손바닥선인장 주정 추출물의 항염증 및 신경보호 효과와 비타민 C와의 병용 효과
김주연․임미경 고려은단 R&D부
Anti-Inflammatory and Neuroprotective Effects of Opuntia ficus-indica var.
saboten Alone or Combined with Vitamin C
Ju Yeon Kim and Mi Kyung Lim R&D Center, Koreaeundan Co.
ABSTRACT Opuntia ficus-indica var. saboten has long been known as a medicinal plant on Jeju Island in Korea for treatment of diabetes, asthma, burns, and dyspepsia. Although Opuntia ficus-indica var. saboten has been reported to have analgesic and anti-inflammatory effects in several studies, its mode of action has not been clearly described.
In this study, we investigated the neuroprotective effects of ethanolic extract of Opuntia ficus-indica var. saboten (EOFS) on neuronal inflammation in vitro. We verified the nitric oxide levels and the decreased levels of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression to assess its effects on inflammation in macrophage cells. We also performed an acetylcholinesterase (AChE) activity assay to validate the AChE inhibitory effects of EOFS. In addition, a cellular viability assay was performed to confirm the protective effects of EOFS against β-amyloid-induced neurotoxicity. We found increased levels of cAMP response element-binding protein and brain-derived neurotrophic factor expression upon evaluation of the regulation of synaptic plasticity by EOFS in SH-SY5Y neuroblastoma cells.
Furthermore, we verified the synergistic effects of combined treatment with EOFS and vitamin C. Consequently, these results suggest that EOFS could be used as a source of functional materials to improve the cognitive function generated by anti-inflammatory response, AChE inhibition, cellular protection, and regulation of synaptic plasticity.
Key words: Opuntia ficus-indica var. saboten, vitamin C, anti-inflammation, acetylcholinesterase, synaptic plasticity
Received 27 February 2019; Accepted 16 May 2019
Corresponding author: Mi Kyung Lim, R&D Center, Koreaeundan Co., Seongnam, Gyeonggi 13207, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-31-743-1155
서 론
치매(dementia)는 의학의 발달로 평균수명이 늘어나면 서 나타나는 대표적인 노인성 질환 중 하나이다. 특히 65세 이상의 치매환자 중 약 60%가 알츠하이머병(Alzheimer’s disease)으로 치매가 유발되며, 정확한 원인은 밝혀져 있지 않지만 베타 아밀로이드(Aβ)에 의한 노인성 신경반이나 신 경섬유 엉킴 형성이 지속해서 일어남에 따라 발생한다고 보 고되고 있다(Blennow 등, 2006). 또한, 콜린성 신경전달물 질인 아세틸콜린(acetylcholine, ACh) 생성 및 분비 시스템 의 기능 저하는 노인성 치매와 관련이 깊다(Power 등, 2003).
이를 토대로 ACh을 분해하는 효소인 아세틸콜린에스테라 아제(acetylcholinesterase, AChE)의 활성을 억제하여 ACh 의 활성을 향상하는 약물이 개발되어 있으며, donepezil, rivastigmine, galantamine 등이 있다(Shintani와 Uchida,
1997). 이러한 약물들은 경증 노인성 치매 환자에서 치료 가 능성을 보여주었지만 메스꺼움, 구토, 설사와 같은 여러 부 작용이 보고되고 있다(Farlow 등, 2011). 더불어 신경염증 반응을 억제하는 것은 노인성 치매, 파킨슨병과 같은 신경퇴 행성 질환의 치료에 도움이 된다고 알려져 있다(Aldridge 등, 2008). 따라서 노인성 치매 치료 및 예방을 위한 부작용 이 적으면서 우수한 AChE 저해 활성과 항염증 효능을 가지 는 소재의 개발이 필요하다.
손바닥선인장(Opuntia ficus-indica)은 선인장과(Cac- taceae)에 속하는 열대성 식물로 우리나라의 제주도 등지에 서 자생하고 있는 귀화식물이며 백년초라는 이름으로 널리 알려져 있다. 예로부터 열매와 줄기의 다양한 효능에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 손바닥선인장 주정 추출물은 항 염증에 대한 효과(Park 등, 1998)를 가지고 있으며, 그 외에 도 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 동물모델에서 혈당 및 지질대사 개선에 효능을 가지는 것으로 알려져 있다 (Yoon과 Son, 2009). 열매의 발효액은 자궁경부암 세포인 SiHa와 CaSki 세포 성장을 억제하는 것으로 보고되어 있으 며(Choi 등, 2005), 열매 종자의 경우 동물모델에서 HDL-
콜레스테롤 증가와 LDL-콜레스테롤 감소가 관찰되었다 (Ennouri 등, 2006). 또한 선행 연구로 손바닥선인장 70%
주정 추출물의 지표성분을 dihydrokaempferol로 선정하였 으며, 스코폴라민으로 인지기능 저해를 유도한 동물모델에 서 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 의한 행동지표가 개선 됨과 뇌조직에서의 AChE 활성 저해, 단백질 발현 조절 기전 을 밝혀 인지 개선 효능에 대한 가능성을 보고하였다(Kwon 등, 2018).
본 연구에서는 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 지표성 분인 dihydrokaempferol의 항염증 활성(Lee 등, 2013)과 만성 염증성 과정의 중화로 인지기능의 저하 가속화를 예방 할 수 있다는 가능성(Kuszewski 등, 2018)을 제시한 보고 및 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 in vivo 모델에서 신경 전달물질 및 시냅스 가소성 조절(Kwon 등, 2018)을 보고한 선행 연구를 기반으로 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 인 지 개선 효능이 신경염증, 신경전달물질 및 시냅스 가소성 조절에 의한 것이라는 가설을 세웠다. 또한 Aβ는 과산화수 소와 같은 reactive oxygen species(ROS) 생성에도 관여 하는 것으로 알려져 있으며(Hewitt와 Rauk, 2009), 산화스 트레스로 인해 뇌는 세포막 손상, 신경세포 사멸과 관련되는 신경 퇴행성 변화를 일으킬 수 있다(Lee 등, 2008a). 따라서 항산화 물질로 알려진 비타민 C와 손바닥선인장 70% 주정 추출물을 병용 처리하여 인지 개선에 대한 상승효과를 평가 하였다.
먼저 마우스 유래 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하 여 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 의한 염증매개물질인 nitric oxide(NO)의 소거능과 신경염증 관련 인자들의 발현 확인을 통해 항염증 효능을 검증하였다. 또한 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 의한 AChE 저해 활성을 검색하였다.
더불어 인간 유래 신경세포인 SH-SY5Y를 이용하여 손바닥 선인장 70% 주정 추출물에 의한 신경세포 보호 효과 및 시 냅스 가소성 관련 인자들의 발현을 확인하였다. 동시에 손바 닥선인장과 비타민 C 복합물에 대한 항염증 및 인지 개선 효능을 확인하고자 했다.
재료 및 방법
추출물 제조
제주도에서 수확한 손바닥선인장의 줄기를 잘게 자른 후 건조하여 분말화하였다. 손바닥선인장을 건조한 분말 160 kg을 80°C에서 2시간 동안 70% 주정 2,400 L로 추출하였 다. 15~20 Brix로 농축하여 추출물을 여과했으며 고형물과 같은 양의 덱스트린을 첨가하여 95°C에서 1시간 동안 고압 멸균하고 건조하였다. 건조한 분말을 60 mesh의 표준망체 에 내려 손바닥선인장 70% 주정 추출물(EOFS)로 사용하였 다(Kwon 등, 2018).
시약 및 항체
비타민 C 및 lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Amyloid be-
ta25-35(Aβ)는 Bachem AG(Bubendorf, Switzerland)에서
구입하였다.
Anti-iNOS는 Novus Biologicals, Inc.(Littleton, CO, USA), anti-COX-2, anti-p-CREB(cAMP-response el- ement binding protein), anti-CREB는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA), anti-BDNF(brain-de- rived neurotrophic factor)는 AbCam(Cambridge, UK), anti-β-actin, anti-rabbit-HRP-IgG, anti-mouse-HRP- IgG는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
세포배양
SH-SY5Y, RAW264.7 세포는 각각 고려대학교와 세종 대학교에서 분양받아 사용하였다. 모든 세포는 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin 및 streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco BRL., Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건 에서 배양하였다.
MTT assay를 통한 세포생존율 측정
시료에 대한 세포생존율을 평가하기 위해 3-(4,5-di- methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich Co.) 시험법으로 측정하였다. 96- well plate(Corning Inc., Corning, NY, USA)에 1×104 cells/well로 동일하게 분주하여 RAW264.7 세포는 24시 간, SH-SY5Y 세포는 48시간 동안 배양하였다. 시료들을 각 조건에 따라 처리한 후 5 mg/mL MTT 시약을 10 μL 가하여 37°C에서 4시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고 dimethyl sulfoxide(Dae Jung Chemical & Metal Co., Ltd., Siheung, Korea) 100 μL로 생성된 formazan을 녹인 후 마이크로플레이트 리더기(BioTek Co., Winooski, VT, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계 산하였다.
NO 생성량 측정
NO 생성량을 측정하기 위해 Griess 방법(Green 등, 1982) 에 따라 실험을 진행하였다. 24-well plate에 RAW264.7 세포를 1×105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하 였다. 24시간 후 손바닥선인장 70% 주정 추출물을 125, 250, 500 및 1,000 μg/mL의 농도로 처리하였으며, 비타민 C 100 μg/mL를 복합처리 하였다. 시험물질을 처리한 후 2시간째에 LPS 1 μg/mL를 처리하여 24시간 동안 배양하였 다. 상등액을 4°C에서 3,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 Griess reagent와 1:1로 섞어 15분간 상온에서 반응시 켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 sodium
EOFS
0 50 100 150
Relative cell viability . (% of control) .
EOFS (μg/mL) - 125 250 500 1000
A
EOFS+Vitamin C
0 50 100 150
Relative cell viability . (% of control) .
B
EOPS (μg/mL) - 125 250 500 1000 - Vitamin C (μg/mL) - 100 100 100 100 100
Fig. 1. Non-cytotoxicity of EOFS only and the combined treatment with vitamin C in RAW264.7 cell. (A) RAW264.7 cells (1×104 cells/well in 96-well plates) were treated with 0, 125, 250, 500 or 1,000 μg/mL EOFS for 24 h. (B) RAW264.7 cells (1×104 cells/
well in 96-well plates) were co-treated with 0, 125, 250, 500 or 1,000 μg/mL and 100 μg/mL vitamin C for 24 h. The MTT assay was performed to determine the cell viability. Values are expressed as mean±SD (n=3). EOFS, ethanolic extract of Opuntia ficus-indica var. saboten.
nitrate(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성하였으며, 흡 광도를 대입하여 NO 생성량을 산출하였다.
AChE 활성 측정
AChE 활성 측정은 Ellman 법(Ellman 등, 1961)을 변형 하여 사용하였다. 96-well plate에 100 mM sodium phos- phate buffer(pH 8.0), 손바닥선인장 70% 주정 추출물 또 는 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C 복합물, 0.2 U/mL AChE를 첨가하고 10분간 반응시켰다. 손바닥선인장 70% 주정 추출물은 10, 20, 30, 40, 50 및 60 mg/mL로 처리하였고 비타민 C의 경우 3 mg/mL로 처리하였다. 이후 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)와 acetylthiocholine iodide를 첨가하여 30분간 반응시키고 405 nm에서 흡광도 를 측정하였다. AChE 저해 활성은 아래의 식으로 계산하여 산출하였다.
AChE 저해
활성(%) ＝
(
1－ OD ODsample－ODblank)
×100vehicle sample－ODvehicle blank
Western blot
RAW264.7 세포는 6-well plate에 4×105 cells/well로 분주하여 24시간 배양하였다. 손바닥선인장 70% 주정 추출 물을 125, 250, 500 및 1,000 μg/mL의 농도로 처리하고 2시간이 지난 다음 LPS 1 μg/mL를 처리하였다.
SH-SY5Y 세포는 60 mm dish에 7×105 cells/well로 분 주하여 48시간 배양하였다. 손바닥선인장 70% 주정 추출물 을 12.5, 25, 50, 100 및 250 μg/mL의 농도로 처리하고 1시간이 지난 다음 Aβ 10 μM을 처리하였다.
시험물질 처리 후 24시간 배양한 다음 cell lysis buffer [150 mM NaCl, 50 mM Tris(pH 8.0), 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.01% SDS]로 단백질을 수 득한 후 SDS-PAGE에서 전기영동을 진행하였다. Polyvi- nylidenedifluoride 멤브레인을 이용하여 transfer를 진행
한 후, 5% skim milk로 1시간 blocking을 진행하였다. 멤브 레인을 각 1차 항체로 4°C, 16시간 동안 incubation을 진행 하였다. 이후 2차 항체로 상온에서 1시간 incubation 진행하 고, ECLTM Prime Western Blotting detection reagent kit(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)을 이용하여 밴드를 검출하였다. 정량은 Image J 분석 프로그램(NIH, Bethesda, MD, USA)을 사용하여 진행하였다.
통계분석
실험 결과는 독립적인 실험을 3번 반복하여 mean±SD로 나타내었다. 통계적 분석은 SigmaPlot 프로그램(v10.0, San Jose, CA, USA)으로 Student’s t-test를 실시하여, P 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
결과 및 고찰
RAW264.7 세포에서의 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C 세포독성 평가
손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C에 의한 세포 독성 구간을 확인하기 위해 마우스 유래 대식세포 RAW 264.7에 각각 시료를 처리하고 MTT assay를 진행하여 Fig. 1에 나타내었다.
손바닥선인장 70% 주정 추출물 처리 농도는 1,000 μg/
mL를 최대로 설정하고, 아래로 공비 2로 하여 3개의 농도군 을 설정하여 RAW264.7 세포에 처리하고 세포생존율을 측 정하였다. 손바닥선인장 70% 주정 추출물 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다. 세포생존율에 영향을 주지 않 는 조건에서 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 효과를 극대 화하기 위해 추후 실험은 1,000 μg/mL를 최대 농도로 설정 하여 진행하였다.
또한 손바닥선인장 70% 주정 추출물 125~1,000 μg/mL 와 비타민 C 100 μg/mL의 복합처리 시 세포생존율을 확인
EOFS
0 20 40 60 80 100 120
NO production (% of control) . ###
**
A
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000
Vitamin C
0 20 40 60 80 100 120
NO productio (% of control) .
B
###
*
***
** **
LPS (1 μg/mL) - + + + + + Vitamin C (μg/mL) - - 1 10 100 1000 EOFS+Vitamin C
0 20 40 60 80 100 120
NO productio (% of control) . #
*
** **
*
C
LPS (1 μg/mL) - + + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000 - Vitamin C (μg/mL) - - 100 100 100 100 100
Fig. 2. Effect of EOFS only and the combined treatment with vitamin C on LPS-induced nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cell. (A) RAW264.7 cells (1×105 cells/well in 24-well plates) were treated with 0, 125, 250, 500 or 1,000 μg/mL EOFS.
(B) RAW264.7 cells (1×105 cells/well in 24-well plates) were co-treated with 0, 125, 250, 500 or 1,000 μg/mL and 100 μg/mL vitamin C. The cells were incubated for 2 h, treated with 1 μg/
mL LPS, incubated for 24 h and were detected NO production.
Values are expressed as mean±SD (n=3). #P<0.05, ###P<0.001 vs. vehicle group; *P<0.05, **P<0.01 vs. LPS-induced group; sig- nificant differences between the treated group were evaluated us- ing the Student’s t-test. EOFS, ethanolic extract of Opuntia fi- cus-indica var. saboten; LPS, lipopolysaccharide.
하였고 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.
NO 생성량 측정
활성산소 중의 하나인 NO는 염증을 유발하여 신경퇴행성 뇌질환을 포함한 만성염증질환으로의 진행에 기여한다(Kim 등, 2013). 과도한 NO 생성에 의해 산화적 스트레스, 에너지 대사 장애, DNA 손상으로 세포사멸이 유도될 수 있으며, 낮 은 수준의 NO 증가도 계속되면 말초 신경 손상을 일으킬 수 있다고 알려져 있다(Heales 등, 1999; Zochodne와 Levy, 2005). 따라서 NO 조절에 의한 신경세포 손상 및 염증 억제 는 신경퇴행성 질환 치료 연구에서 중요한 기전으로 알려져 있다(Aldridge 등, 2008; Zochodne 등, 1997).
본 실험에서는 LPS로 염증을 유도한 RAW264.7 세포 모 델에서 손바닥선인장 70% 주정 추출물이 NO 생성량에 어 떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 Griess assay를 진행하 여 Fig. 2에 나타내었다. NO의 생성량은 sodium nitrate 0~50 μM 범위를 기준으로 표준곡선을 작성한 후 산출하였 다. 염증 유발대조군을 100%로 환산하여 분석한 결과 손바 닥선인장 70% 주정 추출물 1,000 μg/mL 처리 시 47.1%로 유발대조군 대비 통계적으로 유의하게 감소하였다(P<0.01).
위의 결과를 통해 손바닥선인장 70% 주정 추출물은 NO 생 성 억제에 관여함을 확인할 수 있었다. 본 연구와 유사한 in vitro 모델에서 dihydrokaempferol의 NO 소거능을 확인한 연구 결과(Lee 등, 2013)가 보고된바, 손바닥선인장 70%
주정 추출물의 NO 생성 억제는 지표성분인 dihydrokaemp-
ferol에 의한 것으로 사료된다. 비타민 C의 경우 1, 10, 100 및 1,000 μg/mL 처리 시 각각 84.2, 82.0, 78.2, 7.0%의 NO 생성량을 나타내었고, 세포생존율은 각각 98.6, 95.0, 89.9, 49.8%로 확인되었다(data not shown). 이를 통해 비 타민 100 μg/mL는 세포독성을 나타내지 않으며, 적절한 NO 소거능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 비타민 C는 여러 가지 생리학적 조건 아래 항염증 작용을 지닌다는 것이 알려 져 있으며(Grosso 등, 2013), 본 연구에서도 비타민 C에 의해 NO 생성량이 감소하였으므로 비타민 C의 항염증 효과 를 확인할 수 있었다.
위 결과를 토대로 손바닥선인장 70% 주정 추출물 125, 250, 500 및 1,000 μg/mL와 비타민 C 100 μg/mL를 복합처 리 하였더니 각각 56.7, 20.4, 14.7, 14.3%의 NO 생성량을 나타냈으며, 유발대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 감 소하였다(P<0.05, P<0.01). 더불어 손바닥선인장 70% 주 정 추출물 250, 500 μg/mL 및 비타민 C의 혼합처리 시 각각 의 단독처리 대비 52.7, 42.7%의 NO 소거능이 증가하였으 므로 상승효과가 나타남을 확인할 수 있었다. 손바닥선인장 70% 주정 추출물 단독처리 시에는 고용량에서 효능을 확인 할 수 있었으나, 비타민 C와 병용처리 시에는 상승효과로 인해 저용량의 EOFS에서도 상당한 효능이 있음을 입증하 였다. 결론적으로 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 단독처 리뿐만 아니라 비타민 C와의 복합처리는 NO에 의한 신경세 포 손상 및 염증 반응을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000
iNOS COX-2 β-actin
A
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000 Vitamin C (μg/mL) - - 100 100 100 100
iNOS COX-2 β-actin
D
EOFS
0 5 10 15 20
Ratio of iNOS/β-actin .
B
##
*
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000
EOFS+Vitamin C
0 5 10 15 20
Ratio of iNOS/β-actin .
###
*
**
E
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000 Vitamin C (μg/mL) - - 100 100 100 100 EOFS
0 5 10
Ratio of COX-2/β-actin .
##
*
C
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000
EOFS+Vitamin C
0 4 8 12
Ratio of COX-2/β-actin .
##
*
**
**
F
LPS (1 μg/mL) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 125 250 500 1000 Vitamin C (μg/mL) - - 100 100 100 100
Fig. 3. Effect of EOFS only and the combined treatment with vitamin C on LPS-induced iNOS and COX-2 expressions in RAW264.7 cell. (A, B, C) RAW264.7 cells (4×105 cells/well in 6-well plates) were treated with 0, 125, 250, 500 or 1,000 μg/mL EOFS.
(D, E, F) RAW264.7 cells (4×105 cells/well in 6-well plates) were co-treated with 0, 125, 250, 500 or 1,000 μg/mL and 100 μg/mL vitamin C. The cells were incubated for 2 h, treated with 1 μg/mL LPS, incubated for 24 h prior to harvest. The expression levels of proteins related to inflammation (iNOS, COX-2) and β-actin were detected by western blotting using the appropriate antibodies. Values are expressed as mean±SD (n=3). ##P<0.01, ###P<0.001 vs. vehicle group; *P<0.05, **P<0.01 vs. LPS-induced group; significant differences between the treated group were evaluated using the Student’s t-test. EOFS, ethanolic extract of Opuntia ficus-indica var. saboten; LPS, lipopolysaccharide; iNOS, inducible nitric oxide synthase; COX-2, cyclooxygenase-2.
RAW264.7 세포에서의 염증 관련 단백질 발현
Inducible nitric oxide synthase(iNOS)는 세포질 안에 서 NO의 생성을 촉매하는 효소이다. 또한, cyclooxyge- nase-2(COX-2)는 산화적 스트레스에 의해 과발현되며, 사 이토카인을 생성하여 염증 반응을 일으킨다. 따라서 손바닥 선인장 70% 주정 추출물이 NO의 생성뿐만 아니라 iNOS와 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 west- ern blot을 진행하였다.
본 실험에서는 LPS로 유도한 RAW264.7 세포에서 손바 닥선인장 70% 주정 추출물 처리에 의한 iNOS 및 COX-2의 발현 정도를 Fig. 3에 나타내었다. iNOS 및 COX-2의 발현
을 확인한 결과 손바닥선인장 70% 주정 추출물 125, 250, 500 및 1,000 μg/mL에서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 손바닥선인장 70% 주정 추출물 1,000 μg/mL 처리군의 iNOS 발현양은 LPS로 유도한 염증 유발대조군 대비 통계적으로 유의하게 감소하였으며(P<0.05), COX-2 의 경우에도 손바닥선인장 70% 주정 추출물 1,000 μg/mL 처리 시 염증 유발대조군에 비하여 유의적으로 감소함을 확 인할 수 있었다(P<0.05). 이와 같은 결과로 NO의 생성 억제 에 직접 관여하는 iNOS와 염증 반응을 일으키는 COX-2의 발현이 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 의해 저해되는 것 이 항염증 효과의 기전임을 확인하였다. 이러한 결과 역시
0 20 40 60
AChE inhibition (%) .
EOFS EOFS+Vitamin C
**
EOFS (1 mg/mL) - - 10 20 30 40 50 60 Vitamin C (mg/mL) - 3 3 3 3 3 3 3
Fig. 4. Inhibitory effect of EOFS only and the combined treat- ment with vitamin C on AChE activity. EOFS (0, 10, 20, 30, 40, 50 or 60 mg/mL) with or without vitamin C (3 mg/mL) and 0.2 U/mL AChE were added in 96-well plate. The mixture was incubated for 10 min. DTNB and acetylthiocholine iodide were added to the wells before 30 min incubation. Values are ex- pressed as mean±SD (n=3). **P<0.01 vs. EOFS only treated group; significant difference between the treated group was evaluated using the Student’s t-test. EOFS, ethanolic extract of Opuntia ficus-indica var. saboten; AChE, acetylcholinesterase;
DTNB, 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid).
flavonol인 dihydrokaempferol의 항염증 활성(Lee 등, 2013)으로 인한 것이라 여겨진다.
또한 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C 100 μg/
mL를 혼합처리 하여 iNOS의 발현을 확인한 결과, 손바닥선 인장 70% 주정 추출물 500 및 1,000 μg/mL와 비타민 C 100 μg/mL의 혼합처리 시 염증 유발대조군 대비 유의적으 로 감소하였으며(P<0.05, P<0.01), 손바닥선인장 70% 주 정 추출물 250, 500 및 1,000 μg/mL 단독처리에 비해 각각 12.4%, 19.9%, 22.5% 더 감소하는 것으로 나타났다. COX- 2의 발현을 확인한 결과에서도 손바닥선인장 70% 주정 추 출물 250, 500 및 1,000 μg/mL와 비타민 C 100 μg/mL의 혼합처리 시 염증 유발대조군 대비 유의적으로 감소함을 확 인하였으며(P<0.05, P<0.01), 손바닥선인장 70% 주정 추 출물 250, 500 및 1,000 μg/mL 단독처리에 비해 각각 29.6
%, 29.2%, 44.8% 더 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 단독처리에 의한 항염증 효과뿐만 아니라 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C와의 혼합처리 시 시너지 효과를 지님을 검증할 수 있었다.
AChE 활성 억제 효과
노인성 치매는 학습과 기억에 중요한 역할을 하는 말초 및 중추신경계의 신경전달물질인 ACh의 감소로 인지기능 이 떨어지는 질환이다(Lee 등, 2008b). AChE는 ACh을 분 해하는 효소이므로 AChE의 활성을 억제하여 뇌에서 ACh 수준을 증가시키는 것은 기억력 개선에 도움을 준다고 알려 져 있다(Bertram과 Tanzi, 2008; Holzgrabe 등, 2007).
본 실험에서는 손바닥선인장 70% 주정 추출물 단독 그리
고 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C 복합처리에 의한 AChE 활성을 측정하여 억제율을 Fig. 4에 나타내었다.
세포 모델이 아닌 시료 자체에 의한 AChE 억제 효과를 확인 하기 위하여 고농도로 설정하여 처리한 결과, 손바닥선인장 70% 주정 추출물 10, 20, 30, 40, 50 및 60 mg/mL 처리 시 각각 10.0, 12.4, 15.0, 21.8, 26.1, 32.6%의 AChE 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 스코폴라민으로 인지기 능 저해를 유도한 동물모델에서 손바닥선인장 70% 주정 추 출물에 의한 뇌조직에서의 AChE 활성 저해를 보고한 연구 결과(Kwon 등, 2018)를 뒷받침해준다고 할 수 있다.
또한 AF64A로 기억력 손상을 유도한 동물모델에서 증가 된 AChE 활성이 비타민 C에 의해 다시 감소함이 보고되어 (Sutalangka와 Wattanathorn, 2017), 본 연구에서 비타민 C의 AChE 억제 활성을 확인한 결과 비타민 C는 다양한 처 리 농도 중 3 mg/mL에서 가장 높은 AChE 억제 활성을 보였 다. 따라서 손바닥선인장 70% 주정 추출물 10~60 mg/mL 및 비타민 C 3 mg/mL의 혼합처리에 대한 AChE 억제 활성 을 분석한 결과, 각각 10.4, 12.9, 22.3, 35.9, 43.7, 51.0%
로 나타났다. 또한 손바닥선인장 70% 주정 추출물 60 mg/
mL와 비타민 C 3 mg/mL의 혼합처리는 손바닥선인장 70%
주정 추출물 단독처리보다 AChE 억제 활성이 통계적으로 유의하게 증가하였다(P<0.01). 이 결과를 통해 손바닥선인 장 70% 주정 추출물은 농도 의존적으로 AChE 억제 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 비타민 C와의 혼합처리 시 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 손바닥선인장 70% 주정 추출물 단독 및 시너지 효과가 있는 비타민 C와의 혼합처리 에 의해 기억력 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
신경세포사멸 억제 효과
신경세포가 손상되면 정상적인 뇌기능을 할 수 없게 될 뿐만 아니라, 일단 손상되면 다시 회복되지 않는다. Aβ는 신경세포 손상을 유도하는 대표적인 원인물질이다. 따라서 Aβ에 의한 신경세포사멸을 억제하는 것은 기억력 개선과 밀접한 관련이 있다. Aβ로 신경 손상을 유도한 primary cultured rat cortical cell에서 손바닥선인장 부탄올분획물 에 의해 세포사멸이 억제됨이 보고되어 있어(Cho 등, 2007), 본 연구에서 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 의한 신경세 포사멸 억제 효과를 평가하고자 하였다.
손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C의 단독처리 에 의한 SH-SY5Y 세포의 세포생존율을 보기 위해 각 시료 를 1시간 전처리한 후 Aβ 10 μM로 세포사멸을 유도한 다음, 24시간 뒤 MTT assay를 수행하여 Fig. 5에 나타내었다.
세포독성이 없는 구간인 손바닥선인장 70% 주정 추출물 12.5, 25, 50 및 100 μg/mL 처리 시 각각 78.2, 80.8, 81.8, 90.1%의 세포생존율을 나타내었다. 또한 손바닥선인장 70
% 주정 추출물 100 μg/mL 처리군의 세포생존율은 유발대 조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가함을 확인하였다 (P<0.05).
EOFS
0 20 40 60 80 100 120
Relative cell viability . (% of control) .
A
##
*
Aβ (10 μM) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - 12.5 25 50 100
Vitamin C
0 20 40 60 80 100 120
Relative cell viability . (% of control) . ###
B
Aβ (10 μM) - + + + Vitamin C (μg/mL) - - 0.005 0.01 EOFS + Vitamin C
0 20 40 60 80 100 120
Relative cell viability . (% of control) . ###
**
**
***
C
Aβ (10 μM) - + + + + + EOFS (μg/mL) - - - 25 50 100 Vitamin C (μg/mL) - - 0.01 0.01 0.01 0.01
Fig. 5. Effect of EOFS, vitamin C, and the combination treatment on cell viability in Aβ-induced SH-SY5Y cell. (A) SH-SY5Y cells (1×104 cells/well in 96-well plates) were treated with 0, 12.5, 25, 50 or 100 μg/mL EOFS. (B) SH-SY5Y cells (1×104 cells/well in 96-well plates) were treated with 0, 0.005 or 0.01 μg/mL vitamin C. (C) SH-SY5Y cells (1×104 cells/well in 96- well plates) were co-treated with 0, 25, 50 or 100 μg/mL and 0.01 μg/mL vitamin C. The cells were incubated for 1 h, treated with 10 μM Aβ, incubated for 24 h. The MTT assay was performed to determine the cell viability. Values are expressed as mean±SD (n=3). ##P<0.01, ###P<0.001 vs. vehicle group; *P<0.05, **P<0.01,
***P<0.001 vs. Aβ-induced group; significant differences between the treated group were evaluated using the Student’s t-test. EOFS, ethanolic extract of Opuntia ficus-indica var. saboten; Aβ, β- amyloid.
더불어 Aβ에 의한 독성은 ROS 증가와 관련이 있음이 알 려져 있어(Behl과 Moosmann, 2002), 항산화능이 우수한 비타민 C의 단독 또는 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 혼합처리 시의 신경세포사멸 억제 효과도 평가하였다. 세포 독성이 없는 구간인 비타민 C 0.005, 0.01 μg/mL 처리 시 각각 76.2, 85.4%의 세포생존율을 보였으며, 유발대조군 대 비 농도 의존적으로 증가하였다. 위의 실험 결과를 토대로 Aβ에 의한 신경세포사멸 유도 모델에서 손바닥 70% 주정 추출물 25, 50 및 100 μg/mL와 비타민 C 0.01 μg/mL의 혼합처리에 대한 세포생존율을 분석하였으며, 각각 95.1, 99.9, 106.0%로 유발대조군에 비해 유의하게 농도 의존적 으로 증가함을 나타내었다(P<0.01, P<0.001). 이를 통해 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 신경세포사멸 억제에 의 한 신경세포 보호 효과뿐만 아니라 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C와의 혼합처리 시 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
손바닥선인장 70% 주정 추출물의 시냅스 가소성 및 신경세 포 활성 상승효과
CREB의 활성화는 기억 형성 및 강화와 관련된 중요한 신호 전달 메커니즘으로 관련 유전자의 전사를 유도하는 것 으로 알려져 있다. 그중 BDNF는 뇌신경 생성인자로 뉴런의 분화와 생존에 결정적인 역할을 하며, BDNF의 증가는 시냅 스의 가소성 및 신경세포 활성 증가를 의미한다(Tao 등, 1998; Gordon, 2009).
본 실험에서는 SH-SY5Y 세포에 손바닥선인장 70% 주 정 추출물을 Aβ에 의해 감소한 세포생존율을 정상세포 수준 으로 회복하였던 농도 이상으로 처리하여 관련 기전을 명확 히 확인하고자 하였다. 이에 손바닥선인장 70% 주정 추출물 을 12.5, 25, 50, 100 및 250 μg/mL로 전처리하고 Aβ를 10 μM 첨가하여 신경독성을 유도한 후, CREB 및 BDNF의 단백질 발현을 비교하여 Fig. 6에 나타내었다. Western blot 을 통해 BDNF의 발현을 확인한 결과 손바닥선인장 70%
주정 추출물 처리 시 Aβ에 의한 신경독성 유발대조군보다 증가하는 양상을 보였으며, 100 및 250 μg/mL 처리 시에는 유발대조군 대비 통계적으로 유의하게 증가함을 알 수 있었 다(P<0.05). p-CREB 및 CREB의 단백질 발현의 경우 손바 닥선인장 70% 주정 추출물 12.5~250 μg/mL 처리한 군이 Aβ에 의한 신경독성 유발대조군보다 CREB의 인산화 정도 가 증가하였으며, 100 및 250 μg/mL 처리 시 유발대조군 대비 유의적으로 증가함을 확인하였다(P<0.05, P<0.01).
위 결과들을 통해 손바닥선인장 70% 주정 추출물은 CREB 인산화 및 BDNF 발현 증가로 시냅스 가소성 및 신경세포 활성 증가에 관여함을 확인할 수 있었다. 동물모델에서 손바 닥선인장 주정 추출물에 의한 p-CREB, BDNF 발현 증가를 보고한 연구 결과(Kwon 등, 2018)와 같이, 본 연구로 CREB- BDNF 신호전달기전이 손바닥선인장에 의한 기억 증진에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시하였다. 이에 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 대한 기억력 개선에 도움을 주는 기능성 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
Aβ (10 μM) - + + + + + + EOFS (μg/mL) - - 12.5 25 50 100 250
BDNF CREB p-CREB β-actin
A
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Relative protein expression .
BDNF p-CREB/CREB
*
* **
*
B
Aβ (10 μM) - + + + + + + EOFS (μg/mL) - - 12.5 25 50 100 250
Fig. 6. Effect of EOFS on BDNF and CREB expressions in Aβ-induced SH-SY5Y cell. SH-SY5Y cells (7×105 cells/well in 60 mm dishes) were treated with various concentrations of EOFS (0, 12.5, 25, 50, 100 or 250 μg/mL). The cells were incubated for 1 h, treated with 10 μM Aβ, incubated for 24 h prior to harvest. The expression levels of proteins related to synaptic plasticity (BDNF, CREB, p-CREB) and β-actin were detected by western blotting using the appropriate antibodies. Values are expressed as mean±SD (n=3). ##P<0.01 vs. vehicle group; *P<0.05, **P<0.01, vs. Aβ-induced group; significant differences between the treated group were evaluated using the Student’s t-test. EOFS, ethanolic extract of Opuntia ficus-indica var. saboten; Aβ, β-amyloid; BDNF, brain-derived neurotrophic factor; CREB, cAMP response element-binding protein; p-CREB, phospho-cAMP response element-bind- ing protein.
요 약
본 연구에서는 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 인지 개선 효능을 알아보고자 하였다. 이에 인지 개선 관련 바이오마커 인 신경염증, 신경전달물질 및 시냅스 가소성이 손바닥선인 장 70% 주정 추출물에 의해 조절되는지 in vitro 모델에서 평가하였다. 먼저 RAW264.7 세포에서 NO 소거능과 iNOS 및 COX-2 발현 비교를 통해 손바닥선인장 70% 주정 추출 물 단독 및 비타민 C 복합처리에 의한 항염 효능을 보여주었 다. 더불어 손바닥선인장 70% 주정 추출물 단독 및 비타민 C 복합처리 시 AChE 활성을 억제하여 ACh의 증가를 일으 킬 수 있다는 가능성을 제시하였다. 위의 가능성을 토대로 손바닥선인장 70% 주정 추출물에 의한 SH-SY5Y 세포에 서 세포사멸 억제 효과와 CREB 인산화 및 BDNF 발현 증가 에 따른 시냅스 가소성 및 신경세포 활성 증가에 대한 증거 를 제시하였다. 본 연구 결과는 신경 염증 반응 억제와 인지 개선 작용기전을 통해 손바닥선인장 70% 주정 추출물의 기 억력 개선에 도움을 주는 기능성 소재로서 개발 가능성을 보여주었다. 또한 손바닥선인장 70% 주정 추출물과 비타민 C의 병용처리는 기능성이 우수한 것으로 나타나 이를 이용 하여 기억력 개선에 효과적인 기능성 제품 및 여러 가공품을 개발할 수 있을 것으로 기대한다.
감사의 글
본 연구는 서울시 산학연 협력사업 중 “기업성장 기술개발 지원사업”(과제번호: CI152006)의 지원에 의해 수행되었 습니다.
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