Acute Toxicity Study on Fermented Yukmijihwangtang Extract in Mice

▒

▒

발효 육미지황탕 추출물의 급성독성 실험

박화용 ¹ , 이지혜 ¹ , 조장원 ² , 마진열 ¹

1

²

Acute Toxicity Study on Fermented Yukmijihwangtang Extract in Mice

Hwayong Park ¹ , Jihye Lee ¹ , Changwon Cho ² , Jinyeul Ma ¹

1

2

In this research, the acute toxicity of fermented Yukmijihwangtang extract was examined using male and female ICR mice, To evaluate the acute toxity and safety, 0(control group), 1250, 2500 and 5000 ㎎/㎏ of fermented Yukmijihwangtang extract were orally administered to male and female ICR mice. After single administration, we observed survival rates, general toxicity, changes of body weight for the 14 days and autopsy at 1 day following the administration according to the Regulation of Korean Food and Drug Administration. Compared with the control group, we could not find any toxic alteration in all treated groups (1250, 2500 and 5000 ㎎/㎏).

LD 50 of fermented Yukmijihwangtang extract might be over 5000 ㎎/㎏ and it is very safe to ICR mice.

keywords : Yukmijihwangtang, Fermentation, Acute toxicity, Safety, LD ⁵⁰

I. 서 론

육미지황탕은 錢乙의 저서 小兒藥證直訣에서 처음으 로 소개된 이래, 현재 임상에서 신장기능 저하, 眩暈, 健忘, 失眠, 기억력 감퇴 등에 활용되고 있는 대표적인 보신약으 로 다양한 한약재의 가감 및 여러 한약제제와의 합방을 통 하여 그 활용이 다양하게 이루어지고 있다. 육미지황탕에 대한 효능을 과학적으로 입증하기 위한 다양한 연구가 시행 되었으며, 사구체 여과기능 개선과 뇨독물질 축적의 감소, 수분평형과 뇨량의 변화, 신세뇨관의 파괴와 섬유화 완화효 과 등이 발표되어 신기능향상에 유의한 효과가 있음이 보고

되었고,

^1-4)

^5-8)

⁹⁾

^10-12)

¹³⁾¹⁴⁾

항산화

¹⁵⁾¹⁶⁾

최근 한의학계에서는 새로운 약제개발의 한 방법인 발효 한약에 대한 관심이 증가하고 있다. 발효법이란 약물을 일 정한 처리를 거친 후 일정 온도와 습도의 조건하에서 미생 물의 촉매 분해 작용에 의해 약물을 발효시키는 방법으로, 한약에 따라 일정한 방법을 채용한 후 온도와 습도가 적합 한 환경 중 발효를 진행하게 된다.

¹⁷⁾

¹⁸⁾

¹⁹⁾²⁰⁾

약재명 원산지 생산자(수입자) 소매자

숙지황 한국 경북 군위군 우보면 선곡

리 박재대 경북 영천시 대전동 596-1 진영

산약 한국 경북 영주시 태은면 지낙1

리 557 강낙구 경북 영천시 완산동 925-15 영

천현대약업사

산수유 한국 전남 구례군 산동면 원촌

리 247-2 박태간 경북 영천시 완산동 925-15 영 천현대약업사

택사 한국 전남 순천시 풍덕동

1290-16 채규삼 경북 영천시 완산동 925-15 영 천현대약업사

복령 한국 강원도 영원군 주천면 주

천리 박태화 경북 영천시 완산동 925-15 영

천현대약업사

목단피 중국 서울 서대문구 제기동

930-4 동경종합상사(주) 경북 영천시 완산동 925-15 영 천현대약업사

<Table 1> Buy of Raw Material Herbs

Herb Scientific Name Dose(g)

숙지황 Rehmanniae Radix Preparata 800.0

산약 Dioscoreae Rhizoma 400.0

산수유 Corni Fructus 400.0

택사 Alismatis Rhizoma 300.0

복령 Poria Sclerotium 300.0

목단피 Moutan Cortex 300.0

Total weight 2500.0

<Table 2> The Prescription of Yukmijihwangtang

효능을 강화하기 위하여 대표적인 장내 미생물 중 하나인 lactobacillus gasseri를 이용하여 발효였으며, 이전에 사 용례가 없는 시험물질이기에 효능규명 이전에 그 안전성에 대한 자료를 확보하고자 한계용량을 단회투여하는 급성독 성 실험을 실시하였다. 본 실험은 식품의약품안전청 고시 제 2005-60호 의약품등의 독성시험방법의 “비임상시험 관 리기준”(2005년 10월 25일)에 따라 실시하였으며, 다음과 같은 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시험물질

육미지황탕의 한약재 구성은 숙지황, 산약, 산수유, 택사, 복령, 목단피로 생산자 및 재배지역이 명확한 한약재를 구 입하여 사용하였다(Table 1). 본 연구에서는 전탕 추출법 (한국, 경서추출기 Cosmos-660)에 의한 육미지황탕 추출 을 실시하였으며 처방구성<Table 2>에 따른 각 한약재들 을 무게의 10배에 해당하는 생수(화이트, 경남 산청군 삼장 면 덕교리 800)에 넣어 1시간 침적한 다음 180분간 열탕 추출 하였다. 육미지황탕의 발효는 1M NaOH로 시험물질 의 pH를 8.0으로 조정한 후, 121℃, 1.5 기압에서 15분간 가압멸균 후, 상온까지 냉각시켜 유산균을 1%(v/v)로 접종 하였고, 37℃의 항온실에서 48시간동안 통기배양하여 액체 발효하였다. 유산균은 한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI) 식품미생물 유전자은행에서 Lactobacillus gasseri (KFRI 1092, ATCC 33323)를 분 양받았으며, 발효 된 시험물질은 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하여 실험에 사용하 였다(수율 : 36.71%).

2. 실험동물 및 사육환경

실험은 한국한의학연구원 동물실험실에서 실시하였으며, ICR(Mouse) 암⋅수컷(오리엔트 바이오, 경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1) 4주령을 사용하였다. 동물입수 시, 외관을 육안으로 검사한 후, 1주일간 시험을 실시하는 동물 실에서 순화시키고 그 중 건강한 동물을 골라 실험에 사용 하였다. 순화 기간 중, 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동 물을 암⋅수 20마리씩 선정하여 체중범위에 따른 무작위법 에 의하여 군 분리를 실시한 후, 본 실험에 사용하였다. 실 험은 실험동물윤리위원회의 승인을 거쳐 이루어졌으며, 순 화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23 ± 3℃, 상대습 도 50 ± 10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다. 그리고 실험 동물용 고형사료(PMI Nutrition, USA)와 물은 자유 섭취 조건으로 하였다.

3. 실험군 및 한방처방 투여

5주령 마우스에 대한 급성 경구독성을 평가하기 위하여 각 주령의 마우스를 각각 4개의 용량군으로 나누었다 (Table 3). 투여 용량은 시험물질의 용해도 및 실험동물에 게 투여할 수 있는 경구투여 용량을 고려하여 5000 ㎎/㎏을 고농도로 설정하였으며, 고농도를 기준으로 하여 공비 0.5 로 3개 군 및 대조군을 포함하여 모두 4개의 군으로 정하였 다. 투여 경로는 한방 임상에서 가장 널리 이용되고 있는 경구 투여법을 이용하였으며, 각 용량군의 한약재 추출물은 투여 직전에 3차 증류수에 희석하여 실험에 공시하였으며 동물을 하룻밤 절식시킨 후 배부 피부 고정법으로 고정하고 경구투여용 금속제 존데와 주사관을 이용하여 강제 경구 투 여 하였다.

Variable

＼Sex Male Female

＼Group CON YFT1 YFT2 YFT3 CON YFT1 YFT2 YFT3

＼Dose(

㎎/㎏) 0 1250 2500 5000 0 1250 2500 5000

＼No. of

animal 5 5 5 5 5 5 5 5

Bizarre Behavior 0/5* 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Ataxia 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Crouching 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Jumping 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Grooming 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Gasping 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Diarrhea 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Edema 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Lacrimation 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Letharg 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Nausea 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Nasal Discharge 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Salivation 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Paralysis 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

*: Values are expressed as No. abnormal/No. animal

<Table 5> Clinical Signs of Male and Female ICR Mice Treated with Fermented Yukmijihwangtang Extract

Group Animal

Number Number of

animal Sex Volume

(㎖/㎏) Dose (

㎎/㎏/day)

CON* 1∼5 5 Male 10 0

YFT†1 6∼10 5 Male 10 1250

YFT2 11∼15 5 Male 10 2500

YFT3 16∼20 5 Male 10 5000

CON 21∼25 5 Female 10 0

YFT1 26∼30 5 Female 10 1250

YFT2 31∼35 5 Female 10 2500

YFT3 36∼40 5 Female 10 5000

* : Control group

†: Fermented Yukmijihwangtang Extract Treatment group

<Table 3> Experimental Groups

4. 임상증상 및 부검

임상 증상은 투여 직후부터 6시간 동안 매시간 관찰하였 으며, 그 후 14일(1일 1회) 동안 일반증상 관찰법에 의하여 관찰하였다.

²¹⁾

2

5. 통계학적 방법

통계분석법은 SPSS Package program(Ver 12.0)을 이 용하여 일원배치분산분석(one-way analysis of var- iance, ANOVA)을 실시하였으며 대조군과 투여군 사이의 통계학적 유의차는 Duncan test에 의하여 p<0.05 수준에 서 유의성을 검증하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 치사율 및 LD50

<Table 4>와 같이 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 발효 육미지황탕 추출물을 경구로 단회 투여 후 14일 동안 실험동물을 관찰한 결과, 모든 암․수 ICR 마우스에서 사 망례가 관찰되지 않았다. 따라서 본 실험의 경우 한계용량 (5000 ㎎/㎏/day)까지 경구 투여하여도 사망례를 관찰할 수 없어 LD50 값은 5000 ㎎/㎏/day 이상으로 판단된다.

Sex Group Dose

㎎/㎏) (

Days after treatment LD

㎎/㎏) ( 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Male

CON 0 0/5* 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

>5000

㎎/㎏

YFT1 1250 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 YFT2 2500 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 YFT3 5000 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Female

CON 0 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

>5000

㎎/㎏

YFT1 1250 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 YFT2 2500 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 YFT3 5000 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

* : Values are expressed as No. dead/No. animal

<Table 4> Mortality of Male and Female ICR Mice Treated with Fermented Yukmijihwangtang Extract

2. 임상 증상

<Table 5>와 같이 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 발효 육미지황탕 추출물을 경구로 단회 투여 후 14일 동안 실험동물을 관찰한 결과 실험에 사용된 모든 암․수 ICR 마우스에서 보행장애, 행동이상, 웅크림, 설사, 부종, 호흡촉 박, 몸단장, 뛰어오름, 유루, 무기력증, 구토, 비루, 마비, 유 연 등 시험 물질 투여와 관련된 어떠한 임상증상의 이상소 견도 관찰되지 않았다.

3. 체중 변화

0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 발효 육미지황탕 추 출물을 경구로 단회 투여한 실험동물의 체중 변화를 관찰 한 결과는 <Figure 1, 2>와 같다. 경구 투여 후 시험물 질 투여군과 대조군 모두 개시체중에 비하여 체중이 증가 하였으나, 대조군의 체중과 비교하여 투여 전, 투여 후 1, 3, 7, 14일 모두 각 용량별의 발효 육미지황탕 추출물을 투여한 군에서 유의한 체중의 증가나 감소는 관찰되지 않 았다.

<Figure 1> Mean of body weight changes of ICR mice(male) orally treated with fermented Yukmijihwangtang extract

Control group was administered distilled water. YFT1 group was administered 1250 ㎎/㎏(day) fermented Yukmijihwangtang extract. YFT2 group was administered 2500 ㎎/㎏(day) fermented Yukmijihwangtang extract. YFT3 group was administered 5000 ㎎/㎏(day) fermented Yukmijihwangtang extract. Values are expressed as mean±SD.

<Figure 2> Mean of body weight changes of ICR mice(female) orally treated with fermented Yukmijihwangtang extract

Control group was administered distilled water. YFT1 group was administered 1250 ㎎/㎏(day) fermented Y

ukmijihwangtang extract. YFT

ukmijihwangtang extract. YFT

group was administered 5000 ㎎/㎏(day) fermented Yukmijihwangtang extract. Values are expressed as mean±SD.

4. 부검 소견

실험 종료 시, 모든 실험동물을 부검하여 주요 내부 장 기의 육안적 소견을 관찰한 결과 <Table 6>과 같이 0, 1250, 2500, 5000 ㎎/㎏ 용량의 발효 육미지황탕 추출물 을 투여한 모든 암․수 ICR 마우스에서 심장, 폐, 흉선, 간, 신장, 부신, 비장, 위, 대장 맹장 등 주요 내부 장기에 대한 외관상의 어떠한 이상 병변도 발견되지 않았다.

Variable

＼Sex Male Female

＼Group CON YFT1 YFT2 YFT3 CON YFT1 YFT2 YFT3

＼Dose

( ㎎/㎏) 0 1250 2500 5000 0 1250 2500 5000

＼No. of

animal 5 5 5 5 5 5 5 5

Heart 0/5* 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Lung 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Liver 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Spleen 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Thymus 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Kidney 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

Adrenal gland 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Intestine 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

* : Values are expressed as No. abnormal/No. animal

<Table 6> Autopsy Finding of Male and Female ICR Mice Orally Treated with Fermented Yukmijihwangtang Extract

IV. 고 찰

최근 발효한약이 한의학계에서 새로운 약제개발의 방법 으로 관심이 증가되고 있다. 발효한약이란 한약재를 미생 물이 잘 이용할 수 있게 찌거나 삶은 다음, 공기 중의 미생 물 또는 유산균과 같은 순수 분리 미생물을 이용하여 발효 한 한약제 말하며, 약리효능 강화 및 새로운 약효를 발현 시킬 수 있는 방법으로 주목받고 있다. 육미지황탕은 신기 능저하에 주로 사용되어온 한방처방으로 실험동물에 대하 여 신기능 향상효과

^1-4)

^5-12)

였으며, 투여용량은 단회경구투여 최고용량인 5000 ㎎/㎏

22)

50

㎏ 이상으로 생각된다. 또한 시험기간 동안 각 용량의 발 효 육미지황탕 추출물을 투여한 시험물질 투여군과 대조 군이 경구 투여 후 1, 3, 7, 14일의 체중에서 유의한 차이가 나타나지 않았고, 전 시험기간 동안 특이한 임상증상이 나 타나지 않았으며, 부검소견에서도 내부 장기에 대한 어떠 한 육안적 이상병변도 관찰되지 않았다. 본 실험에서는 단 회투여 독성시험의 경우, 육안적 이상소견이 관찰된 장기 및 조직에 대하여 병리조직학적 검사가 포함되어야 한다 는 “의약품등의 독성시험기준(식품의약품안전청고시 제 2005-60호, 2005. 10.21)”에 따라 모든 실험동물에서 이 상소견이 관찰되지 않았기에 조직검사는 시행하지 않았으 나, 단회경구투여 독성실험의 저독성 기준인 2000 ㎎/㎏

을 훨씬 상회하는 5000 ㎎/㎏ 용량에서 실험동물에 독성 이 나타나지 않았기에 발효 육미지황탕은 급성독성이 없 는 안전한 물질로 생각된다.

V. 결 론

발효 육미지황탕의 급성독성을 실험적으로 평가하고자 ICR 마우스에 투여한 후 임상증상 및 부검소견, 그리고 치 사율과 체중변화 등을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻 었다.

1. 시험기간 중 발효 육미지황탕 추출물 투여군 및 대조 군에서 사망동물이 관찰되지 않아, LD

50

2. 시험물질 발효 육미지황탕 추출물 투여에 의한 어떠한 독성증상도 관찰되지 않았다.

3. 발효 육미지황탕 추출물 투여로 인한 체중변화 역시 관찰되지 않았다.

4. 실험 종료 시, 모든 동물의 주요 내부 장기에 대하여 육안적 병변을 관찰하였으나 이상 병변은 관찰되지 않았다

이상의 결과로 보아 발효 육미지황탕은 실험동물에 대하 여 급성 독성이 없는 한의약물로서 그 효능규명을 통한 활 용이 기대된다.

Ⅵ. 감사문

이 연구는 교육과학기술부 지원 한국한의학연구원 기관 고유사업 K09040의 지원을 받아 수행되었음.

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