OPU 채란계절이 한우의 난자 품질 및 발달 능력에 미치는 영향
김성수1․최병현1․조현태1․진종인1․하아나1․민찬식3․조규완4․공일근1,2†
1경상대학교 응용생명과학부 축산학전공(BK21Plus), 2경상대학교 농업생명과학연구소,
3경상남도 농업기술원, 4경상대학교 수의과대학
Effect of Collection Seasons on the Oocyte Quality and Developmental Competence of Oocytes Derived from Korean Native Cows (Hanwoo)
by Ovum Pick-Up
Seong-Su Kim
1, Byung Hyun Choi
1, Hyun-Tae Jo
1, Jong-In Jin
1, A-Na Ha
1, Chan-Sik Min
3, Gyu-Wan Cho
4and Il-Keun Kong
1,2†1
Department of Animal Science, Division of Applied Life Science (BK21Plus), Jinju 660-701, Republic of Korea,
2
Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea,
3
Gyeongsangnam-do Agricultural Research and Extension Services, Jinju 660-985, Republic of Korea,
4
Colleage of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea
ABSTRACT
Implementation of smart embryo technologies in cattle e.g. ovum pick-up followed by in vitro embryo production (OPU-IVP). Seasonal variation is important factor for follicular growth, oocytes quality, quantity and developmental competence. Therefore the aim of present study was carried out to investigated whether the seasons (hot and cool) effect on follicular development, oocyte recovery and subsequent embryo development. Follicular oocytes were aspirated from Korean native cows (Hanwoo) by the ovum pick-up (OPU) method, which was performed 24 times during two different seasons, the hot (July to September) and cool (October to December), from OPU donors. The recovered oocytes were classified according to morphological categories and used for in vitro embryo production (IVEP). The mean number of total follicles was significantly higher (p<0.05) during the hot season (18.32 ± 2.26) compared to cool season (15.41
± 3.34). Furthermore, seasons did not significantly effect on the number of oocytes recovered (hot season: 41.16%
vs. cool season: 46.14%). However, the average number of Grade A oocytes was significantly greater during hot (1.75
± 1.86) season compared to the cool season (1.00 ± 1.46), but there was no significant difference of other grades oocytes. The cleavage rate (hot: 66.67% vs. cool: 63.3%) and embryo development (hot: 58.95% vs. cool: 56.97%) did not differ significantly between the seasons. In conclusion, the results of present study suggest that the season (hot and cool) does not have effects on the oocyte recovery and embryo developmental competence of in vitro cultured embryos.
(Key words : cow, follicle, oocyte, embryo, ovum pick-up, in vitro development competence)
*
본 연구는 Next-Generation BioGreen 21 Program (Grant No. PJ009587022014), IPET (Grant No. 110020-5 and 112020-3) 및 농촌진흥청 (Grant No. 0077572014) 의 지원에 의하여 수행되었음. 하아나는 교육부 BK21Plus 사업의 장학금을 수혜 받았음.
†
Correspondence : Il-Keun Kong ([email protected]).
서 론
낮이 점점 길어지는 여름 계절, 태양의 고도가 높아져 일사 가 강해져 높아진 기온은 소의 수정률 감소에 대한 주요 책임 의 요인 중 하나로 밝혀졌다. Badinga 등(1985)은 소의 수정 률은 시원한 계절에 비해 더운 계절에 수정률이 감소한다고 보고하였다. 또한, 소의 배아 생존율은 시원한 계절보다 더운
계절이 낮은 것으로 나타났다(Monty Jr와 Racowsky, 1987).
이러한 현상은 열 스트레스가 난포 발달의 스테로이드 생산 과 유전자 발현의 패턴을 변화시킴으로써 난자의 품질을 저 해하여 발생된다고 보고되었다(Hansen, 2007). 난자의 능력에 높은 온도의 직접적인 영향은 체외 배양에서 증명되었다. Payton 등(2004)의 보고에 따르면, 12시간 동안 높은 온도(41℃)에서 소 난자의 난핵포 단계(Germinal vesicle stage) 때, 직접적인
Fig. 1. Representative photograph of ovum pick-up (OPU) process for collection of in vivo oocytes.
노출을 가하였을 때, 수정 후 완전한 핵 성숙과 발달을 위한 능력을 감소시키는 것으로 보고하였다. 일부 연구에서는 난자 를 성숙하기 전 또는 성숙 중에 고온에 직접적인 노출을 가할 경우, DNA의 분절화와 세포골격 붕괴가 난자에서 발생하는 것으로 보고 있다. 또한 열 스트레스의 이러한 해로운 영향은 체외 수정 후 배반포로 발달하는 난자의 비율을 감소시킨다 고 한다(Roth와 Hansen, 2004).
초음파 유도 난자 채취 또는 Ovum Pick-Up(OPU)은 체외 배아 생산과 함께 점차적으로 소의 개량 및 육종 사업에 상용 화되고 있다(Van Wagtendonk-de Leeuw, 2006; Mapletoft와 Hasler, 2005). 이 기술은 생식 능력을 감소하지 않고, 같은 암 소에서 난자를 반복적으로 회수할 수 있다. 또한 OPU 기술은 임신 초기에 채란을 하여도 태아의 발달에 해로운 영향을 주 지 않는다(Meintjes 등, 1993). 하지만 새로 생겨나는 난포의 수는 계절에 따라 다르다는 보고(McNatty 등, 1984; Boni 등, 1997)와 OPU 기술로 체외 생산된 배아의 비율도 채란 전 열 스트레스에 노출된 소에서 난자를 회수할 때 감소하는 것으 로 나타났다(Torres-Júnior 등, 2008).
이에 본 연구는 OPU를 실시하는 계절의 온도에 따라 공란 우의 난포 생성, 난자 품질과 발달 능력에 미치는 영향을 확 인하고자 실시하였다.
재료 및 방법
1. Ovum Pick-Up(OPU)
본 연구는 가장 날씨가 더운 7월부터 9월까지를 Hot season, 10월부터 12월까지 Cool season으로 두 그룹으로 나누어, 각 그룹 당 공란우 4두를 사용하였다. 난자 회수를 위한 난포란의 채란은 1주일에 2회, 3∼4일 간격(진 등, 2010; 최 등, 2011)으 로, 3개월 간 24회 채란을 실시하였다. 먼저 공란우는 보정 틀 에 고정시켜 움직임을 최소화한 후, 2% lidocaine 마취제를 약 3∼4 ml를 경막 외 국소 마취를 시킨 후, 꼬리를 고정하고, 흐 르는 물로 외음부 세척을 하였다. 그 후 70% 알코올과 2%로 희석된 povidone iodine으로 외음부를 소독하였다. 초음파 진 단기는 준비된 transducer guide 내에 장착되어 있고, guide는 질 내로 삽입하여 난소의 난포를 관찰할 수 있게 고안되었다.
직장 검사용 장갑을 착용하고 난소를 미리 점검한 후, 질 벽을 통해 난소를 견인하여 transducer에 최대로 밀착시킨 후 난포 를 확인한다. 그런 다음 18 G 일회용 needle을 삽입하여 monitor 상에 needle을 횡 절단할 수 있도록 위치시켰다. 그 후 질 벽을 관통하여 복강 내로 들어가 난소에서 확인된 난포 내에 needle 을 삽입한 후 vacuum pump의 foot switch를 작동시켜, 미성숙 난자와 포함된 난포액을 vacuum pump에 의해 흡입하여 배지 에 정치시켰다. 초음파 화상에서 난포가 완전히 사라질 때까 지 vacuum pump를 작동시켜 음압을 유지시켜 2∼6 mm의 난 자를 흡입하게 하였다(Fig. 1 & 2). 2∼3개의 난포 흡입 후에 배지로 세척하여 혈액과 엉켜 붙는 현상을 방지하였으며, 난
Fig. 2. Transvaginal ultrasound guided image of bovine ovary. Red circle indicates the follicles of ovary pre-aspiration (A) and post-aspiration (B) of oocytes.
Fig. 3. Morphological grading of immature oocytes retrieved by ovum pick-up process.
포의 흡입이 끝날 때까지 반복하였다. 또한 10 IU Heparin을 첨가하여 엉켜 붙는 현상을 더욱 줄이도록 하였다. 이렇게 채 취된 체내 유래 난자는 세포질의 색깔과 난구 세포 평가에 근 거하여 Grade 1∼4까지 분류하였다(Fig. 3; Merton 등, 2003;
Petyim 등, 2003).
2. 체외 성숙
분류된 난자의 체외 성숙은 Deb 등(2011)의 방법으로 진행 하였다. 성숙 배양액(TCM-199)에 10%(vol/vol) fetal bovine serum(FBS, Gibco), 호르몬 (10 μg/ml FSH, 1 μg/ml estradiol- 17β)과 항생제(100 U/ml penicillin G, 100 μg/ml streptomycin)
을 첨가하여 체외 성숙을 유도하였고, 이와 같이 준비된 체외 성숙 배양액은 18시간 이상 전 배양을 실시하여 평형을 유도 하였다. 체외 성숙은 TCM-199 배양액에 난포란을 난구세포 의 충실도에 따라 Grade 1, 2, 3, 4로 구분(Fig. 3; Merton 등, 2003; Petyim 등, 2003)하여 98∼99% 습도, 38.5℃, 5% CO2
배양기에서 23∼24시간 동안 배양을 실시하여 난구세포의 팽 창과 세포질의 충실도 등으로 체외 성숙을 판정하여 체외 수 정에 공시 여부를 판단하였다.
3. 체외 수정
체외 수정 배양액에 6 mg/ml BSA를 첨가하고, 항생제(100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin)를 첨가한 배양액을 5 ml 분주하여, 배양기에서 18시간 전 배양을 실시하여 평형 을 유도하였다. 체외 수정 시 액체 질소에서 한우 동결 정액 straw를 꺼내어서 36℃에서 1분간 융해 후 10 ml 정자 세척액 (D-PBS, Gibco)에 넣은 후 1,800 rpm에서 5분간 원심분리를 하여서 정자 펠렛을 얻은 다음 20 μg/ml heparin을 넣어 배양 기에서 15분간 수정능 획득을 시킨 후 수정능이 획득된 정자 의 최종 농도가 1 × 106 sperms/ml가 되도록 한 후, 98∼99%
습도, 38.5℃, 5% CO2 배양기에서 난자와 같이 넣은 후 24시 간 동안 체외 수정을 유도하였다.
4. 체외 배양
체외 배양은 CR1aa 배양액(Rosenkrans 등, 1993)에 3 mg/
ml BSA, 10% FBS를 첨가하여 이용하였다. 체외 수정 18∼22 시간 후에 3 mg/ml BSA 첨가된 CR1aa 배양액으로 2∼3회 세척한 후 3일간 체외 배양을 실시하여 분할이 일어난 수정란 만을 선발하여 10% FBS가 첨가된 CR1aa 배양액으로 2차 체 외배양을 3일간 한 후 배반포를 생산하였다(Fig. 4).
5. 통계 처리
본 연구의 모든 통계 처리는 SPSS 19.0 for Window(Statis- tical Package for Social Science, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 를 이용하였으며, 유의 수준 5%에서 검증하였다. 난포 생성 수, 난자 수, 난자 회수율, 등급별 난자 출현율, 수정률, 배반 포 발달율은 t-test를 이용하여 유의성을 검정하였다(p<0.05).
결 과
1. 계절에 따른 난포 생성 수
계절의 영향이 OPU 공란우의 난포 생성 수에 미치는 결과 는 Table 1과 같다. Hot season 그룹은 7월부터 9월까지, Cool season 그룹은 10월부터 12월까지 진행한 결과, 총 난포 생성 개수는 1,154 개(18.32 ± 2.26), 971(15.41 ± 3.34)개로 Hot
Fig. 4. Representative photographs of bovine blastocysts. Day 8 bovine blastocysts developed from oocytes retrieved during hot seasons (A) and cool seasons (B).
Table 1. Effects of season on the numbers of follicles and oocytes aspirated
Type of items No. of oocytes collected (Mean ± SEM) Hot season Cool season Total follicles no. 1,154 (18.32 ± 2.26)* 971 (15.41 ± 3.34) Total oocytes 475 (7.54 ± 3.14) 448 (7.11 ± 3.42) Recovery rate (%) 41.16 46.14 There was significantly different between both seasons(* p<
0.05).
season 그룹이 유의적으로 높았다(p<0.05).
2. 계절에 따른 채취 난자 수 및 회수율
계절에 따른 난자 채취 수와 난자 회수율도 Table 1과 같다.
Hot season 그룹의 475개(7.54 ± 3.14), 41.16%로 cool season
그룹 448개(7.11 ± 3.42), 46.14%와 비교하여 유의적인 차이 가 없었다(p<0.05).
3. 계절에 따른 난자의 등급
계절에 따른 난자의 등급을 비교한 결과이다(Table 2). OPU 를 통하여 회수된 난자 등급은 Grade A는 hot season 그룹 110개(1.75 ± 1.86), cool season 그룹 63개(1.00 ± 1.46)로 hot season 그룹이 cool season 그룹과 비교하여 유의적으로 높은 것으로 나타났다(p<0.05). 하지만 다른 등급인 Grade B는 87 개(1.38 ± 1.60) vs. 97개(1.54 ± 1.39), Grade C는 166개(2.63
± 2.43) vs. 170개(2.70 ± 2.04), Grade D는 112개(1.78 ± 2.65) vs. 118개(1.87 ± 1.86)로 hot season과 cool season 간의 유의 적인 차이가 없었다(p<0.05). (숫자 뒤 단위)
4. 계절에 따른 수정률 및 배반포 발달율
계절에 따른 체외 수정 후의 수정률과 배반포 발달율의 결 과는 Table 2와 같다. 체외 수정 후의 수정률은 hot season과 cool season 각각 242(66.67%)와 209(63.3%)로 유의적인 차이 를 보이지 않았고, 배반포 발달율도 214(58.95%) vs. 188(56.97
%)로 수정률과 마찬가지로 유의적인 차이를 보이지 않았다
(p<0.05).
고 찰
계절 및 환경의 높은 온도는 난포의 발달에 영향을 미치며, 난자 능력의 저하 및 배아의 발달을 억제한다(Roth, 2008;
Rensis와 Scaramuzzi, 2003). 고온으로 인한 열 스트레스는
OPU를 사용하여 회수된 난자의 발달 능력과 품질을 감소시
Table 2. Effects of season on the developmental competence of oocytes aspirated from Korea native cows (Hanwoo)
Type of items No. of oocytes/session (Mean ± SEM) Hot season Cool season Total oocytes 475 (7.54 ± 3.14) 448 (7.11 ± 3.42) Grade A 110 (1.75 ± 1.86)* 63 (1.00 ± 1.46) Grade B 87 (1.38 ± 1.60) 97 (1.54 ± 1.39) Grade C 166 (2.63 ± 2.43) 170 (2.70 ± 2.04) Grade D 112 (1.78 ± 2.65) 118 (1.87 ± 1.86) Cleavage no. (%) 242 (66.67) 209 (63.3) Blastocyst no. (%) 214 (58.95) 188 (56.97) There was significantly different between both seasons(* p<
0.05).
키는 것으로 보고되었다(Rocha 등, 1998). 또한 여름 동안에 도축된 젖소의 난포에서 채취된 난자는 체외 성숙(IVM)과 체 외 수정(IVF) 후 배반포 발달 능력이 감소되는 것이 입증되었 다(Al-Katanani 등, 2002). 또한 젖소에서 온습도 지수(Tem- perature humidity index: THI)가 71 기점으로 수정률이 감소 되는 것으로 보고되었다(Bruno 등, 2009). 본 연구에서의 Hot season은 평균 온습도 지수(THI)가 번식 능력에 영향을 미칠 수 있는 73.2였다. 그러나 본 연구에서는 hot season 동안 공 란우에서 생성된 난포 수와 채란된 난자의 A등급의 비율은 cool season보다 높았다. 계절의 영향에 의한 난자의 회수율은 난자 채란 기법의 차이는 있지만, 기존의 과배란 처리 기법을 이용한 손 등(2008)의 연구 결과와 같이 계절에 따른 난자 회 수율의 차이를 보이지 않았다.
공란우에서 채란된 난자의 체외 성숙(IVM) 및 체외 수정 (IVF) 후 난자의 발달 능력에 대한 뚜렷한 계절 효과는 없었 다. 또한 배아의 품질은 hot season(7∼9월)과 cool season(10
∼12월)이 유사했다. 이것은 Rocha 등(1998)의 연구에 의해 열 스트레스에 노출된 고온 기후에 맞게 적응을 한 품종은 시 원한 기후에 품종보다 번식 기능에 악 영향을 덜 받는다고 증 명되었다. 또한 난자 및 배아 수준에서 높은 온도에 대한 감 수성은 유전적으로 차이가 있다고 보고되었다(Rocha 등, 1998;
Hernández-Cerón 등, 2004). 따라서 난자 및 배아 발달과 품질 에 따른 계절의 영향은 높은 온도에 대한 감수성 유전적 차이 가 원인일 수 있다.
젖소에서는 난자의 품질 및 초기 배아 발달의 장애는 불균 형적인 에너지 상태 및 좋지 못한 신체 상태(Kendrick 등, 1999)와 연간된 것으로 알려져 있다. 젖소에 열 스트레스가 건초 섭취를 감소시켜 부정적인 에너지 균형의 기간을 연장 시킨다(Fuquay, 1981). 부정적인 에너지 균형의 해로운 효과 는 열 스트레스를 일으키는 환경 온도의 증가에 의해서 증강 될 수 있다. 따라서 열 스트레스가 직간접적으로 번식 능력에 영향을 미치는 것으로 보인다. 하지만 본 연구에서는 각 그룹 간의 동일한 사양 관리 및 사육 환경을 조성을 해줌으로써, 열 스트레스와 같은 계절의 영향적인 부분을 극복할 수 있다 는 것을 제시하였다.
결론적으로 우리의 연구 결과는 한우에서 두 계절(hot and cool season) 간의 난포 수와 난자의 A등급 출현율은 hot season 에서 높게 나타났지만, 채란된 난자의 수와 회수율, 체외 수정 률 및 배반포 발달 능력은 차이를 보이지 않았다. 이에 두 계 절 차이에 따른 번식 능력에 미치는 영향은 미비한 것으로 사 료된다.
적 요
본 연구에서 한우를 공란우로 사용하여 OPU 방법으로 가 장 더운 계절의 hot season과 선선한 cool season의 두 계절의 차이에 따른 생성된 난포의 수, 난자 회수율, 난자 등급율, 수 정율 및 배반포 발달 능력을 분석하여, 두 계절이 공란우의 번식 능력에 미치는 영향에 관하여 조사하였다.
1. 계절의 영향이 OPU 공란우의 난포 생성 수에 미치는 결과 는 난포 생성 개수는 1154개(18.32 ± 2.26), 971개(15.41 ± 3.34)로 hot season 그룹이 유의적으로 높은 것을 알 수 있 었다(p<0.05).
2. 계절에 따른 난자 수 및 난자 회수율은 hot season 그룹의 475개(7.54 ± 3.14), 41.16%로 cool season 그룹 448개(7.11
± 3.42), 46.14%와 비교하여 유의적인 차이가 없었다(p<0.05).
3. OPU를 통하여 회수된 두 계절별 난자 등급은 Grade A는 Hot season 그룹 110개(1.75 ± 1.86), Cool season 그룹 63 개(1.00 ± 1.46)로 hot season 그룹이 cool season 그룹과 비 교하여 유의적으로 높았다(p<0.05). 하지만 다른 등급인 Grade B는 87개(1.38 ± 1.60) vs. 97개(1.54 ± 1.39), Grade C는 166개(2.63 ± 2.43) vs. 170개(2.70 ± 2.04), Grade D는 112개(1.78 ± 2.65) vs. 118개(1.87 ± 1.86)로 hot season과 cool season 간의 유의적인 차이를 보이지 않았다(p<0.05).
4. 계절에 따른 체외 수정 후의 수정률은 hot season과 cool season 각각 242(66.67%)와 209(63.3%), 배반포 발달율 214 (58.95%) vs. 188(56.97%)로 수정률과 배반포 발달율은 유 의적인 차이가 없었다(p<0.05).
본 연구의 결과로 계절에 따른 영향에 의해 공란우의 난포 생성수와 A등급의 난자 출현율에서 유의적인 차이를 보였다.
하지만 나머지 등급의 난자 출현율, 수정률 및 배반포 발달율 은 차이가 없는 것으로 보아, 계절의 차이로 인한 한우 공란우 의 번식 능력에 미치는 영향은 미비하다고 판단된다.
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Received September 5, 2014, Revised September 20, 2014, Accepted September 23, 2014
