녹용 혼합 추출물의 면역기능 조절 효과 최지해

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(1)J Korean Soc Food Sci Nutr 49(1), 19～27(2020). 한국식품영양과학회지 https://doi.org/10.3746/jkfn.2020.49.1.19. 녹용 혼합 추출물의 면역기능 조절 효과 최지해1․김나영1․김선영1․박혜령2․유광원3․이현순1 1. 국가식품클러스터지원센터 경기대학교 식품생물공학과 3 한국교통대학교 식품영양학과 2. Immunoregulatory Effects of Deer Antler Mixture Extract Ji-Hae Choi1, Na Young Kim1, Sun Young Kim1, Hye-Ryung Park2, Kwang-Won Yu3, and Hyun-Sun Lee1 1. Agency for Korea National Food Cluster (AnFC) Department of Food Science and Biotechnology, Kyonggi University 3 Department of Food and Nutrition, Korea University of Transportation 2. ABSTRACT A mixture of Cervus nippon (deer antler) and ten kinds of medicinal herbs was manufactured to develop new bioactive ingredients with immunoregulatory effects. Among them, both the ethanol extract and water extract of Acanthopanax sessiliflorum showed significant nitric oxide (NO) production and did not affect the Raw 264.7 cell viability. The optimal mixing ratio of C. nippon and A. sessiliflorum was found to be 1:1. The mixture (CME-PI, C. nippon mixture extract) showed higher immunoregulatory effects on the production of NO, IL-6, and TNF-α than a single treatment. In addition, the mRNA gene expression levels of IL-6, TNF-α, iNOS, and COX2 increased significantly, as determined by real-time PCR analysis. CME-PI showed considerably high proliferation activity in splenocytes, and cytokine production, such as IL-2 and IFN-γ, at a dose of 1,000 μg/mL. In an assay of the natural killer (NK) cell activity, the intravenous administration of CME-PI stimulated significant NK cytotoxicity against Yac-1 tumor cells in a dose-dependent manner. These results showed that CME-PI has superior potential as a material in high-added functional foods. Key words: deer antler, immunoregulation, Raw 264.7, Acanthopanax sessiliflorum, macrophage. 서. 론. 가 외부 물질을 인식하여 제거하거나 탐식작용(phagocytosis)을 통해 제거되도록 도와주는 역할을 한다(Greenberg. 인체의 면역계(immune system)는 외부에서 유입되는. 와 Grinstein, 2002; Hoebe 등, 2004). 선천면역계에서 제. 병원체와 이물질을 제거하거나 이들로 인해 발생하는 염증. 거되지 못한 외부 물질들의 경우 antigen presenting cell. 과 같은 질병의 발생을 억제해 인체를 보호함으로써 체내. (APC)에 의해 전달되어 후천면역반응에서 활성화된 T세포. 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다(Abo 등, 2005;. 나 B세포에 의해 파괴되기도 한다(Greenberg와 Grinstein,. Banchereau와 Steinman, 1998). 그러나 이러한 면역체계. 2002; Son 등, 1999). 국내 소득의 증가와 생활 수준의 향상. 가 항상성의 불균형을 일으켜 면역체계가 깨지면 질병 발생. 및 국내 인구의 노령화로 인하여 소비자들이 건강한 삶을. 이 쉬워지기 때문에 면역조절 능력을 키우는 것이 건강한. 지향하고자 하는 관심과 욕구가 지속해서 증가함에 따라 다. 인체를 유지하기 위한 중요한 역할 중 하나다. 면역계는 크. 양한 건강기능식품들이 개발되어야 하는 동시에, 이들의 유. 게 선천면역(innate immunity)과 후천면역(adaptive im-. 효 성분 및 생리활성에 대한 과학적인 증명까지 요구하는. munity)으로 분류된다(Abo 등, 2005). 선천면역은 항원에. 경향이 강해지고 안전성에 대한 문제까지도 소비자들은 요. 비의존적이고 빠르게 일어나는 반응으로 대식세포(macroph-. 구하고 있다. 최근 ‘2017 건강기능식품 시장현황 및 실태조. age), 수지상세포(dendritic cell)와 자연살해세포(NK cell). 사 자료’에 따르면 ‘면역력 개선’을 위해 건강기능성식품을 구매하는 소비자가 약 47%로 나타났다. 소비자들이 면역증. Received 6 November 2019; Accepted 9 December 2019 Corresponding author: Hyun-Sun Lee, Agency for Korea National Food Cluster (AnFC), Iksan, Jeonbuk 54576, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-63-720-0544 Author information: Hye-Ryung Park (Researcher), Kwang-Won Yu (Professor). 진 및 면역조절과 관련된 건강기능식품을 찾고자 하는 욕구 는 지난 몇 년 동안 꾸준히 증가하는 추세이며, 이에 따라 면역증진 소재 개발 연구도 활발히 진행 중에 있다(Greenspan 등, 1994; Huh, 2014; Tong 등, 2011). 녹용은 매화.

(2) 최지해 ․ 김나영 ․ 김선영 ․ 박혜령 ․ 유광원 ․ 이현순. 20. 록(Cervus nippon Temminck) 또는 마록(Cervus elaphus. 녹용 추출물(CN)과 오갈피 추출물(AS)을 1:1(dry base)로. Linnaeus) 및 동속 근연동물의 털이 밀생되고 골질화되지. 혼합하여 녹용 혼합 추출물(CME-PI)을 제조하였다.. 않은 어린 뿔로 중국 및 일본 등의 동양권 국가에서 오래전부 터 활용되고 있는 중요한 강장 생약재이다(Choi 등, 2005).. 세포독성. 그러나 국내 생산량이 많지 않고 가격이 높아 한의원, 한방,. Raw 264.7 세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위. 병원 등에서는 거의 공급되지 않고 있으며, 유통체계도 열악. 해 96-well plate에 2×105 cells/well이 되도록 분주한 후. 한 실정이다. 그럼에도 불구하고 최근 연구에 따르면 녹용은. 시료를 100, 250, 500 μg/mL의 농도로 각각 처리하고 24시. 혈압강하(Tsujibo 등, 1987), 조혈기능(Lee 등, 2012; Park. 간 배양하였다. CellTiter 96® AQueous non-radioactive. 등, 2015), 고콜레스테롤 혈증 개선(Yong, 1976), 항염증 효. cell proliferation assay(MTS, Promega, Hollywood, CA,. 과(Dai 등, 2011), 면역증강 효과(Zha 등, 2013) 등의 약리. USA) 시약을 20 μL 처리하여 37°C, 5% CO2 incubator에. 활성이 있다고 보고되면서 그 소비량은 매년 증가하는 추세. 서 3시간 배양한 후, microplate reader를 이용하여 흡광도. 이다. 그러나 산지 및 채취 시기와 부위에 따라 약효나 성분. 490 nm에서 optical density(O.D.)를 측정하였다. 세포 증. 상의 차이를 많이 보여 객관적인 연구 자료보다는 한의학적. 식능(cell viability, %)은 시료를 처리하지 않은 negative. 인 측면에서 주관적인 견해에 따르는 것이 많기 때문에 항상. control과의 비율로 나타내었다.. 논란의 여지가 대두된다(Lee 등, 2003). 따라서 객관적인 연구 분석에 대한 기초자료가 필요하지만 연구 분석에 대한. Absorbance of treated sample Cell ＝ ×100 viability (%) Absorbance of control. 자료는 상당히 부족하다. 이를 토대로 본 연구에서는 단가를 낮추기 위해 녹용에 다양한 약리활성을 가졌다고 이미 보고. Nitric oxide(NO) 및 cytokine 측정. 된 여러 한약재를 혼합하고 선천면역계의 대표적인 면역세. Raw 264.7 세포를 96 well plate에 2×105 cells/well의. 포인 대식세포 및 자연살해세포 등의 면역조절 효과에 대한. 농도로 seeding 한 후 37°C, 5% CO2 조건에서 2시간 동안. 기능성을 입증함으로써 녹용의 연구 분석에 대한 기초근거. 세포를 부착한 다음 여기에 일정한 농도의 시료를 24시간. 자료로 제공하고자 하였다.. 처리하였다. 이후 배양액 내에 분비된 NO 농도를 Griess reaction(Amano와 Noda, 1995)에 기초한 NO coloricmet-. 재료 및 방법. ric assay kit(R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA) 으로 분석하고 세포가 생산한 NO 농도는 sodium nitrate로. 실험재료. 표준곡선을 작성한 후 NO 함량을 정량하였다. 반면 시료. 본 실험에 사용한 녹용은 충북 청주 사슴클러스터사업단. 처리 후 세포 배양액 내의 cytokine(IL-6, TNF-α)의 양을. 으로부터 제공받아 사용하였으며, 10종(감초, 참당귀, 백작. 측정하기 위해 Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent. 약, 두충, 산약, 오갈피, 백복령, 길경, 천궁, 천마) 한약재의. Assay(ELISA) kit(R&D System Inc.)을 이용하여 제조사. 경우 대한한약국(Iksan, Korea)에서 구입하여 분말화한 후. 의 지침에 따라 측정하였다.. 실험에 사용하였다. 세포 실험을 진행하기 위해 사용된 대식 세포주 Raw 264.7 cell line은 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 분양받 아 사용하였다.. Real-time PCR을 통한 유전자 발현 측정 Total RNA는 trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 시 약을 사용하여 추출하였으며, cDNA 합성은 cDNA synthesis kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을. 한약재 추출물 제조. 사용하여 25°C에서 5분, 42°C에서 30분, 85°C에서 5분 동. 한약재 10종은 각각 10배의 증류수 및 주정(95%)을 가하. 안 heating 후 반응을 종결시켰다. mRNA의 발현을 정량적. 여 4시간 동안 환류 추출한 후 여과, 감압 농축한 다음 동결. 으로 표현하기 위해 real-time PCR을 측정하였다. 합성된. 건조 하여 실험에 사용하였다.. cDNA 1 μL, iQ. TM. SYBR Green Supermix(Bio-Rad Labor-. atories) 10 μL와 각 primer의 forward와 reverse를 혼합. 녹용 혼합 추출물 제조. 하여 조건에 맞게 증폭시켰다. Real-time PCR 반응에 사용. 녹용 혼합 추출물(CME, Cervus nippon mixture ex-. 한 forward (F)와 reverse (R) primer의 염기서열은 다음. tract)은 충북 청주 사슴클러스터사업단으로부터 제공받아. 과 같다. β-Actin: forward primer 5’-ACCTTCTACAAT. 사용하였다. 제조방법을 간략히 기술하면 녹용은 상대 : 중. GAGCTGCG-3’, reverse primer 5’-CTGGATGGCTAC. 대 : 하대를 1:1:1로 혼합 후 18배의 물을 첨가하여 103°C. GTACATGG-3’, TNF-α: forward primer 5’-GTACCTT. 에서 24시간 2회 추출하여 농축한 다음 동결건조 하였다. GTCTACTCCCAGGTTCTC-3’, reverse primer 5’-TG. (CN). 오갈피(진피) 추출물은 18배의 물을 첨가하여 103°C. GAAGACTCCTCCCAGGTATATG-3’, IL-6: forward. 에서 24시간 2회 추출하여 농축 후 동결건조 하였다(AS).. primer 5’-CCAGTTGCCTTCTTGGGACTG-3’, reverse.

(3) 녹용 및 오갈피 혼합 추출물의 면역증진 효과. primer 5’-TCCTCTGTGAAGTCTCCTCTCC-3’, iNOS: forward primer 5’-AGATCGAGCCCTGGAAGACC-3’, reverse primer 5’-TCTGACCCGTGAAGCCATGA-3’, COX-2: forward primer 5’-CCCAGCACTTCACCCATC. 21. 의해 계산하였다. NK cell activity (%)＝ Experimental－Effector spontaneous ×100 Target maximum－Target spontaneous. AG-3’, reverse primer 5’-GGCGCAGTTTATGTTGTC. 통계처리. TGTC-3’.. 모든 실험 결과는 IBM SPSS Statistics 21(IBM Co.,. 마우스 비장세포 증식능 및 cytokine 측정. Armonk, NY, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석을 수행. 마우스로부터 비장세포(splenocyte)를 분리하기 위해 경. 하였으며 측정항목에 대한 평균과 표준편차로 나타내었다.. 추탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출. 시료 및 처리 농도 간의 유의적 차이는 P<0.05 수준에서. 하여 RPMI 1640 배지로 씻은 후 멸균 유리봉으로 가볍게. Duncan’s multiple range test를 실시하였다.. 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포 현탁액을 200 mesh stainless steel sieve(Sigma-Aldrich Co., St. Louis,. 결과 및 고찰. MO, USA)에 통과시킨 후 50 mL의 원심관에 넣고 4°C, 3,000 rpm에서 10분간 원침시킨 다음, cell pellet을 lysing. 혼합 한약재 후보물 10종의 세포 증식능 및 NO 생산능. buffer(tris-buffered ammonium chloride; 0.87% NH4Cl,. 녹용의 혼합소재 선정을 위하여 한의학적으로 사용된 녹. pH 7.2)에서 5분간 현탁시켜 적혈구를 완전히 제거하였다.. 용대보탕 소재, 면역 관련 고시형 소재 및 전문가 자문을. 이때 회수된 세포는 RPMI 1640 배지로 재차 원심분리(4°C,. 거쳐 10종의 한약재 후보를 선발하였다(Table 1). 면역증진. 3,000 rpm, 10 min) 하여 비장세포를 회수하였다. 이후. 효과를 검토하기 전에 10종의 한약재 후보 추출물이 Raw. 6. 96-well plate에 splenocyte를 4.6×10 cells/mL의 농도. 264.7 세포 독성에 영향을 주는지 알아보기 위해 MTS 분석. 로 seeding 한 후 다양한 농도의 시료를 처리한 다음 50시간. 법을 이용하여 세포 증식능을 측정하였다. 한약재 후보 열수. 동안 배양하였다. MTS 용액을 처리하고 37°C incubator에. 추출물을 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 천마. 서 30분 동안 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여. (Gastrodia elata)를 제외한 모든 한약재 후보 추출물에서. 490 nm에서 흡수되는 양을 측정하였다. 세포 증식능은 어. 세포독성은 나타나지 않으나, 감초(Glycyrrhiza uralensis),. 떠한 처리도 하지 않은 control과의 비율로 나타내었다. 반. 백복령(Poria cocos) 열수 추출물을 처리하였을 때 500 μg/. 면 splenocyte 배양액 내에서 cytokines(IL-2, IFN-γ) 양을. mL의 농도에서 시료 무처리군(100%) 대비 181.3%와 176.4. 측정하기 위해 ELISA kit(R&D System Inc.)을 이용하여. %의 세포 증식능을 보여주었다. 또한 한약재 후보 주정(95. 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 본 연구의 실험은 경기대. %) 추출물의 경우 500 μg/mL의 농도의 감초, 두충(Eucom-. 학교 동물윤리위원회의 승인(2019-008)을 거쳐 규정에 따. mia ulmoides), 천궁(Cnidium officinale) 시료에서 시료 무. 라 진행하였다.. 처리군(100%) 대비 각각 142.4%, 133.1%, 133.6%의 세포 증식능을 보여주었다(Table 1).. 자연살해세포 활성능 측정. 대식세포의 항미생물 기전 중 산화적 공격을 담당하는. Female BALB/c(6주령) mouse에 시료를 농도별로 10,. chemokine의 일종인 NO는 L-arginine으로부터 nitric. 100, 1,000 μg/mouse로 정맥주사하고 1일 후에 경추탈골. oxide synthase(NOS)를 경유하여 생성되며 라디칼 물질로. 법으로 치사시켜 무균 상태에서 비장을 적출하여 NK cell에. 세포 내에서 2차 신호전달자로서 중요한 역할을 한다. 또한. 대한 cytolytic activity를 확인하고자 하였다. 비장을 적출. 생체 내에서 고농도의 산화질소 생성은 혈관 확장과 더불어. 한 후 stainless steel mesh를 이용하여 PBS를 가한 다음. 생체 면역반응을 촉진하기도 한다. 이에 한약재 후보 시료의. 비장을 마쇄 및 여과하여 비장세포를 획득하고, NK cell. 면역증강 효과를 검증하기 위해 Griess reagent assay를. isolation kit을 이용하여 NK cell을 회수하였다. 이후 NK. 이용하여 세포 배양액 중의 NO 생성량을 측정하였다. 그 결. 6. 세포수가 5×10 cells/mL가 되도록 조정하여 이를 effec-. 과(Table 2), 감초, 오갈피(Acanthopanax sessiliflorum),. tor cell로 사용하였고, 종양세포주인 YAC-1을 target cell. 길경(Platycodon grandiflorum), 천궁 시료에서 농도 의존. 로 하여 round-bottomed 96-well microplate에 effector. 적으로 NO 생성능을 확인하였으며, 특히 오갈피 시료가 열. cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 2.5, 5, 10이 되도록. 수 추출과 주정 추출에서 우수한 산화질소 생성능을 보여주. 조정하여 분주하였다. 이후 37°C, 5% CO2 incubator에서. 었다. 따라서 대식세포주인 Raw 264.7 cell에 대한 세포. 6시간 배양하였다. Effect cell의 살해능에 의해 target cell. 독성과 NO 생성능 결과를 모두 종합해보면 세포독성을 나. 로부터 유리되는 lactate dehydrogenase(LDH)의 발생량. 타내지 않으면서 NO 생성능이 가장 우수했던 오갈피를 녹. 을 EZ-LDH(Dogen, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였. 용과 함께 최종 혼합 한약재로 선정하여 추후 실험을 진행하. 다. NK cell의 종양세포 살해 시 발생하는 LDH는 다음 식에. 였다..

(4) 22. 최지해 ․ 김나영 ․ 김선영 ․ 박혜령 ․ 유광원 ․ 이현순. Table 1. Cell viability on hot water extract and ethanol extract from medicinal herbs Cell viability (%) Traditional medicines Hot water extract (μg/mL) Ethanol extract (μg/mL) 0 100 500 0 100 500 NS d c 181.3±7.8a 100.0±6.9NS 142.4±5.8a 28.2±3.9 112.1±5.4 100.0±3.9 Glycyrrhiza uralensis 100.0±4.6 109.9±4.9ab 120.7±9.0bc 100.0±4.4 105.3±7.4cd 112.2±3.8b Angelica gigas N. b c d 100.0±3.1 102.3±4.0 112.2±7.2 100.0±6.6 100.5±4.2 88.1±3.7d Paeonia lactiflora ab b cd 100.0±3.9 104.2±3.3 123.9±9.8 100.0±3.7 103.8±6.2 133.1±6.6a Eucommia ulmoides ab c d 100.0±5.9 103.9±5.3 109.1±7.8 100.0±3.3 99.6±2.7 108.9±7.6bc Dioscorea batatas a c a 114.9±8.2 109.5±4.6 175.6±8.4 108.9±5.5bc 100.0±6.9 100.0±5.5 Acanthopanax sessiliflorum 100.0±3.2 60.3±0.0c 176.4±7.9a 100.0±10.3 104.5±5.9cd 103.4±4.2c Poria cocos ab b b 100.0±4.3 106.8±4.8 130.1±3.8 100.0±6.9 127.5±7.1 88.3±3.4d Platycodon grandiflorum b d cd 100.0±3.9 96.9±4.6 91.1±2.9 100.0±4.6 108.9±6.4 133.6±6.4a Cnidium officinale M. 100.0±2.9 108.3±4.6ab 61.3±3.8e 100.0±3.1 103.1±5.9cd 106.6±3.5bc Gastrodia elata B. The cells were treated for 24 h with various concentrations of each samples. Cell viabilities were measured by MTS assay using the CellTiter 96® AQueous Assay to measure MTS reduction. Values are mean±SD (n=5). Means with different letters (a-d) within the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. NS: not significant. Table 2. NO production on hot water extract and ethanol extract from medicinal herbs NO production (μM) Traditional medicines Hot water extract (μg/mL) Ethanol extract (μg/mL) 100 500 100 500 b b c 13.0±0.4 0.1±0.1 0.0±0.1c 0.3±0.0 Glycyrrhiza uralensis c f c 0.1±0.1 0.0±0.1 0.0±0.0 0.1±0.4c Angelica gigas N. c f bc 0.1±0.0 0.0±0.0 0.2±0.3 0.2±0.1c Paeonia lactiflora c e b 0.1±0.0 0.3±0.1 0.3±0.0 0.5±0.0b Eucommia ulmoides c f c 0.0±0.0 0.0±0.1 0.1±0.1 0.0±0.1c Dioscorea batatas a a a 12.1±0.4 20.5±0.5 3.8±1.1 20.6±0.8a Acanthopanax sessiliflorum c f c 0.1±0.0 0.1±0.1 0.1±0.1 0.1±0.1c Poria cocos 0.1±0.1c 3.4±0.3d 0.0±0.0c 0.4±0.5bc Platycodon grandiflorum c c c 0.1±0.1 10.5±0.3 0.1±0.0 0.2±0.1c Cnidium officinale M. c f c 0.1±0.1 0.1±0.1 0.0±0.1 0.0±0.1c Gastrodia elata B. The cells were treated for 24 h with various concentrations of each samples. Nitric oxide (NO) concentrations in cell culture media were measured by Griess reaction using NO colorimetric assay kit. A total of 1 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) was used as the PC (positive control) and media as NC (negative control). Values are mean±SD (n=5). Means with different letters (a-f) within the same column are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.. 녹용 및 오갈피 혼합 추출물 비율에 따른 세포 증식능 및 NO 생산능 녹용 및 오갈피 혼합 추출물이 Raw 264.7 세포독성에. 서 가장 높은 산화질소 생성을 나타내었다. 오갈피 500 μg/ mL의 농도로 처리 시보다 녹용과 오갈피 1:1 혼합물을 500 μg/mL 시 NO 생성능이 146.7% 증가하였다.. 영향을 주는지 알아보기 위해 최종 한약재로 선정된 오갈피 를 녹용 : 오갈피=1:1, 2:1, 1:2의 비율로 혼합하여 세포 증. 녹용 및 오갈피 혼합 추출물의 TNF-α및 IL-6 생산능. 식능을 측정하였다. 그 결과(Fig. 1A), 모든 녹용 및 오갈피. 대식세포는 외부에서 유입된 세균이나 이물질을 탐식하. 혼합 추출물에서 세포독성은 나타나지 않았으며, 특히 녹용. 고 제거하는 과정에서 여러 가지 cytokine을 분비하여 체내. : 오갈피=1:1, 2:1 혼합물에서 농도 의존적으로 우수한 세. 의 면역계를 조절한다고 알려져 있다(Forman과 Torres,. 포 증식능을 보여주었다. 한편 위와 동일 시료를 처리한 세. 2002; MacMicking 등, 1997). 활성화된 대식세포에 의해. 포 배양액 중의 생성된 NO를 측정한 결과(Fig. 1B), 녹용과. 유도되는 대표적인 단백질인 TNF-α는 림프구에 의해 생산. 오갈피 시료를 각각 처리하였을 때는 녹용 시료의 경우 NO. 되는 사이토카인으로, 생체 면역반응에서 단독 혹은 IL-1. 생성능을 확인할 수 없었지만, 오갈피 시료의 경우 농도 의. 등과 복합적으로 작용하여 종양의 혈관을 손상시켜 결과적. 존적으로 산화질소 생성이 증가하는 것을 확인함으로써 면. 으로 종양 괴사를 유발하거나 미생물에 의한 감염 저항성을. 역증진에 효과가 있을 것이라 기대하였다. 또한 녹용 : 오갈. 향상시킨다고 보고되어 있다(Lasek 등, 1997). 또한 IL-6. 피=1:1, 2:1, 1:2 혼합물에서 역시 면역증진 효과를 나타내. 는 감염과 조직 손상에 따른 면역 초기 반응에서 생산되는. 었으나, 녹용 : 오갈피=1:1 혼합물이 500 μg/mL의 농도에. 주요한 반응 매개물질이며, 단핵구나 대식세포에서 분비되.

(5) 녹용 및 오갈피 혼합 추출물의 면역증진 효과. B. 200 ** **. 160. ***. ***. ***. ***. *** ***. *** *** ***. ***. ***. *** ***. 120 80. 12 ***. 10. Nitric oxide (μM) .. Raw264.7 cell viability (%) .. A. 23. 40. ***. 8 6. *** ***. ***. *** ***. ***. 4 2. 0. ***. ***. *. *. 0 0 100 250 500 0 100 250 500 0 100 250 500 0 100 250 500 0 100 250 500. AS. CN. CN:AS=1:1 CN:AS=2:1. 0 100 250 500 0 100 250 500 0 100 250 500 0 100 250 500 0 100 250 500. CN:AS=1:. CN. CN:AS=2:1. CN:AS=1:1. AS. Concentration of samples (μg/mL). CN:AS=1:2. Concentration of samples (μg/mL). Fig. 1. Raw 264.7 cell viability (A) and NO production (B) on CN, AS, CN : AS=1:1, CN : ASE=2:1, and CN : AS=1:2. The CN was the extract of Cervus nippon. The AS was the extract of Acanthopanax sessiliflorum. Concentrations of mixtures were the various mixing ration of CE and AE. The cells were treated for 24 h with various concentrations of each samples. Cell viabilities were measured by MTS assay using the Cell Titer 96® AQueous Assay to measure MTS reduction. Nitric oxide (NO) concentrations * in cell culture media were measured by Griess reaction using NO colorimetric assay kit. Values are mean±SD (n=3). P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001. 고 면역반응, 신경세포의 기능, 조혈작용 등에서 중요한 기. 달에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 면역세포 간의 복잡한. 능을 하는 물질로 알려져 있다(Hamilton과 Adams, 1987).. cytokine network를 형성하여 생체방어에 작용하는 면역. 녹용 및 오갈피 혼합 추출물(녹용 : 오갈피=1:1, CME-PI). 기구를 활성화할 것으로 판단되었다. 또한 NO 생산에 관여. 시료에 대한 대식세포의 면역증진 효과를 확인하기 위하여. 하는 사이토카인인 IL-6와 종양 괴사 유발 및 미생물에 의한. 활성이 증가한 대식세포로부터 분비되는 면역 활성 사이토. 감염 저항성 향상에 관여하는 TNF-α를 유의적으로 생산함. 카인인 TNF-α와 IL-6의 생성량을 ELISA를 이용하여 실험. 으로써 생체방어에 작용하는 선천면역 메커니즘의 활성화. 하였다. 그 결과 TNF-α의 경우(Fig. 2A), 녹용 시료를 단독. 및 기능 조절에 관여할 수 있다는 것을 재차 확인하였다.. 처리한 군보다 오갈피 시료를 단독 처리한 군이 높은 TNFα 생산능을 보여주었으며, 녹용 및 오갈피 혼합 추출물에서. Real-time PCR에 의한 mRNA gene expression. 가장 높은 TNF-α 생산능을 보여주었다. 또한 IL-6 생산능. 활성화된 대식세포는 NO, ROS와 같은 chemokine 및 다. 에서도 TNF-α와 유사하게 녹용 및 오갈피 혼합 추출물에서. 양한 cytokine을 분비하게 된다. 세포 내 L-arginine으로부. 가장 우수한 IL-6 생산능을 보여주었다(Fig. 2B). 이 결과를. 터 NO 합성효소에 의해 생성되는 NO는 endothelial NOS. 토대로 녹용 및 오갈피 혼합 추출물은 선천면역계의 대표적. (eNOS), neutonal NOS(nNOS) 및 염증성 인자에 의해 생. 면역세포인 대식세포를 활성화하여 TNF-α와 IL-6의 생산. 산되는 inducible NOS(iNOS)로 나누어진다. 특히 iNOS에. 능을 높여줌으로써 타 면역세포의 기능을 조절하고 신호전. 의해 생산되는 NO는 외부에서 유입된 병원체로부터 인체를. A. 1000. a. B. 1200. IL-6 (pg/mL) .. TNF-α (pg/mL) .. a b. 800 b 600 c 400. 1600. d. 800. 400. 200. c 0. c. 0 CON. CN. AS. CME-PI. CON. CN. AS. CME-PI. Fig. 2. TNF-α (A) and IL-6 (B) production on CN, AS, and CME-PI by Raw 264.7 cell line. The CN was the extract of Cervus nippon. The AS was the extract of Acanthopanax sessiliflorum. CME-PI was the 1:1 mixture of CN and AS. The cells were treated for 24 h with each samples (500 μg/mL). Concentrations of TNF-α and IL-6 in cell culture media were measured using ELISA kit. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

(6) Relative expression TNF-α .. A. 8 a. a. 6. 4. 2. b. b. B. 25. Relative expression IL-6 .. 최지해 ․ 김나영 ․ 김선영 ․ 박혜령 ․ 유광원 ․ 이현순. 24. 20. 0 CN. AS. AS. CME-PI. 15. 10. 5. CME-PI. D. 5 a. 4. 3. b. 2 d. c. 1. 0. Relative expression COX2 .. Relative expression iNOS .. a. b. b. CON. CN. 0 CON. C. a. 10 a. 8 b 6. 4. 2. c. c. CON. CN. 0 CON. CN. AS. CME-PI. AS. CME-PI. Fig. 3. TNF-α (A), IL-6 (B), iNOS (C), and COX2 (D) mRNA gene expression on CN, AS, and CME-PI by Raw 264.7 cell line. The CN was the extract of Cervus nippon. The AS was the extract of Acanthopanax sessiliflorum. CME-PI was the 1:1 mixture 6 of CN and AS. Raw 264.7 cells (1×10 cells/well, 6-well plate) were treated with each samples (500 μg/mL) for 6 h. The results are presented as the relative gene expression (fold change relative to the control (untreated cells)). Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. 방어하는 데 중요한 역할을 하며, 순환계 질환, 염증 질환 및. (CME-PI) 시료를 농도별로 처리한 결과(Fig. 4), 1,000 μg/. 암과 밀접하게 연관되어 있다고 보고되고 있다(Kröncke 등,. mL의 농도에서 우수한 비장세포 증식능을 보여주었다.. 1998; Stuehr와 Griffith, 1999). 대식세포로부터 분비되는. 또한 비장세포를 배양한 배양 상등액에 분비된 IL-2,. 면역 활성에 관여하는 대표적인 cytokine인 TNF-α와 IL-6. TNF-α, IFN-γ와 같은 대표적 Th1 cytokine을 측정하고자. mRNA 발현량과 생체 면역반응을 촉진시키는 인자로 알려. 하였다(Brubaker 등, 1996). 이들 cytokines은 외부 자극. 진 iNOS와 COX-2 mRNA 발현량을 real-time PCR을 통해 확인하였다. 그 결과(Fig. 3), 녹용 시료를 단독으로 처리하 비 발현을 증가시키지 못했다. 그러나 녹용 및 오갈피 혼합 추출물(녹용 : 오갈피=1:1)을 처리하였을 경우 발현량이 4~ 20배까지 증가하는 것으로 보아 녹용과 오갈피를 혼합함으 로써 면역증진 효능은 배가 될 것이라 사료되었다.. 비장세포 증식능과 IL-2 및 IFN-γ생산능 비장은 생체 내 면역방어 기능을 담당하고 있는 이차면역 기관으로 외부로부터 유입된 항원에 대한 초기면역반응을 담당하고, 특히 세포성 면역반응과 체액성 면역반응에 관여 하는 주요 기관이다(Jung 등, 2010). 또한 T세포, B세포, 대 식세포 등의 여러 가지 림프구가 밀집되어 있는 비장의 크기 및 세포의 수는 면역반응에 밀접한 관련이 있으므로 면역증 진능을 관찰하기 위한 지표로 비장세포 증식능을 평가한다. Mouse에서 비장을 적출하여 녹용 및 오갈피 혼합 추출물. Splenocyte proliferation (%) .. 였을 때는 모든 gene expression에서 negative control 대. 200. a b. 150 c. c. c. 10. 100. 100. 50. 0 Control. LPS. 1000. Concentration of CME-PI(μg/mL). Fig. 4. Splenocyte proliferation activity of CME-PI. The CMEPI was the 1:1 mixture of Cervus nippon and Acanthopanax sessiliflorum. CON was used as negative control. Lipopolysaccharide (LPS) (5 μg/mL) were used as positive control. The data were expressed as triplicate±SD. Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

(7) 녹용 및 오갈피 혼합 추출물의 면역증진 효과. B. 150. IL-2 (pg/mL) .. 400 b. 90 60. c. d. 500 a. a. 120. c. IFN-γ (pg/mL) .. A. 25. a b. 300 200. 30. 100. 0. 0. c. d Control. LPS. 10. 100. 1000. Control. LPS. 10. Concentration of CME-PI (μg/mL). 100. 1000. Concentration of CME-PI (μg/mL). Fig. 5. IL-2 (A) and IFN-γ (B) production of CME-PI on splenocyte. The CME-PI was the 1:1 mixture of Cervus nippon and Acanthopanax sessiliflorum. IL-2 and IFN-γ production was measured by using mouse ELISA kit. A total of 1 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) was used as the PC (positive control) and media as CON (negative control). Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test. 40. 으로부터 숙주를 방어하기 위해 분비되는 초기 면역반응 물 면, 이들이 과량 분비되어 IL-10 등과 같은 사이토카인들과 균형을 이루지 못하게 되어 면역기능에 악영향을 미치게 된 다(Pisa 등, 1992; Sypek 등, 1994). 비장세포 배양 상등액 에서 IL-2 생산능을 측정한 결과(Fig. 5A), 녹용 및 오갈피 혼합 추출물(CME-PI) 1,000 μg/mL의 농도로 처리하였을. 2.5:1. NK cell activity (%) .. 질로서 숙주의 방어를 위해 중요한 매개체 역할을 하지 못하. 5:1. ⅰ. 10:1 A. 30. ⅱ ⅲ. 20 b B ⅳ. B. B. a. b. b. 10. 때 양성대조군 LPS 대비 약 80%의 IL-2 생산이 증가한다 는 것을 확인하였다. 반면 IFN-γ는 Th1에서 생성되는 cytokine으로서 IL-10의 생성을 억제하는 것으로 알려져 있 다(Seo 등, 2013). IFN-γ 생산능을 측정한 결과(Fig. 5B), 녹용 및 오갈피 혼합 추출물 1,000 μg/mL의 농도로 처리하 였을 때 양성대조군 LPS에 준하는 IFN-γ 생산능을 보여줌 으로써 녹용 및 오갈피 혼합 추출물은 비장에 존재하는 여러 면역세포를 활성화하여 면역증진 및 조절에 우수한 효과가. 0 CON. 10. 100. 1000. Concentration of CME-PI (μg/mouse). Fig. 6. Effect of CME-PI on cytolytic activity of NK cell in vivo. Effects of CME-PI on cytolytic activity of NK cells. The CON means negative control and media was used. Means with different letters (a-b, A-B, and i-iv) above the bars are significantly different between groups at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.. 있다는 가능성을 시사하였다. (Kägi 등, 1994; Smyth 등, 2005). 따라서 NK cell의 활성. 자연살해세포에 대한 활성능. 자극 효과는 단순한 항암 효과의 기대 이외에도 체내 면역력. NK cell은 암세포 제거능력이 탁월하다고 알려져 있으며,. 의 증가와 유사한 연장선상에 있다고 할 수 있다. 이를 바탕. 말초혈액 내 림프구의 5~10%를 차지하는 대과립 림프구로. 으로 녹용 및 오갈피 혼합 추출물(녹용 : 오갈피=1:1) 시료. 서 특이항원에 대한 사전 감지 없이 바이러스 감염세포나. 에 대한 NK cell cytolytic activity를 확인한 결과(Fig. 6),. 암세포를 파괴시키는 자연 면역기능을 갖는 세포로, 특히. 녹용 및 오갈피 혼합 추출물(녹용 : 오갈피=1:1)은 모든 비. 암 환자의 경우 NK cell의 수가 극히 감소하여 있는 것으로. 율(E/T ratio)에서 시료 무처리군 대비 농도 의존적으로 높. 알려져 있다(Farag 등, 2002; Funk 등, 2003). NK cell은. 은 종양세포에 대한 살해능을 나타내어 항암 활성 및 면역력. 다음 두 가지 작용기작에 의해 작동하는 것으로 알려져 있는. 에도 크게 공헌할 것이라 사료되었다.. 데 첫째, 자신의 class Ⅰ HLA(인간백혈구항원)가 세포표면 에 표현되는 세포, 즉 자가 세포는 죽이지 않고 바이러스에. 요. 약. 감염되거나 암세포와 같이 class Ⅰ HLA가 감소하여 있는 세포를 직접 공격하여 제거하거나 둘째, NK cell이 inter-. 녹용과 10종의 한약재(감초, 참당귀, 백작약, 두충, 산약, 오. leukin과 같은 cytokine을 분비하여 이들에 의해 Tc lym-. 갈피, 백복령, 길경, 천궁, 천마)를 각각 혼합하여 Raw. phocyte(cytotoxic T cell, 세포 살해성 T 림프구), macro-. 264.7 cell에 대한 세포 증식능과 NO 생산능을 측정한 결. phage(대식세포)와 같이 감염세포 및 암세포에 대한 직접적. 과, 녹용과 오갈피를 혼합하였을 때 가장 우수한 활성을 나. 인 공격능을 갖는 면역세포들을 활성화한다고 알려져 있다. 타내었다. 이후 녹용 및 오갈피 혼합 추출물의 비율을 녹용.

(8) 최지해 ․ 김나영 ․ 김선영 ․ 박혜령 ․ 유광원 ․ 이현순. 26. : 오갈피=1:1, 1:2, 2:1로 하여 Raw 264.7 cell에 대한 세포 증식능과 NO 생산능을 측정한 결과 녹용 및 오갈피 혼합 추출물 비율 1:1이 가장 우수한 활성능을 보여 이후 면역조 절 효과 입증을 위해 최종 시료로 사용되었다. 녹용 및 오갈 피 혼합 추출물(녹용 : 오갈피=1:1)의 Raw 264.7 cell에 대 한 TNF-α와 IL-6를 측정한 결과, 녹용 및 오갈피를 단독으 로 처리하였을 때보다 우수한 cytokine 분비능을 보여주었 다. Real-time PCR을 통해 TNF-α, IL-6, iNOS와 COX-2 mRNA gene expression을 확인한 결과, 녹용 및 오갈피를 단독으로 처리한 것보다 녹용 및 오갈피 혼합 추출물(녹용 : 오갈피=1:1)에서 우수한 mRNA 발현량을 나타내었다. 비 장세포에 대한 증식능을 측정한 결과 1,000 μg/mL의 고농 도에서만 우수한 증식능을 보여주었다. 추가로 IL-2 및 IFN-γ에 대한 생산능을 측정한 결과 IL-2의 경우 양성대조 군 LPS 대비 약 80%의 생산능을, IFN-γ의 경우 양성대조 군 LPS에 준하는 우수한 cytokine 분비능을 보여주었다. 또한 in vivo 상에서 자연살해세포에 대한 cytolytic activity를 측정한 결과 농도 의존적으로 높은 종양세포에 대한 살해능을 나타내었다. 위 결과를 모두 종합해보면 녹용 및 오갈피를 단독으로 처리한 것보다 녹용 및 오갈피 혼합 추출 물에서 면역조절 효과가 우수하다고 최종 확인되었다.. 감사의 글 본 연구는 농림축산식품부 지역전략식품산업육성사업의 (사)사슴클러스터사업단의 지원을 받아 수행하였습니다.. REFERENCES Abo T, Kawamura T, Watanabe H. Immunologic states of autoimmune diseases. Immunol Res. 2005. 33:23-34. Amano F, Noda T. 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