Sang Jun Sim and Jun Pyo Kim
School of Chemical Engineering, Sungkyunkwan University, Gyeonggi-do 440-746, South Korea
Abstract: 탄소나노튜브의 우수한 전기적․기계적 물성에 대한 연구와 더불어 바이오 분야에 적용하기 위한 연구가 계속해서 진행되고 있다. 탄소나노튜브 표면을 개질하여 바이오 기능화시키는 방법에 대해 연구가 진행 중이며, 이러 한 표면 개질 기술로 인해 세포, 단백질, DNA 등 분자 단위의 연구를 가능하게 하였다. 본 논문에서는 탄소나노튜브 의 바이오화 표면에 대한 리뷰 및 탄소나노튜브를 기반으로 하여 질병 진료를 고감도 및 간편하게 진료할 수 있는 바이오센서의 최근 연구 동향에 대하여 살펴보았다. 특히, 여러 타입의 탄소나노튜브 기반 바이오센서 중 전기화학적 감지법에 의한 바이오센서의 최근 연구 동향 및 성균관대 나노광학분자생명공학 연구실에서 수행 중인 CNT-FET 바 이오센서를 중심으로 기술하였다.
Keywords: biosensor, carbon nanotube, electrical detection, molecular sensing
1. 서 론
1)
최근에 나노미터 크기의 극 미세 영역에서 새로 운 물리현상과 향상된 물질 특성을 나타내는 연구 결과가 보고되면서 나노 과학 기술이라는 새로운 영역이 태동하게 되었고, 이러한 나노과학 기술은 앞으로 21세기를 선도해 나갈 수 있는 과학기술로 써 전자정보통신, 의약, 소재, 제조공정, 환경 및 에너지 등 의 분야에서 필수적인 기술로 부각되고 있다. 특히 탄소나노튜브는 기존벌크 물질의 특성 과는 매우 상이한 나노물질이 갖는 새로운 특성의 구현이 가능하고, 탄소나노튜브의 화학․물리적 개질을 통하여 새로운 기초연구 및 산업적 응용이 가능하기 때문에 크게 각광을 받고 있는 실정이 다. 탄소나노튜브는 물리적 구조에 따라 전도체, 반도체 및 절연체의 특성을 갖기 때문에 다양한 나노일렉트로닉스의 응용분야에 있어 새로운 신 소재로 각광받고 있다. 직경이 1∼2 nm 밖에 되지
† 주저자 (E-mail: [email protected])
않는 단층벽 탄소나노튜브는 독특한 구조 및 전기 적 특성 때문에 미래의 나노일렉트로닉스의 원천 기술로서 기대를 받고 있다[1-3].
일반적으로 전기적 방식의 감지 기술은 바이오 물질과 반응하는 접촉표면에서의 물리적 또는 화 학적인 변화가 전도성 물질의 전기적 특성 변화를 유도하는 원리로 동작한다. 그런데, 주로 대상이 되는 바이오 물질(DNA, 단백질 등)은 고분자 물 질로서 나노 구조체의 크기와 비슷하여 작은 변이 로도 일반 저분자 물질에 비하여 나노 구조체에 큰 영향을 줄 수 있다. 또한, 여기서 살펴볼 탄소 나노튜브의 경우 나노구조의 특성상 표면적 대비 부피의 비율이 매우 커서 표면에서의 바이오 물질 과의 반응이 탄소나노튜브 전체의 전도특성에 큰 영향을 미친다. 따라서 이러한 탄소나노튜브를 검 출 부분에 적용할 경우, 기존의 바이오센서에서 찾아볼 수 없는 고감도의 신호 변환이 가능하다.
본 논문에서는 탄소나노튜브를 바이오센서로 이 용하기 위해 표면을 생물분자로 개질하는 방법과
Figure 1. 탄소나노튜가 고정된 Pt 전극의 모식도. 내부그 림: 탄소나노튜브 전극의 SEM (Scanning electron micro- scope) 사진.
현재 세계적으로도 활발하게 연구가 진행 중인 전 기적 신호변환 방식의 탄소나노튜브 기반 바이오 센서에 대해서 기술하였다.
2. 탄소나노튜브 기반 전기화학적 바이오센서
탄소나노튜브 및 생체 분자의 일체화에 있어 가 장 큰 장점은 탄소나노튜브의 작은 사이즈이며, 이러한 특성은 주로 전자의 이동에 의해 센서의 시그널로 발현되는 데 있어 큰 특성의 향상을 가 져온다. 최근 몇 년간 탄소나노튜브를 전극에 개 질화한 전기화학적 바이오센서가 개발되어 왔다.
이 절에서는 Maehashi[4]가 최근 보고한 화학기상 증착법에 의해 Pt 표면에 직접 합성되고 배열된 탄소나노튜브 전극을 기반으로 한 전기화학적인 바이오센서를 소개하고자 한다(Figure 1). 이러한 방법으로 전극을 구성한 결과 탄소나노튜브가 처 리되지 않은 금속전극과 비교했을 때 워킹전극의 총 표면적이 훨씬 증가하였다. Figure 2는 이렇게 만들어진 전극을 전기화학적인 측정법을 적용한 전극 시스템 모식도이다. 탄소나노튜브가 고정화 된 전극, Pt 전극, Ag/AgCl은 working, counter, reference 전극으로 각각 사용되었다(Figure 2(a)).
이렇게 만들어진 바이오센서의 전기화학적인 특 성은 K3[Fe(CN)6]와 전기활성 아미노산(electro- active amino acids)을 이용하여 조사되었다[5,6].
적 신호는 DPV를 이용하여 탄소나노튜브 전극으로부터 얻 어졌다. 점선은 PSA 모노클로날 항체를 흘려주었을 때 신 호이고, 실선은 1 ng/mL의 PSA 항원을 흘려주었을 때 얻어 진 신호이다[4].
이렇게 제조된 탄소나노튜브 전극기반 바이오 센서는 전립선암 바이오마커인 PSA의 검출을 시 도하였다. 먼저 탄소나노튜브 표면에 1-pyrenebu- tanoic acid succinimidyl ester를 이용하여 개질하 고 PSA 모노클로날 항체를 고정화하였다. Figure 3(b)는 differential pulse voltammetry (DPV)를 이 용하여 탄소나노튜브 전극의 PSA 단백질의 전기 화학적 신호를 보여준다. 전기화학적인 신호는 PSA 항체만 고정화하였을 경우에는 +0.5 V에서 얻어졌고, 농도가 1 ng/mL PSA 단백질을 탄소나 노튜브 전극위에 도입했을 때는 전기화학적 전류 신호가 급격히 증가하였다. 또한 bovine serum albumin을 이용한 바이오센서의 비특이적 흡착에 대해서도 별 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
이렇게 탄소나노튜브를 이용하여 전극으로 만들 어진 바이오센서는 검출 영역이 1 ng/mL 이하로 서 PSA와 같은 전립선암 진단에도 이용될 수 있 고, 나아가 고집적 멀티검출 바이오센서의 제작도 가능할 것으로 기대된다.
3. 탄소나노튜브 기반 전계방출효과 트랜지스 터(CNT-FET) 바이오센서
3.1. CNT-FET의 구조 및 동작 원리
탄소나노튜브를 이용한 전계효과 트랜지스터 (field-effect transistor)는 이미 많은 실험과 보고가
Figure 3. CNT-FET 소자 사진. (a) CNT-FET 나노플랫폼, (b) 금전극이 패터닝된 CNT-FET 소자 사진, (c) 금전극 사이에 고정화된 탄소나노튜브 사진.
이루어졌다. 탄소나노튜브를 이용한 전계효과 트 랜지스터는 탄소나노튜브 양단에 금속 전극을 붙 이고 Si 기판을 gate로 사용하는 단순한 구조이다.
대표적인 방법으로는 gate 지배력을 높이기 위해 탄소나노튜브 위에 gate 전극을 붙이는 방법(top gate)과 나노튜브 좌우에 gate 전극을 붙이는 방법 (side gate), 나노튜브를 수직으로 교차시켜서 그 중 하나를 gate로 이용하는 방법 등 다양한 방법들 이 사용되고 있다. 탄소나노튜브를 트랜지스터 제 조에 이용하면 현재의 실리콘 소자보다 집적도가 높고, 작동속도가 100배 가량 빠른 트랜지스터를 얻을 수 있다. 또 많은 연구진에 의해서 탄소나노 튜브를 이용한 전계효과 트랜지스터의 우수한 성 능을 확인하였고, 기존의 실리콘 전계효과 트랜지 스터와 비교할 때 매우 우수하고 독특한 성능을 나타냈다. 특히 탄소나노튜브를 이용한 트랜지스 터 개발은 다양한 생물분자를 이용하여 생리인식 현상 및 생리활성 과정을 측정하는 나노장치로 응 용이 되고 있다[7-9].
일반적인 트랜지스터의 경우 소스와 드레인 전 극사이의 채널의 전류는 제 3의 게이트 전극에 의 해 조절되는 반면, 탄소나노튜브 트랜지스터의 경 우에는 감지하고자 하는 화학물질이나 차지를 띤 분자들이 전류의 흐름을 조절하게 된다. 즉, 탄소 나노튜브 표면에 기체분자나 바이오분자가 흡착 되게 되면 전하의 고갈이나 축적이 일어나게 되고 이는 나노튜브 소자에서 전기전도도의 변화로 나
타나게 된다. 탄소나노튜브는 일반적으로 p형 반 도체로 작동하므로 양의 게이트 전압, 이 경우에 는 양의 전하를 띤 단백질 흡착으로 인해 전기 전 도도가 감소하게 된다. 여기서 개발된 바이오센서 로의 응용을 위한 탄소나노튜브 전계효과트랜지 스터(CNT-FET) 플랫폼은 실리콘 기판 위에 자기 조립방법에 의해 탄소나노튜브를 고정화한 후 나 노튜브사이에 금 전극을 붙이고 Figure 3에서처럼 제작되었다[10]. 일반적인 트랜지스터의 경우 소 스와 드레인 전극사이의 채널의 전류는 제 3의 게 이트 전극에 의해 조절되는 반면, 탄소나노튜브 트랜지스터의 경우에는 감지하고자 하는 화학물 질이나 차지를 띤 분자들이 전류의 흐름을 조절하 게 된다. 즉, 탄소나노튜브 표면에 기체분자나 바 이오분자가 흡착되게 되면 전하의 고갈이나 축적 이 일어나게 되고 이는 나노튜브 소자에서 전기전 도도의 변화로 나타나게 된다.
3.2. Debye-length
나노미터 크기의 동공이 기존의 전기화학에 가 지는 의미는 그동안 특별히 주목받지 못해왔다.
과거 주로 연구되었던 다공성 물질들이 대부분 나 노미터 보다는 훨씬 더 큰 크기의 동공 구조들을 가졌기 때문이다. 전해질이 존재하는 용액 속에 도체 전극이 담겨 있을 때 전극과 용액 사이에 전 위차가 걸리면 전기적 이중층이 형성되고 전기적 포텐셜은 이 근처에서 주로 변화된다. Gouy와 Chap-
Figure 4. 탄소나노튜브 표면에서 일어나는 Debye length 개념도(K-1= 0.32 × I-1/2).
man, Stern의 고전적인 모델에 따르면 전극에 일 정한 전위차가 걸려 있으면 Figure 4와 같이 전해 질이 분포하고 전극 표면으로부터의 거리에 따라 포텐셜이 변화한다. 흔히 걸린 전위차의 67%만큼 떨어지게 되는 위치와 전극 사이의 거리를 특이 길이(characteristic length) 또는 Debye 길이(Debye length, κ-1)라고 하는데 진한 전해질 수용액에서 약 2∼3 nm 가량 된다. Debye 길이는 용액 중의 전해질 농도와 긴밀한 함수 관계가 있어서 전해질 농도가 낮아짐에 따라 점점 길어진다[11,12]. 즉 나노 물질을 사용함으로써 새로운 변수가 나타나 게 되었다고 볼 수 있다.
이렇듯 CNT-FET 기반 바이오센서는 버퍼 용액 내에서의 Debye length와 밀접한 상관관계가 있 다. 따라서 탄소나노튜브 트랜지스터 센서에서 표 적물질을 검출하기 위해서는 탄소나노튜브에 고 정화 하는 리셉터의 크기가 작아야 한다. 일반적 으로 표적물질 검출에 쓰이는 항체들은 10∼15 nm 의 크기를 갖는다. 이는 일반적으로 10 mM 이온 농도에서 약 3 nm의 디바이 길이를 갖는데 이를 훨씬 초과하게 된다. 따라서 표적 물질과의 반응 을 쉽게 감지하지 못해 민감도가 떨어지게 되고, 심지어는 전혀 검출할 수 없기 때문에 표적물질에
Figure 5. 항체와 압타머의 크기 비교.
대한 리셉터의 크기는 아주 작아야만 한다. 이러 한 이유 때문에 현재 탄소나노튜브 트랜지스터 센 서에 표적물질 검출을 고정화 하는 리셉터를 압타 머와 같이 크기가 작은 물질을 사용하고 있다.
3.3. 압타머 기반 CNT-FET 바이오센서 압타머 (Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조 를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으 로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 “fitting”의 의미 를 가지는 라틴어 “aptus”에서 그 어원이 유래했 다. 압타머는 화학적으로 대향 합성이 가능하므로 경제성이 우수하고, 항체에 버금가는 표적 친화력 을 가지고 있고, 항체에 비해 크기가 월등히 작기 때문(약 1∼2 nm)에 CNT-FET 바이오센서에 리 셉터로 이용되었을 경우 debye length 내에서 표 적물질과의 반응을 일으킬 수 있어 매우 유용하게 이용될 수 있다(Figure 5).
압타머를 분자인식물질로 이용한 탄소 나노튜 브센서는 2005년 한국화학연구원에서 최초로 보 고하였다[13]. 기판에 직접 성장된 탄소 나노튜브 에 포토리소그라피를 이용하여 전극과 절연층을 형성하였고, 탄소 나노튜브의 표면에 표적물질인 트롬빈을 검출하기 위하여 CDI-Tween 20을 링커 물질로 사용하였다. 트롬빈 압타머가 고정화된 CNT-FET에 트롬빈을 반응시키면 즉시 전기 전도
Figure 6. CNT-FET 기반 비표지 단백질 센서 모식도: (a) 항체로 개질된 CNT-FET, (b) 압타머로 개질된 CNT-FET.
도의 감소가 관찰된다. 이것은 핵산 기반인 압타 머의 인산기가 가진 음전하를 트롬빈이 상쇄하므 로 생기는 효과로 생각될 수 있다. 또한 트롬빈 압 타머로 기능화된 CNT-FET 센서는 트롬빈의 동종 단백질인 엘라스타제에는 거의 반응을 보이지 않 아 선택성도 우수함을 볼 수 있었다. 거기에, 안정 성 및 가역성이 뛰어난 압타머의 장점을 살려, 6 M의 guanidine hydrochloride 용액에 담가 트롬빈 을 제거하여 5회 동안 센서가 재사용이 가능하다 는 것을 보였다. 센서의 검출한계는 약 10 nM로 관측되었다.
이렇게 작은 크기를 가진 압타머가 CNT-FET 바이오센서에서 리셉터로서 항체보다 매우 효과 적임을 2007년 Maehashi 연구진에 의해 증명되었 다(Figure 6)[14]. 그들은 IgE 압타머와 IgE 항체 를 각각 고정화 한 CNT-FET를 제작하여 10 mM phosphate buffered saline (PBS)에 용해된 타겟 IgE에 대한 반응을 관찰하였다. IgE 항체가 고정 화된 CNT-FET 센서의 경우에는 140 nM의 타겟 농도에도 별다른 반응이 관측되지 않은 반면, 압 타머가 고정화된 CNT-FET는 250 pM의 타겟 농 도에서도 전기 전도도의 변화가 관측되었다. 이는 10 mM의 PBS 용액에서 드바이 길이가 약 3 nm 임을 고려할 때, 길이가 약 10 nm 이상인 항원-항 체 반응의 센싱 민감도는 떨어지지만, 보다 짧은 압타머의 경우에는 반응이 드바이 길이 내부에서
일어나기 때문에 센싱 민감도가 훨씬 증가함을 보 여준다.
3.4. 항체단편 기반 CNT-FET 바이오센서 4.3에서 언급한 압타머는 CNT-FET 바이오센서 에 굉장히 유용한 리셉터임에는 틀림이 없다. 하 지만 현재까지 많은 질병 진단물질들에 대해 모든 압타머가 개발되어 있는 것이 아니기 때문에 리셉 터로 이용할 대체 물질이 필요하고, 새로운 리셉 터의 개발이 시급하다. 따라서 Debye length 내에 서의 반응을 일으키기 위해 우리 연구팀에서는 항 체를 여러 효소를 사용하여 절단한 항체 단편들을 리셉터로서 도입하였다.
일반적으로 항체의 모양은 Y자 형태로서 효소 를 이용하여 절단이 가능한데, 이들 중 한 조각은 항원과 결합하며, 다른 조각은 항원과 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 항원과 결합할 수 있는 조각을 Fab (antibody binding fragment)라고 부르 며, 항원과 결합하지 못하는 조각을 Fc (crystali- zable fragment)라고 부른다. 한 분자의 항체를 절 단하였을 때, 두 분자의 Fab가 얻어지며, 각각의 Fab는 모두 독립적으로 항원과 결합할 수 있으며, 그 결합성이 서로 같은 것으로 확인되었다. 이렇 게 단백질 절단 효소로 항체를 절단하여 필요없는 부위는 버리고, 항원과 반응하는 Fab만을 이용하 여 리셉터의 크기를 효과적으로 줄일 수 있어 기
Figure 7. CNT-FET 바이오센서에서 탄소나노튜브에 리셉터로서 항체 단편들의 고정화 개념도. (a) 표적물질과 결합하는 전체 항체를 탄소나노튜브에 고정화 하여 표적물질을 검출한 경우, (b) F(ab')만을 탄소나노튜브에 고정화하여 표적물질을 검출한 경우, (c) Fab만을 탄소나노튜브에 고정화하여 표적물질을 검출한 경우.
존의 특이성이 아주 높은 항원-항체 반응을 통해 탄소나노튜브 트랜지스터 민감도를 극대화할 수 있었다[15].
앞에서도 이야기했듯이 CNT-FET 바이오센서 에서 바이오분자를 검출하기 위해서는 Debye length 내에서의 면역 반응이 일어나야 한다. 그러나 기 존의 항체는 이 Debye length보다 훨씬 크기 때문 에 좀더 작은 리셉터를 CNT-FET 바이오센서에 적용하기 위해 효소를 이용하여 항체 절단을 시도 했다. 먼저 탄소나노튜브 표면에 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester를 이용하여 자기조립 단분 자층을 형성하고, 효소 처리되지 않은 전체 항체 와 각종 효소로 절단한 항체 단편을 이용하여 탄 소나노튜브 표면에 고정화한 후, 표적물질과 반응 시켜 전기적 신호의 감소로 표적물질의 농도를 정 량화 했다.
위에 제시된 Figure 7은 항체 단편들을 이용하 여 탄소나노튜브 표면에 고정화하여 극소량의 표 적물질을 검출해 내는 탄소나노튜브 트랜지스터 바이오센서를 나타내는 개념도이다. 일반적으로 탄소나노튜브 트랜지스터 센서의 원리는 표적물 질과 결합하는 물질을 탄소나노튜브 표면에 고정 화 하여 표적물질을 떨어뜨려 전기적 신호의 변화 를 관찰하게 된다. Figure 7의 (a)는 표적물질과 결 합하는 전체 항체를 탄소나노튜브에 고정화하여
표적물질을 검출한 경우이고, (b)는 F(ab')만을 탄 소나노튜브에 고정화하여 표적물질을 검출한 경 우, (c)는 Fab만을 탄소나노튜브에 고정화 하여 표 적물질을 검출한 경우이다. 이러한 방법으로 CNT- FET 바이오센서의 민감도를 테스트하였다.
위와 같은 방법의 한계를 극복하기 위해 papain 으로 온전한 항체를 잘라 더 작은 사이즈인 Fab을 만들고, 이를 이용하여 탄소나노튜브에 가)에서 보여준 동일한 방법으로 고정화하였다. 그리고 human IgG를 농도별로 100 fg/mL부터 1 ng/mL 까지 탄소나노튜브 트랜지스터 채널에 떨어뜨려 반응시켰다(Figure 11). 이 때 소스와 드레인 사이 의 전류 변화를 측정하였는데 human IgG 100 fg/mL 를 반응시켰을 때에는 전기적 신호의 증감범위가 넓었으나 전체적으로 전류가 컨트롤보다 약간 증 가하였고, 1 pg/mL 이상의 농도를 흘려주었을 때 전류가 농도가 증가함에 따라 점점 더 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 1000 pg/mL의 농 도에서는 그 감소폭이 더 이상 증가되지 않았다.
이것은 고정되어 있는 리셉터가 이미 모두 표적 물질과 치환되었기 때문이라고 사료된다. 이러한 결과들로 인해 Fab를 고정화한 CNT-FET 바이오 센서는 직선 구간인 1에서 100 pg/mL의 dynamic range를 갖게 되고 검출 최소 농도는 1 pg/mL임을 알 수 있었다. 이렇게 anti-human IgG의 Fab를 탄
Silicon Au
Silicon Silicon
C O O N O
O 1-Pyrenebutanoic acid, Succinimidyl Ester
OH
1-pyrenebutanol
OH OH OH OH OH OH OH OH OH
(c)
(e)
(d)
Figure 8. 링커와 스페이서를 이용한 탄소나노튜브 표면 디자인 개념도. (a) 단지 링커만 고정한 경우; (b) 링커 : 스페이서
= 1 : 1; (c) 링커 : 스페이서 = 1 : 3; (d) 링커 : 스페이서 = 1 : 9; (e) 단지 스페이서만 고정한 경우.
소나노튜브에 고정화시켜서 표적물질인 human IgG를 검출 하였을 때, 나)의 경우처럼 anti-human IgG F(ab')2부위를 고정시킨 것보다 검출한계가 1 pg/mL로 1000배나 높아졌음을 알 수 있었다. 또 한 온전한 anti-human IgG 항체를 고정화한 것과 비교했을 때는 그 민감도가 무려 106배나 증가했 다. 이같은 전략으로 탄소나노튜브 트랜지스터 센 서에서 항체 단편을 이용하는 것은 Debye length 내에서의 반응을 유도하게 되어 기존의 표적물질 검출 방법보다 검출 한계를 훨씬 증가시켜 극미량 의 표적물질을 검출해야 하는 의료용 진단 센서로 의 활용을 가능하게 해주었다.
따라서 이러한 방법은 특정 물질을 펨토몰 수준 까지 검출할 수 있는 방법으로써 기존의 탄소나노 튜브 트랜지스터 센서의 검출한계를 훨씬 더 낮출 수 있으므로 극미량의 표적물질도 검출 가능하여 암진단, 알러지진단 및 다른 단백질 검출 기반 질 병진단용 센서로 이용이 가능한 분석방법이 될 것 이다.
3.5. 탄소나노튜브 표면 디자인을 이용한 CNT- FET 바이오센서
최근 본 연구팀에서 탄소나노튜브 트랜지스터 센서에 항체를 절단한 항체 단편들을 리셉터로 이
용하여 센서 민감도를 낮추는 방법이 개발되었다.
그러나 이는 탄소나노튜브 트랜지스터 센서의 표 면개질 시 항체를 효소로 절단하는 공정, 스크리 닝하는 공정 등을 거쳐야 하는 불편함이 있다. 따 라서 우리는 이러한 공정을 최소화하기 위해 탄소 나노튜브의 표면을 스페이서와 링커를 혼합하여 적정비율로 개질한 후 항체를 고정화 하여 전립선 암 진단지표자인 PSA-ACT를 검출하는 방법을 개 발하였다[16].
먼저 탄소나노튜브 표면에 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester (링커)와 1-pyrenebutanol (스페이서)를 적절한 비율(1 : 1, 1 : 3, 1 : 9)로 이 용하여 자기조립 단분자층(self assembled mono- layer)을 형성하고, 효소 처리되지 않은 전체 항체 를 이용하여 탄소나노튜브 표면에 형성된 단분자 층에 고정화한 후, 표적물질과 반응시켜 전기적 신호의 감소로 표적물질의 농도를 정량화하였다.
Figure 8은 본 발명에 따른 탄소나노튜브 표면 의 디자인으로써 링커와 스페이서를 적절한 비율 로 탄소나노튜브 표면에 고정화하여 극소량의 표 적물질을 검출해 내는 탄소나노튜브 트랜지스터 바이오센서를 나타내는 개념도이다. Figure 8의 Suface A는 스페이서 없이 링커인 1-pyrenebuta- noic acid, succinimidyl ester만을 탄소나노튜브에
Figure 9. PSA-ACT 농도에 따른 전기적 신호. (a) 단지 링커만 고정한 경우; (b) 링커 : 스페이서 = 1 : 1; (c) 링커 : 스페이서
= 1 : 3; (d) 링커 : 스페이서 = 1 : 9로 고정한 경우(J. P., Kim, S. J., Sim, et al., Biosens. Bioelectron., 24, 3376 (2009)).
고정화한 경우이고, Surface B는 링커와 스페이서 를 1 : 1 비율로 혼합하여 탄소나노튜브에 고정화 한 경우이고, Surface C는 링커와 스페이서를 1 : 3 비율로 혼합하여 탄소나노튜브에 고정화한 경 우이고, Surface D는 링커와 스페이서를 1 : 9 비 율로 혼합하여 탄소나노튜브에 고정화한 경우이 고, Suface E는 링커 없이 스페이서인 1-pyrene- butanol만을 탄소나노튜브에 고정화한 경우이다.
이렇게 스페이서의 도입으로 탄소나노튜브 표면 의 리셉터 간격을 조절함으로써 타겟물질의 접근 성을 용이하게 하고, 원형그대로의 항체를 이용하 더라도 Debye length 내에서 면역반응을 일으킬 수 있게 된다.
탄소나노튜브 트랜지스터의 채널영역을 이루고 있는 그물망형 탄소나노튜브의 표면에 링커인 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester (1 mM)
와 스페이서인 1-pyrenebutanol (1 mM)을 1 : 1, 1 : 3, 1 : 9 비율로 혼합하여 탄소나노튜브 표면에 단분자층을 형성하였다. 그 후 메탄올로 탄소나노 튜브 트랜지스터 센서의 채널부위를 씻어내고, PSA-ACT complex 항체(20 µg/mL)를 고정화시 켰다. 그 후 다시 PBS buffer로 수차례 씻어주었 다. 그리고 질소가스로 건조 후 1∼1000 ng/mL 농 도의 PSA-ACT를 반응시켜 탄소나노튜브 트랜지 스터 센서의 전류 특성을 측정하였다.
우선 탄소나노튜브 표면에 링커만 고정화 하였 을 때, FIgure 9(a)와 같이 PSA-ACT 500 ng/mL 을 떨어뜨려 주어도 시그날의 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 이는 온전한 형태의 항체는 CNT-FET 바이오센서에서 센싱 민감도가 떨어짐을 의미한다.
다음으로 링커와 스페이서 비율이 1 : 1 표면에 서의 표적물질 검출을 시도하였다. Figure 9(b)와
게 된다. 또 다른 암지표 물질도 정상범위가 10 ng/mL 이하이기 때문에 탄소나노튜브 트랜지스터 바이오센서를 이용하여 질병진단을 하기 위해서 는 검출 한계가 더 낮아야만 한다. 따라서 이러한 검출 한계는 수 ng/mL 농도의 표적물질을 검출해 야 하는 질병 진단 센서로서 사용하는 것은 불가능 하다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해 스페이서의 비율을 더 증가시켜 상대적으로 리셉터들 간의 간 격을 늘려주었다. 또 Figure 9(c)와 같이 링커와 스 페이서의 비율이 1 : 3으로 고정화된 CNT-FET 센 서에 표적물질인 PSA-ACT complex를 100 pg/mL 부터 1000 ng/ml까지 반응시켜 보았다. 이 때 소 스와 드레인 사이의 전류 변화를 측정하였는데 PSA-ACT complex 100 pg/mL를 반응시켰을 때 에는 버퍼만 흘려준 컨트롤처럼 어떤 전류 변화를 관찰할 수 없었고, 1 ng/mL 이상의 농도를 흘려주 었을 때 전류가 농도에 따라 점점 더 증가하는 것 을 확인할 수 있었다. 그러나 1000 pg/mL을 흘려 주었을 때는 농도가 100 pg/mL보다 열배가 높아 졌음에도 불구하고 전류가 100 pg/mL보다 증가되 지 않았다. 이렇게 탄소나노튜브의 표면에 링커와 스페이서의 비율을 1 : 3으로 디자인한 후, 표적물 질인 PSA-ACT complex를 검출하였을 때, 링커와 스페이서를 1 : 1로 고정시킨 것보다 검출한계가 1 ng/mL로 훨씬 낮아졌음을 알 수 있었다. 이처럼 탄소나노튜브의 표면 디자인을 어떻게 하느냐에 따라 센서의 민감도를 훨씬 낮출 수 있었다. 또한 스페이서의 양을 조절하여 검출한계를 더 낮출 수 있는지 알아보기 위해 링커와 스페이스의 비율을 1 : 9로 혼합하여 탄소나노튜브 표면에 고정화하였 다. 그리고 PSA-ACT complex를 농도별로 100
100 ng/mL 이상일 때는 전류의 증가량이 더 커져 야 함에도 불구하고 변화가 거의 없었다. 이것은 이미 50 ng/mL에서 CNT-FET 바이오센서가 포화 상태에 도달함을 알 수 있었다.
우리는 위의 결과에서 보여준 것과 같이 링커와 스페이서의 비율에 따라 CNT-FET 센서의 민감도 가 변하는 것을 확인할 수 있었다. 링커와 스페이 서의 비율이 1 : 1로 고정화되었을 때는 최소검출 한계가 500 ng/mL이었고, 비율이 1 : 3으로 고정 화 되었을 때는 최소검출한계가 1 ng/mL로 훨씬 낮게 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 비 율이 1 : 9로 고정화되었을 때는 1 : 3과 같이 최소 검출 한계는 1 ng/mL이었지만 검출농도범위가 1 : 3 표면보다는 더 좁아진다. 이는 1 : 3 표면보다 리셉터의 수가 감소하기 때문인 것으로 사료된다.
이렇게 적절한 스페이서의 활용으로 리셉터들 사 이에 공간이 생겨 단백질들 간의 입체장애를 감소 시키기 때문에 목표물질의 탄소나노튜브 근처로 접근성을 향상시켜 센서의 민감도를 증가시킬 수 있다. 또한 탄소나노튜브 표면의 링커와 스페이스 를 이용한 디자인의 가장 큰 장점은 개발된 항체 의 원형 그대로 사용 시에도 센서에 필요한 민감 도(최소 검출 한계값)를 얻을 수 있다는 것이다.
따라서 이러한 발명은 리셉터의 크기가 커도 저 농도의 표적물질을 검출할 수 있도록 민감도를 증 가시킬 수 있다. 따라서 이러한 방법은 특정 물질 을 펨토몰 수준까지 검출할 수 있는 방법으로써 기존의 탄소나노튜브 트랜지스터 센서의 검출한 계를 훨씬 더 낮출 수 있으므로 극미량의 표적물 질도 검출 가능하여 암진단, 알러지진단 및 다른 단백질 검출 기반 질병진단용 센서로 이용이 가능 한 분석방법이 될 것이다.
심 상 준
1988 서울대학교 학사 1990 KAIST 석사 1994 KAIST 박사 1996 MIT post-doc 현재 성균관대학교 부교수
김 준 표
2003 성균관대학교 학사 2005 성균관대학교 석사 2010 성균관대학교 박사 현재 (주)바이오니아
를 바이오센서 소자로서 이용 시에는 탄소나노튜 브 표면의 나노미터 수준의 계면에서 발생하는 것 으로, 이 바이오센서의 감지 원리를 이해하고 더 나은 기능의 센서를 제시하기 위해서는 나노 수준 에서 계면 현상을 이해하는 것이 필수적이다. 또 한 이러한 계면영역에서의 면역반응과 센싱 민감 도 증가 연구뿐만 아니라 탄소나노튜브 소자의 특 성 표준화, 정량분석 등 해결해야 할 과제가 많이 남아 있다. 이러한 것들만 조속히 해결된다면 질병 의 조기진단, 실시간 진단, 현장진단 등 의료 진단 분야의 기술을 크게 앞당길 수 있다고 전망된다.
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