• 검색 결과가 없습니다.

production and iNOS expression in RAW 264.7 Cells

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "production and iNOS expression in RAW 264.7 Cells"

Copied!
28
0
0

로드 중.... (전체 텍스트 보기)

전체 글

(1)

2009년 8월 석 사 학 위 논 문

대 체 의 학 과

조선대학교 보건대학원

환삼덩굴 추출물이 설치류

대식세포(Raw 264.7cell)에서 NO 생성과 iNOS 발현에 미치는 영향

(2)

환삼덩굴 추출물이 설치류

대식세포(Raw 264.7cell)에서 NO 생성과 iNOS 발현에 미치는 영향

2009 8

조선대학교 보건대학원

대 체 의 학 과

Inhibitory effect of 

Humulus japonicus

extracts on NO

production and iNOS expression in RAW 264.7 Cells

(3)

지 도 교 수

대 체 의 학 과

조 선 대 학 교 보 건 대 학 원

이 논문을 대체의학 석사학위신청 논문으로 제출함.

2009 6

환삼덩굴 추출물이 설치류

대식세포(Raw 264.7cell)에서 NO 생성과 iNOS 발현에 미치는 영향

(4)

배영곤의 석사학위논문을 인준함

위원장 조선대학교 교수 박 상 학 인 원 조선대학교 교수 서 재 홍 인 원 조선대학교 교수 문 경 래 인

2009 8

조 선 대 학 교 보 건 대 학 원

(5)

목차

목차 ···i

그림 목차 ···ii Abstract···iii Ⅰ.서론 ···1

Ⅱ.재료 및 방법 ···3

1.환삼덩굴의 수집 및 추출 ···3

2.시약 ···3

3.RAW 264.7세포주의 배양 ···3

4.세포 생존률 분석 ···3

5.NO 생성량 측정 ···4

6.iNOS 발현 저해능 측정 ···4

7.통계처리 ···5

Ⅲ.실험결과 ···6

1.세포 생존률에 미치는 영향 ···6

2.NO 생성에 미치는 영향 ···8 3.iNOS 발현에 미치는 영향 ···13

Ⅳ.고찰 ···15

Ⅴ.결론 ···17

참 고 문 헌 ···18

(6)

그림 목차

Figure1.EffectofHJME ontheviabilityofRAW 264.7cells.···7 Figure2.EffectsofHJME onNO productioninRAW 264.7cellsfor12hr.

···9 Figure3.EffectsofHJME onNO productioninRAW 264.7cellsfor24hr.

···10 Figure4.EffectsofHJME onNO productioninRAW 264.7cellsfor36hr.

···11 Figure5.InhibitoryeffectsofHJME onNO productioninLPS-stimulatedRAW 264.7cells..···12 Figure6.EffectsofHJME on iNOS expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells.···14

(7)

ABSTRACT

Inhibitory effect of Humulus japonicus extracts on NO production and iNOS expression in RAW 264.7 Cells

Bae,Young-gon

Advisor:Prof.Moon,KyungRyeM.D.,Ph.D.

DepartmentofAlternativeMedicine, GraduateSchoolofHealthScience ChosunUniversity

In Korean fork medicine, Humulus japonicus has been used for treatment of various inflammatory disorders such as pulmonary tuberculosis, tuberculous cervical lymphadenitis. Some studies reported that Humulus japonicus possess antioxidant, antibacterial &

antimutagenic activities. But anti-inflammatory activity has not studied yet. So this study was designed to investigate the inhibitory effects of methanol extract from Humulus japonicusleaves, stalks and roots on NO production and expression of iNOS in LPS-stimulated RAW 264.7 celllines. Treatmentof LPS-stimulated RAW 264.7 cells with Humulus japonicus methanol extracts significantly reduced the production of NO and the expression of iNOS in a dose-dependent manner. These results shows that themethanol extract from Humulus japonicus may explain some known biological activities including anti-inflammatory effect and Humulus japonicus may have a considerable benefit in the treatment for pro-inflammatory mediator overproduction such as bacterial septicshock, immunological diseases.

(8)

Ⅰ.서

Nitric oxide (NO)는 생체내에서 기질인 L-arginine이 nitric oxide synthase (NOS)의 작용으로 citrulline로 변하면서 함께 생성된다1).NO는 혈류와 혈압 조절, 신경전달과정,혈소판의 응집 억제 등에 관여하며 인체의 면역조절과 방어기전으로 써 중요한 역할을 하며2),암의 성장에도 관여하는 것으로 알려져 있다3).

NOS는 세포내 신호 전달에서 중요한 역할을 하는 solubleguanylatecyclase를 자극하여 그 작용을 발현하며4),eNOS (endothelialNOS),nNOS (neuronalNOS), iNOS(inducibleNOS)의 세 종류로 나눌수 있다5,6).eNOS는 혈관내피세포에서 NO 를 유리시켜 혈압 조절,혈소판의 응집 및 평활근 세포의 증식 조절 등에 관여하고, nNOS는 말초와 중추신경계에서 신경전달물질로 작용하여 통증의 조절에 관여한다.

eNOS와 nNOS는 cNOS (constitutiveNOS)라고 하는데 혈관내피세포 등에서 생리 적인 기능에 필요한 낮은 농도의 NO를 Ca2+/calmodulin의존적으로 계속 생성한다

7)

.그러나,iNOS는 상피세포나 백혈구 등에서 lipopolysaccharide (LPS)나 각종 cytokine등에 의해 발현이 유도되어 과량의 NO를 생성하는 것으로 알려져 있어 염 증 반응 시의 NO 생성은 대부분 iNOS에 의한 것이라 할 수 있다8,9).이렇게 생성된 다량의 NO는 산소와 만나게 되어 반응성이 강한 peroxynitirite를 형성하여 외부에서 침입한 세균,바이러스 등의 미생물 및 암세포에 대해 신체를 방어하는 면역반응에서 중요한 역할을 담당한다.그러나 대식 세포에 의한 NO의 과도한 생산은 패혈증10),자 가면역질환11),일부 염증질환12)에서 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.과도하 게 생성된 NO는 심혈관계에 직접적인 영향을 줄 뿐만 아니라 암의 진행과정에서 매 개적인 역할을 담당하므로 iNOS의 저해제는 항염증제,암예방제 등으로도 활용될 수 있다13).

환삼덩굴 (HumulusjaponicusSieboid& Zucc.)은 삼과 (Cannabaceae)에 속하는 일년생 또는 다년생 초본 식물로서 7-8월에 개화하고 길이는 수 미터에 달하며 갈고 리 모양의 가시를 가진다14,15).환삼덩굴은 한삼덩굴,율초 등으로도 불리는데,한국,

(9)

일본,대만,중국 등에 분포하며 국내에서는 전역에 걸쳐 자생하고 있다16-17).환삼덩 굴은 한국 전통 의학에서 폐결핵,결핵성 림프염,고혈압 등에 사용되고 있으며 혈압 강하 작용,이뇨작용 및 항균작용 등이 있는 것으로 알려져 있다18).지금까지 보고된 약효 성분으로는 terpene, lupulone, humulone, humulene, luteolin, cosmosiin, vitexin,selinene등이 알려져 있다19-21).기존의 연구에서 환삼덩굴은 용매분획물에서 항균성과 항산화 효과가 있고22),메탄올 추출물의 항돌연변이 효과가 있으며23),에틸 아세테이트 분획에서 분리된 luteolin-7-O-β-D-glucoside가 활성산소소거능을 가짐 이 알려져 있다24).하지만 이 외에 환삼덩굴의 생리적 활성에 관한 연구는 거의 되어 있지 않고 특히 항염작용에 대한 연구는 전무한 상태이다.

이에 본 연구에서는 환삼덩굴의 메탄올 추출물이 LPS로 활성화된 RAW 264.7대 식세포에서 NO 및 iNOS의 생성억제에 미치는 영향을 알아보아 항염 약제로서의 가 능성을 제시하고자 한다.

(10)

Ⅱ.재료 및 방법

1.재료 수집과 추출

본 실험에 사용한 환삼덩굴(HumulusjaponicusSieb.etZucc.)은 2008년 9월에 광주광역시 남구 봉선동 근교에 서식하는 것을 채취하여 충분히 건조하였고,전초를 시료로 사용하였다.건조된 환삼덩굴 전초 100g을 methanol600ml에 48시간 동안 담아두었다가 여과지에 걸러 증발건조기를 이용해 추출한 후 냉각,동결 건조시켜 시 료를 얻었다.

2.시약

Methanol,LPS,ThiazolylBlue Tetrazolium Bromide (MTT),1% penicillin, streptomycin은 Sigma사 (USA)로부터 구입했으며, Dulbecco'sModified Eagle's medium (DMEM)과 10% fetalbovineserum (FBS)은 (GIBCO,USA)에서 구입하였 다.

3.RAW 264.7세포주의 배양

HumulusjaponicusMethanolextract(HJME)이 NO 생성 및 iNOS발현에 미치 는 영향을 알아보기 위해 설치류의 대식세포인 RAW 264.7cellline을 사용하였고 세 포는 조선대학교 약학대학 천연물 연구소에서 분양받았다.RAW 264.7 세포를 DMEM에 10% FBS,100U/㎖ penicillin및 100㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃,5% CO₂incubator에서 배양하였다.

4.세포 생존률 분석

(11)

배양된 RAW 264.7cell을 96wellplate에 3×10⁵ cell/㎖의 농도로 희석하여 180

㎕의 배지에 접종한 후 37℃ 5% CO₂incubator에서 24시간 동안 배양하였다.그 후 에 각각 3,10,30,100,200,300㎍/㎖ 농도로 희석한 시료 (5% DMSO inmedia)20

㎕를 각 well에 첨가하고 37℃,5% CO₂incubator에서 24시간을 배양한 후 부유액 을 pasteur pipet으로 제거한 후 준비된 MTT (3-[4,5- dimethylthiazol 2-yl])-2,5-diphenyltertrazolium bromide)solution을 각 well에 50 ㎕씩 넣고 96 wellplate를 호일에 싸서 4시간 더 배양하였다.이후 96wellplate를 꺼내서 pasteur pipet으로 MTT solution 을 조심스럽게 제거한 후 DimethylSulfoxide(DMSO)를 150㎕씩 가한 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

5.NO 생성량 측정

RAW 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 Griess시약을 이용하여 측정하였다.96wellplate에 well당 5×10⁵ cells/㎖의 RAW 264.7 세포가 들어있는 부유액 100 ㎕를 분주하고 24 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고,무혈청 배지에 최종농도가 3,10,30, 100㎍/㎖으로 되도록 시료를 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 LPS 1㎍/㎖ 를 처리하여 각각 12,24,36 시간까지 배양하였다.세포 배양액 50 ㎕에 Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphate : 0.1%

naphthylethylenediaminedihydrochloridein water= 1:1,v/v)를 75㎕ 씩 가 하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

6.iNOS 발현 저해능 측정

RAW 264.7세포 1×10⁶ cells/㎖가 들어있는 부유액을 6wellplate에 well당 1

㎖씩 접종하고 24시간 배양하였다.배양 후 배지를 제거하고 무혈청 배지에 최종농 도가 3,10,30,100 ㎍/㎖으로 되도록 시료를 처리한 후 염증 유도 발현 인자인

(12)

LPS 1 ㎍/㎖를 처리하여 24시간 배양하였다.배양 후 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후 모아서 12,000rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하 고,PBS를 이용하여 세척하였다.세포 용해 완충액을 100㎕씩 넣어주고 잘 섞어 준 후에 얼음에서 30분 동안 세포를 용해시켰다.세포 용해 후 12,000rpm에서 20 분 동안 원심분리하고 상층액을 추출하여 BicinchoninicAcid법(BCA법)을 이용한 단백질 정량을 수행하였다.단백질 정량 후 well당 35㎍의 단백질을 10% Sodium Dodecylsulfate-polyacrylamidegel(SDS-PAGE)에서 100V로 1시간 동안 전기영동 하였다.전기영동 한 후 PVDF membrane에 단백질을 전사한 후에 이 membrane 을 5% non-fat dry milk-PBST 용액에 1시간 동안 blocking하고 primary antibody를 1시간 동안 blotting 하였다.PBS로 30분간 세척한 후 secondary antibody를 반응시킨 후 western blot를 시행하여 단백질의 발현 정도를 확인하였 다.단백질 보정을 위하여 β-actin도 함께 수행하였다.

7.통계처리

각각의 실험들은 3번 이상 실행하였으며 결과는 Mean±SD로 표현했다.통계분 석은 MicrosoftExcel의 Student's t-test를 이용했으며 p값이 0.05이하인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

(13)

Ⅲ.실험결과

1.세포 생존률에 미치는 영향

환삼덩굴 추출물(HJME)의 세포 생존률에 대한 영향을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포에 HJME의 농도를 각각 3,10,30,100,200,300 ㎍/㎖로 처리하였다.

CO2incubator에서 24hr지난 후에 세포 생존률을 MTT assay를 통하여 측정하 였다.실험결과 HJME은 3,10,30,100,200㎍/㎖의 농도에서 세포 생존률이 각각 97,98,99,96,101%로 모두 90% 이상으로 나타나서 control군과 비교했을 때 HJME 군의 RAW 264.7세포 생존률에 유의적인 차이가 없었다.그러나 300㎍/㎖ 에서는 세포 생존률이 77% (p< 0.01)로 나와 세포 독성이 확인되었으므로 본 실 험에서는 HJME의 농도를 3,10,30,100㎍/㎖로 제한하여 실시하였다 (Fig.1).

(14)

**

0 20 40 60 80 100 120

control 3 10 30 100 200 300

concentration(ug/ml)

Cell viability(%)

Figure1.EffectofHumulusjaponicusmethanolextract (HJME)on theviability ofRAW 264.7cells.

Thecellswereincubatedfor24hrswith medium orHJME.The cellviability was calculated by MTT assay.Data representthe mean ± SD ofthreeindependentexperiments.Studentt-testwas usedtoexaminethedifferencebetweengroups.

**:p-value< 0.01

(15)

2.NO 생성에 미치는 영향

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7세포에 환삼덩굴 메탄올 추출 물의 농도를 각각 3,10,30,100㎍/㎖로 처리했을 때 유도된 NO 생성량을 Griess 시약을 이용하여 12hr,24hr,36hr동안 배양하여 측정하였고 그 결과는 LPS만 처리한 군에 대한 상대적 농도로 Fig.2,Fig.3,Fig.4에 나타냈다.Fig.5에는 LPS 에 의해 유도된 NO 생성량에 대한 HJME에 의한 농도별 NO 생성 억제 정도 를 시간별로 함께 나타냈다.

HJME는 시간에 관계없이 농도 의존적으로 NO 생성을 억제함을 알 수 있었고,특 히 100㎍/㎖에서는 현저히 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났다.이러한 결과는 HJME가 LPS로 활성화된 RAW 264.7대식세포에서 NO 생성을 억제하는 효과가 있음을 제시해 주는 것이다.

(16)

**

*

*

0 20 40 60 80 100 120

u n tre ated L P S L P S +3 u g/ ml

L P S +10 u g/ ml

L P S +30 u g/ ml

L P S +100 u g/ ml c on c . ( u g/ ml )

iNOS activity(% of positive control)

Figure 2. Effects of HJME on NO production in LPS-stimulatedRAW 264.7cells.

Thecells werepre-incubated for12 hrwith media orHJME attheconcentrationsranging from 3 ㎍/㎖ to 100 ㎍/㎖,and then stimulated for 12 hr with 1 ㎍/㎖ of LPS. NO concentration was determined by Griess reaction. Data representthe mean ± SD ofthree independentexperiments. Studentt-testwas used to examine the difference between groups.

*:p-value< 0.05

**:p-value< 0.01

(17)

**

**

*

0 20 40 60 80 100 120

untreated LPS LPS+3 ug/ ml

LPS+10 ug/ ml

LPS+30 ug/ ml

LPS+100 ug/ ml c o nc . (ug / ml)

iNOS activity(% of positive control)

Figure 3. Effects of HJME on NO production in LPS-stimulatedRAW 264.7cells.

Thecells werepre-incubated for12 hrwith media orHJME attheconcentrationsranging from 3 ㎍/㎖ to 100 ㎍/㎖,and then stimulated for 24 hr with 1 ㎍/㎖ of LPS. NO concentration was determined by Griess reaction. Data representthe mean ± SD ofthree independentexperiments. Studentt-testwas used to examine the difference between groups.

*:p-value< 0.05

**:p-value< 0.01

(18)

**

*

*

0 20 40 60 80 100 120

u n tre ate d L P S ( 1 u g/ ml )

L P S +3 ug/ ml

L P S +10 u g/ ml

L P S +30 u g/ ml

L P S +100 u g/ ml c on c . ( ug/ ml )

iNOS activity(% of positive control)

Figure 4. Effects of HJME on NO production in LPS-stimulatedRAW 264.7cells.

Thecells werepre-incubated for12 hrwith media orHJME attheconcentrationsranging from 3 ㎍/㎖ to 100 ㎍/㎖,and then stimulated for 36 hr with 1 ㎍/㎖ of LPS. NO concentration was determined by Griess reaction. Data representthe mean ± SD ofthree independentexperiments. Studentt-testwas used to examine the difference between groups.

*:p-value< 0.05

**:p-value< 0.01

(19)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

L PS (1 ug/ ml)

L PS+3 u g/ ml

L PS +10 ug/ ml

L PS +30 ug/ ml

L PS+100 ug/ ml c o nc . ( ug / m l)

NO inhibition (% of control)

12 hr 24 hr 36 hr

Figure5.Inhibitory effectsofHJME on NO production in LPS-stimulatedRAW 264.7cells.

Thecells werepre-incubated for12 hrwith media orHJME attheconcentrationsranging from 3 ㎍/㎖ to 100 ㎍/㎖,and then stimulated for12,24,36 hrwith 1 ㎍/㎖ ofLPS.NO concentration was determined by Griess reagent. Data representthemean± SD ofthreeindependentexperiments.

(20)

3.iNOS 발현에 미치는 영향

NO의 생성은 합성 효소인 iNOS의 발현과 직접적으로 연관되어 있다.따라서 본 실험에서는 LPS로 활성화된 RAW 264.7cell에서 환삼덩굴 추출물이 iNOS 단 백질 발현에 미치는 영향을 알아 보기 위해 환삼덩굴 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후,LPS(1㎍/㎖)로 처리하여 24시간 배양한 후 iNOS의 단백질의 변화를 Western blotting으로 확인하였다.대조군으로는 β-actin을 사용하였다.그 결과 HJME을 처리한 실험군에서 iNOS 단백질 발현이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.특히 100㎍/㎖에서 유의적인 iNOS 발현 억제 효과를 볼 수 있었으며 NO 생성에서와 같이 농도에 의존적으로 억제됨을 알 수 있다 (Fig.6).

(21)

β actin

untreated LPS LPS + HJME 10 ㎍/

LPS + HJME 30 ㎍/

LPS + HJME 100 ㎍/

iNOS

untreated LPS LPS + HJME 10 ㎍/

LPS + HJME 30 ㎍/

LPS + HJME 100 ㎍/

Figure 6. Effects of HJME on iNOS expression in LPS-stimulatedRAW 264.7cells.

Thecellswerepre-treatedfor24hrwith eitherPBS orHJME atindicatedconcentrations,andthenstimulatedfor24hrwith1

㎍/㎖ of LPS. The protein expression was determined by western blot.Similarresults were observed in three separated experiments.

(22)

Ⅳ.고찰

환삼덩굴은 민간에서 이질,결핵,결핵성 림프염 등 염증성 질환에서 사용되고 있 지만 약효에 대한 신뢰할 만한 연구나 결과가 부족하며,지금까지는 항균활성,항산 화 활성,항돌연변이 효과 등 만이 보고되었다22-24)..이에 본 연구에서 환삼덩굴 전초 를 메탄올로 추출하여 염증성 매개 물질로 알려져 있는 NO와 NO 생성효소인 iNOS 의 단백질 발현 정도에 미치는 영향을 연구함으로써 환삼덩굴의 항염활성을 조사하 였다.

염증이란 활성화된 염증세포 또는 면역세포들에 의해 매개되는 다양한 과정을 말한다25).염증반응에서 대식세포는 IL-1β,IL-6,NO,iNOS,COX-2,TNF-α 과 같은 많은 proinflammatory cytokine과 염증 전달물질의 과잉생산을 포함한 많은 병적 상황을 해결하는 데에 핵심적인 역할을 하며26),염증 전달물질 가운데에서 특 히 NO는 다양한 염증 반응에서 중요한 매개 역할을 하는 물질로 알려져 있다2). LPS는 Gram 음성 세균의 세포막을 구성하는 물질로서 면역 세포 등을 자극하여 iNOS의 발현을 통해 NO의 생성을 과다하게 증가시키고27),이 과도한 NO는 peroxynitrite를 형성하여 정상적인 면역반응을 넘어서 세포를 손상시키게 되며 이 로 인해 각종 염증반응,암 등의 질환에 관련하는 것으로 알려져 있다28).LPS로 활 성화시킨 RAW 264.7세포는 류마티스 관절염29),죽상경화증30),만성 간염31)등의 많은 염증관련 질환에서 염증매개물질의 과잉생산을 설명하기 위해 사용되어 왔다.

이에 본 연구에서도 LPS로 활성화시킨 RAW 264.7 대식세포를 사용하였고,아무 처리도 하지 않았을 때에 비해 수십배 이상 NO가 증가됨을 확인하였으며 환삼덩 굴의 메탄올 추출물(HJME)이 LPS로 인한 NO 생산을 3,10,30,100㎍/㎖의 농도 에서 농도의존적으로 유의하게 감소시킴을 확인하였다(Fig.2,3,4).특히 HJME가 100㎍/㎖의 농도에서는 현저하게 NO 생성을 억제하는 것을 볼 수 있었다(Fig.5). 이러한 NO의 생산 저해는 iNOS 활성만을 저해하여 일어나거나 iNOS의 발현에 영향을 주어서 발생할 수 있다.본 연구에서 LPS로 활성화된 RAW 264.7대식세

(23)

포에서 Westernblot을 통해 HJME가 iNOS의 단백질 발현을 농도의존적으로 저해 하는 것을 확인하였다(Fig.6).그러므로 환삼덩굴은 iNOS의 발현을 억제하여 NO 의 생성을 저해하는데,어떤 경로를 통해 iNOS의 발현이 억제되는지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하겠다.

결론적으로 환삼덩굴은 LPS로 활성화된 RAW 264.7대식세포에서 iNOS의 발현 억제를 통해 NO를 유의적으로 감소시킴으로 적어도 부분적으로는 항염 효과를 나타 냄을 알 수 있었다.따라서 환삼덩굴은 염증 관련 질환에서 면역 활성화 물질 중의 하나로서 활용될 수 있을 것이다.

(24)

Ⅴ.결론

환삼덩굴의 항염 효과를 확인하기 위하여 LPS로 유도된 RAW 264.7세포를 대상 으로 환삼덩굴 메탄올 추출물(HJME)의 농도에 따른 NO와 iNOS의 생성 저해능을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1.HJME는 NO 생성을 농도의존적으로 억제하는 효능을 가지고 있다.

2.HJME의 NO 생성 억제 효과는 iNOS 단백질의 발현을 농도의존적으로 저해 하는 효능에 의한 것이다.

이상에서 환삼덩굴은 염증성 질환의 예방과 치료에 이용할 수 있는 가치가 있 을 것으로 사료된다.

(25)

참 고 문 헌

1. Moffat FL, Han T, Li ZM, Peck MD, Jy W, Ahn YS, Chu AJ, Bourguignon LY. : "Supplemental L-arginine HCl augments bacterial phagocytosis in human polymorphonuclear leukocytes," Journal of Cellular Physiology, 168(1):26-33, 1996.

2. Gallin JI, Snyderman R. : Overview. In : Gallin JL, Snyderman R. (Eds.), Inflammation : Basic Principles and Clinical Correlates, 3rd ed., Philadelphia : Lippincott Williams &Wilkins, 1999, pp. 1-4.

3. Thomsen LL, Scott JM, Topley P, Knowles RG, Keerie AJ, Frend AJ. :

"Selective Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase Inhibits Tumor Growth in Vivo: Studies with 1400W, a Novel inhibitor," Cancer Research, 57(15):3300-4, 1997.

4. Arnold WP, Mittal CK, Katsuki S, Murad F. : "Nitric oxide Activates guanylate cyclase and increases guanosine 3', 5'-cyclic monophosphate levels in various preparations," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(8):3203-3207, 1997.

5. Forstermann U, Schmidt HH, Pollock JS, Sheng H, Mitchell JA, Warner TD, Nakaue M, Murad F. : "Isoforms of nitric oxide synthase.

Characterization and purification from different cell types," Biochemical Phamacology, 42(10):1849-57, 1991.

6. Vane JR, Mitchell JA, Appleton L, Tomlinson A, Bailey DB, Croxtall J, Willoughby DA. : "Inducible isoforms of cyclocxygenase and nitric oxide synthase in inflammation," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(6): 2046-50, 1994.

(26)

7. Lane P, Gross SS. : "The autoinhibitory control element and calmodulin conspire to provide physiological modulation of endothelial and neuronal nitric oxide synthase activity," Acta Physiologica Scandinavica,

168(1):53-63, 2000.

8. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. : "Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology," Pharmacological Reviews, 43(2):109-142, 1991.

9. Weinberg JB, Granger DL, Pisetsky DS, Seldin MF, Misukonis MA, Mason SN, Pippen AM, Ruiz P, Wood ER, Gilkeson GS. : "The role of nitric oxide in the pathogenesis of spontaneous murine autoimmune disease: increased nitric oxide production and nitric oxide synthase expression in MRL-lpr/lpr mice, and reduction of spontaneous glomerulonephritis and arthritis by orally administered NG-monomethyl-l-arginine," The Journal of Experimental Medicine, 179(2):651-60, 1994.

10. Petros A, Bennett D, Vallance P. : "Effect of nitric oxide synthase inhibitors on hypotension in patients with septic shock," Lancet.

338(8782-3):1557-8, 1991.

11. McCartney-Francis N, Allen JB, Mizel DE, Albina JE, Xie QW, Nathan CF, Wahi SM. : "Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase," The Journal of Experimental Medicine, 178(2):749-54, 1993.

12. Kleemann R, Rothe H, Kolb-Bachofen V, Xie QW, Nathan C, Martin S, Kolb H. : "Transcription and translation of inducible nitric oxide synthase in the pancreas of prediabetic BB rats," FEBS Letters. 328(1-2):9-12, 1993.

13. Wolf H, Haeckel C, Roessner A. "Inducible nitric oxide synthase expression in human urinary bladder cancer," Virchows Archiv, 437(6):662-6, 2000.

(27)

14. 배기환: 「한국의 약용식물」서울 : 교학사, 2000, p. 72.

15. 육창수: 「원색 한국약용식물도감」서울: 아카데미서적, 1989, p. 138.

16. 정보섭 ․ 신민교: 「도해 향약 대사전(식물편)」서울: 영림사, 1990, p. 551.

17. 고경식 ․ 전의식: 「한국의 야생식물」서울: 일진사, 2003, p. 131.

18. 김창민 ․ 신민교 ․ 안덕균 ․ 이경순: 「중약대사전」서울: 정담, 1998, pp.

4377-80.

19. Naya Y, Kotake M. : "Constituents of hops. V. volatile composition of Humulus japonicus," Bulletin of the Chemical Society of Japan,

43(11):3594-6, 1970.

20. Aritomi M. : "Chemical constiuents in leaves of Humulus japonicus,"

Yakugaku Zasshi, 82:1331-2, 1962.

21. Hur JY, Jeong CH. : "Chemical components of Humulus japonicus leaves and stalks," Journal of Agriculture & Life Sciences, 37(1):1-7, 2003.

22. Park SW, Woo CJ. : "Antimicrobial and antioxidative activities of solvent fraction from Humulus japonicus," Korean Journal of Food Science and Technology, 26(4):464-70, 1994.

23. Park SW, Kim SH. : "Antimutagenic effects and isolation of flavonoids from Humulus japonicus," Korean Journal of Food Science and Technology, 27(6):897-901, 1995.

24. Park SW, Chung SK, Park JC. : "Active oxygen scavenging activity of luteolin-7-O-β-D-glucoside isolated from Humulus japonicus," Journal of Korean Society of Food Science and Nutrition, 29(1):106-10, 2000.

(28)

25. Lundberg IE. : "The role of cytokines, chemokines, and adhesion molecules in the pathogenesis of idiopathic inflammatory myopathies,"

Current Rheumatology Reports, 2(3):216-24, 2000.

26. Walsh LJ. : "Mast cells and oral inflammation," Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 14(3):188-98, 2003.

27. Spitzer JA. : "Cytokine stimulation of nitric oxide formation and differential regulation in hepatocytes and nonparenchymal cells of endotoxemic rats," Hepatology, 19(1):217-28, 1994.

28. El-Mahmoudy A, Matsuyama H, Borgan MA, Shimizu Y, El-Sayed MG, Minamoto N, Takewaki T. : "Thymoquinone suppress expression of

inducible nitric oxide syntahse in rat macrophages," International Immunopharmacology, 2(11):1603-11, 2002.

29. Tilg H, Wilmer A, Vogel W, Herold M, Nolchen B, Judmaier G, Huber C.

: "Serum levels of cytokines in chronic liver diseases," Gastroenterology, 103(1):264-74, 1992.

30. Coker RK, Laurent GJ. : "Pulmonary fibrosis: cytokines in the balance,"

The European Respiratory Journal, 11(6):1218-21, 1998.

31. Lind L. : "Circulating markers of inflammation and atherosclerosis."

Atherosclerosis, 169(2):203-14, 2003.

참조

관련 문서

2 0 0 3 년도에 추진이 시작된 교육행정정보시스템인 나이스( NEI S,Na t i ona lEducat i on I nf or mat i onSyst e m) 에 포함된 I T환경 하에서의 학교재정운용과

Fi g.7.Uni vari ate anal ysi s of 163 pati ents of gastri c adenocarci noma shows a si gni fi cantdi fference i n the overal lsurvi valaccordi ng to the Ets-1expressi on(p=0..

상아질은 치아의 가장 중요한 구성 성분으로 치관과 치근의 대부분을 구성하며,상 아질모세포는 제Ⅰ형과 Ⅱ형 교원질과 같은 유기기질과 당단백 및 de nt i n s i al ophosphopr

surface morphol ogy(a, b, c at Fi g. 15) of the non cl i ni cal used i mpl antafterpotenti odynami ctest· · · ·16 Fi g.17.SEM and EDS showi ng the cross-secti oned

Love l e s s ( 1999 ) 는 1980년대에 시행되어진 수준별 교육과정에 대한 연구인 Hi gh Schooland Be yond( HSB) 와 Educ at i onalLongi t udi nalSt udy( NELS) 의 자료

I EC를 사용하여 정제된 항세균 물질은 t r i c i neSDS-PAGE에서 하나의 band임을 확인 한 후 N-말단 아미노산 서열분석을 하였으나 실패하였다.FPLC s ys t e m을

저항형 SFCL에서 초전도 소자의 퀜치시 발생하는 저항이 초전도 소자가 직렬로 연결될수록 차이가 많이 난다는 것을 fi g.23을 통해서 알 수 있다.3개의 초전도 소자를

면역세포가 세균,바이러스 등을 포함한 미생물 및 생체의 이물질 등 외부물질에 노 출되면 면역세포가 활성화되고,활성화된 면역세포에서 염증반응에 원인이 되는