을 이용하여 비교적 용이하게 시스템 구축이 가능하다는 장점이 있다. 하지만 GFP와 같은 단백질 기반 형광물질, 일반 유기 형광 염료
를 사용한 형광신호는 외부 광원에 의한 형광 광 탈색 현상으로 인해 제한된 시간 내에서만 측정하 여야 하므로 시간에 따른 신호의 세기가 고정적이 지 못하다는 단점이 있다[35].
무기나노입자는 기존 형광 물질의 대체제로 개 발되어 바이오센서 분야에 도입되어 널리 연구되 고 있다. 양자점의 경우 일반 유기형광물질과는 달리 하나의 파장에서 여러 가지 색을 야기시킬 수 있다는 장점이 있어 다중 적출용을 적합하다.
또한 양자점 표면을 실리카나 생친화성 고분자로 코팅한 후 바이오 물질로 표지하기 때문에 유기형 광물질에 비해 우수한 광학적 특성으로 최근 많은 바이오센서 시스템에 사용되고 있다[36].
6. 단일 챔버 바이오센서
바이오센서의 개발은 최근까지 환경시료 속의 박테리아를 진단하기 위해 꾸준히 진행되어왔다.
대부분의 환경시료 속에는 매우 저농도의 박테리 아가 존재하고 있어 일반적인 PCR 검출법이나 항 체 기반 검출법 등 여타의 바이오센서로는 진단이 어려워 오차의 발생률이 높았다. 따라서 신호의 증폭을 위해 여러 단계의 공정이 요구되기 때문에 일반적인 환경시료 속의 박테리아를 진단하기 위 한 바이오센서는 수많은 노즐과 여러 챔버의 사용 이 불가피하여 매우 복잡한 칩의 형태를 갖고 있다.
바이오센서의 보급이 점차 전문업체 또는 병원 에서 일반인의 사용으로 확대되면서 보다 간편한 작동법과 단시간 측정법이 요구됨에 따라 현재 바 이오센서 개발은 단일 챔버 바이오센서로 초점을
맞추고 있다.
위에 소개된 각각의 공정에서의 여러 방법들은 높은 효율로 각각의 공정을 수행하기에 많은 장점 을 가지고 있지만 대용량의 시료를 측정하기에는 연속된 전처리 과정이 필요하며 단일 챔버에서 수 행하기에는 여러 문제점을 가지고 있다. 독성을 가지고 있는 물질의 사용뿐 아니라, 효소의 활동 저해제가 첨가되어 세척의 공정이 없이는 다음의 단계를 수행할 수 없고, 여러 공정을 하나의 칩에 서 수행하기에는 적어도 2개 이상의 챔버가 요구 된다.
최근 대용량 환경샘플 속의 박테리아를 진단하 기 위하여 세척의 공정 없이 곧바로 다음의 공정 을 수행할 수 있는 단일 챔버 바이오센서가 개발 되었다. 대용량의 시료를 칩에 유입시켜 RNA와 박테리아를 농축시키고 농축된 박테리아는 세척 의 공정없이 바로 핵산 증폭, 형광 분자프로브 (beacon)의 사용으로 직접 형광진단을 할 수 있게 되었다.
6.1. 핵산 흡착 방법 : Silica Surface-pH Control
Glass bead의 표면에 돌출된 히드록시기(-OH) 는 DNA/RNA의 phosphate 기와 결합함으로써 DNA/RNA의 흡착이 이루어진다. 히드록시기는 용액 중 수소이온농도(pH)에 영향을 받는데, 수소 이온농도가 낮아지면 수소이온을 해리하여 산소 이온 형태가 되므로 음극을 띄게 되고, 수소이온 농도가 높아지면 용액중의 수소이온과 표면의 산 소이온이 반응하여 극성이 없어지게 된다. 그러므 로 음극을 띄는 RNA의 phosphate기는 수소이온 농도가 높을 때 정전기적 인력에 의한 repulsion 힘이 없어져 DNA/RNA와의 표면과의 접근을 유 도할 수 있다. 이렇게 되면 인위적으로 수소이온 농도를 조정한 완충용액의 사용으로 부가적인 다 른 이온이 없이도 실리카 표면에 DNA/RNA의 흡 착이 가능하며, 수소이온농도가 높은 pH 3에서의 RNA 흡착율은 약 50% 이상의 흡착율을 보이게 된다. 이러한 흡착 방법은 가역적 반응으로 수소
Figure 3. 핵산 농축 및 증폭 연속공정.
이온농도가 낮아지게 되면 쉽게 DNA/RNA가 탈 착되어 DNA/RNA의 회수가 가능하다[37].
이것은 핵산 진단을 위한 후속공정으로 매우 유 리한 방법이다. pH가 조절된 완충용액만을 사용 하기 때문에 후속공정에 대한 그 어떤 저해제로 작용되지 않으므로 별도의 세척 공정이 필요 없어 공정 단계의 감소가 가능하다. 게다가 후속공정으 로 핵산의 증폭 방법을 사용하게 되면, 핵산 증폭 용액이 pH 8.5를 띄므로 별도의 탈착 공정이 필요 없다.
따라서 단일챔버를 가지는 바이오센서에서도 사용이 가능하며, 핵산의 농축 직후 바로 증폭하 여 2단계로 핵산을 정제/농축/증폭하는 것으로 공 정의 수를 줄일 수 있어 소형 시스템에 직접적으 로 이용이 가능하고, 대용량의 시료를 처리할 때 유용하다. 이 방법은 핵산의 손실을 방지할 수가 있어서 100 mL의 환경시료 내 수 개의 박테리아 진단이 가능하다[38].
6.2. 박테리아의 농축 공정
대부분의 환경 시료 속 박테리아는 수용액 상태 로 존재하며, 이는 친수성 표면일수록 수용액과
혼합되어 수용액 속 박테리아와의 접촉 확률이 증 가한다. 그러나 이것은 박테리아와 표면의 접촉 확률을 증가시킬 뿐, 박테리아와 박테리아 간의 상호작용이 표면과 박테리아 간의 상호작용보다 강하기 때문에 직접적인 흡착에 영향을 주는 것은 아니다. 따라서 표면과 박테리아 간의 상호작용을 유도하여 박테리아 흡착율을 증가시켜야 한다[39]
또한 표면과 박테리아의 접촉 확률을 높임으로 써, 친수성 표면에 흡착된 소량의 박테리아는 표 면에 더 많은 박테리아가 흡착할 수 있도록 시료 속 의 다른 박테리아와의 상호작용을 유도해야 한다.
박테리아는 주로 세포막과 얇은 펩티도글리칸 으로 이루어진 세포벽, 외부에 인지질, 리포폴리사 카라인, 리포프로테인 등으로 구성된 외막을 가진 그람음성과 세포벽이 여러 층의 펩티도글리칸으 로 두껍게 감싸고 있는 그람양성균으로 분류되는 데, 그람음성균의 경우 인지질로 이루어진 외막으 로 인해 음극을 띄고 있으며, 그람양성균의 경우 두꺼운 세포벽의 수소이온농도조절로 인해 양성 또는 중성을 띈다[40,41].
그람음성균의 흡착을 위해서는 2가 양이온의 금속염인 Mg2+을 사용하여 박테리아와 박테리아 사이의 정전기적 인력에 의한 응집을 유도하는 것 이 가능하다. 또한 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨 가하면 그 효율이 극대화되는데, 친수성 성질이 매우 강한 고분자인 PEG가 물을 흡수하여 순간적 으로 박테리아 표면을 건조하게 만들면 박테리아 와 박테리아 간의 상호작용이 증가되어 흡착율이 증가한다[42].
그람양성균의 흡착을 위해서는 2가 음이온인 SO42-를 사용하여 흡착효율을 증가시킬 수 있다. 2 가 양이온을 이용하여 정전기적 흡착을 유도했던 그람음성균과 달리, 그람양성균의 경우 PEG의 사 용이 요구되지 않는데 이는 상대적으로 표면의 유 연성이 낮아 고분자인 PEG의 유입 시, 그 영향이 오히려 세포간의 접촉에 방해를 받기 때문이다[43].
정전기적 인력을 이용한 박테리아 흡착 기술을 이용하게 되면 저농도의 시료 샘플에서도 50% 이 상의 흡착효율을 보이며, 특히 대용량의 시료를
Figure 4. 박테리아 농축 및 파괴공정.
처리할 때 매우 유용하다. 게다가 후속 공정으로 이어질 경우 PEG는 PCR과 같은 유전자를 기반으 로 한 공정에서 효소 활동의 저해제로 작용하지 않으며, Mg는 과량이 첨가되지 않는 한도 내에서 세척의 공정이 없이 바로 다음의 공정으로 사용 가능하다는 장점이 있다.
흡착된 박테리아는 칩 내부에서 파괴되어 핵산 을 방출하게 되므로 외부 오염에 의한 오차가 감 소하고, 외부에서 RNase에 의한 핵산 파괴 없이 곧바로 다음 공정으로 수행이 가능하며, 민감도가 매우 높아 101 CFU/100 mL의 박테리아도 효과적 으로 측정할 수 있다[44].
6.3. 박테리아의 파괴 공정
표면에 흡착된 박테리아는 핵산의 방출을 위해 박테리아를 파괴하는 공정을 필요로 한다. 박테리 아를 흡착시키는 표면으로 친수성물질인 실리카 금속 입자를 사용한다면, 인덕션에 의한 열적 파 괴 공정에 의해 보다 손쉽게 칩 내부에서 박테리 아를 파괴하는 것이 가능하다. 이것은 고주파를 이용하여 금속입자의 가열을 유도하는 장치로, 순 간적인 인덕션 가열에 의해 단 수초에 불과하는 시 간으로도 90% 이상의 박테리아 파괴율을 보인다.
이러한 공정을 통해서 칩 안에서 박테리아를 파 괴하게 되면, 외부 환경의 오염에 의한 진단 오차 를 줄일 수 있고, RNase 오염에 의한 핵산의 분해
Figure 5. 단일챔버 내 농축/증폭/측정 공정을 통한 환경시 료 내 박테리아 측정 결과.
를 방지할 수 있어 보다 정확한 진단이 가능하다.
또한 박테리아의 흡착방식이 비록 비가역적인 방 법이라 할지라도 박테리아 파괴에 의한 핵산의 손 실이 없고, 표면과 핵산의 결합 시 효소 반응에 의 한 효율의 감소 또한 효과적으로 줄일 수 있다. 추 출된 핵산은 PCR 등 다른 증폭공정을 통하여 증 폭 및 측정이 가능하다. 이렇게 단일 챔버 내에서 시료를 농축/파괴/증폭/측정을 하는 공정은 각종 환경 또는 음식 시료에서 박테리아를 측정하는 데 유용하게 사용되어 질 수 있다. Figure 5에서 보여 지듯이, 이번에 소개된 박테리아 진단법으로 인해 강물/빗물 등의 환경시료 100 mL 내에서 수개의 박테리아 진단이 가능하게 되었다.
7. 결 론
본 고에서는 환경시료 속의 박테리아를 진단하 기 위한 방법으로 핵산의 농축/증폭/진단 또는 박 테리아의 농축/파괴/증폭/진단의 방법을 소개하였 다. 대부분 바이오센서의 경우, 센서 측정공정의 감도 향상을 위한 연구가 주로 이루어져왔다. 다 양한 나노기반의 센서들도 연구되어져 왔지만, 대 부분, 실제 환경시료에서는 적용되기 어려운 순도 높은 시료를 사용하여 왔다. 물론 항체기반의 바 이오센서의 경우, 많은 경우에 실제 시료를 사용 하고 있지만, 항체의 특이도와 민감도가 핵산기반 측정에 미치지 못하는 경우가 많았다.
핵산기반 바이오센서에서 요구되어지는 순차적
공정을 최적화하고, 물질의 이동을 최소화하여 바 이오센서의 감도를 향상시키는 기술은 이제 막 시 작되었다고 생각된다. 여러 회사에서 이러한 공정 을 이용하여 바이오 측정 장비를 개발하고자 하고 있으며, 1∼2년 내에 제품이 출시되리라 예상되는 가운데, 기존의 연구와 더불어 측정에 대한 감도 향상 뿐 아니라, 측정 전반의 공정에 대한 깊은 연 구가 필요하다고 생각된다.
감 사
본 연구는 환경부의 “차세대핵심환경기술개발 사업(Eco-technopia 21 project)” 및 2010년도 경 원대학교의 지원받은 과제입니다.
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원 지 영
2008 경원대학교 화학공학과 학사 2009∼현재 서강대학교 화학공학과
박사과정
민 준 홍
1992 서강대학교 화학공학과 학사 1994 서강대학교 화학공학과 석사 1998 서강대학교 화학공학과 박사 1999 고려대학교 생물공학과
post doc
2000∼2001 Cornell university post doc 2002∼2003 Innovative Biotechnologies,
international (NY), Senior scientist
2003∼2007 삼성종합기술원 전문연구원 2007∼현재 경원대학교 바이오나노대학
교수
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