와송 첨가 청국장의 품질특성 및 추출물의 기능성 평가 전현일

와송 첨가 청국장의 품질특성 및 추출물의 기능성 평가

전현일¹․오현화¹․가동순¹․조승화²․임은정²․정도연²․김영수¹․송근섭¹

1전북대학교 식품공학과

2(재)발효미생물산업진흥원

Quality Characteristics and Functional Evaluation of Cheonggukjang Added with Orostachys japonicus

Hyun-Il Jun¹, HyeonHwa Oh¹, Dong-Sun Ga¹, Seung-Wha Jo², Eun-Jung Yim², Do-Youn Jeong², Young-Soo Kim¹, and Geun-Seoup Song¹

1Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University

2Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI)

ABSTRACT This study was carried out to investigate the effect of Orostachys japonicus on the quality and functional characteristics of Cheonggukjang. Cheonggukjang added with Orostachys japonicus (COJ) was freeze-dried to analyze the quality and functional characteristics of COJ. Moisture, crude protein, crude lipid, and crude ash contents in 0%

COJ were 4.46%, 40.75%, 26.84%, and 1.8%, respectively. As addition of COJ increased, contents of moisture and crude ash increased, whereas contents of crude protein and crude lipid decreased. Contents of total phenolics and total flavonoids in ethanol extract from 0% COJ were 29.39 μg/mg and 6.85 μg/mg, respectively, and these contents increased as addition of COJ increased. The antioxidant activity as determined by DPPH radical assay and ABTS radical assay also showed similar behavior. To assess the anti-inflammatory effect of ethanol extract from COJ on NO production in LPS-stimulated RAW 254.7, addition of COJ in the range of 0∼250 μg/mL increased, while NO production decreased. To assess the anti-obesity effect of ethanol extract from COJ on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes, Oil red O staining was carried out. Addition of 10% COJ at a concentration of 125 μg/mL reduced content of Oil red O staining such as 0.1 mM EGCG (positive control). These results suggest that COJ may be useful as a potential functional food for enhancing health.

Key words: Orostachys japonicus, Cheonggukjang, antioxidant activity, anti-inflammatory, anti-obesity

Received 29 January 2018; Accepted 30 April 2018

Corresponding author: Geun-Seoup Song, Department of Food Sci- ence and Technology, Chonbuk National University, Jeonju, Jeon- buk 54896, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-63-270-2568

서 론

현대사회에서 인간은 각종 스트레스, 운동 부족, 잘못된 식습관으로 인하여 노화, 암, 당뇨, 비만, 심장질환 등 각종 질환의 발병률이 증가하고 있으며, 이를 지연시키고자 약용 식물을 활용한 건강기능성 식품 개발에 관한 연구가 다양하 게 진행되고 있는 상황이다(1,2). 그 결과로 국내 건강기능식 품(2016년)의 시장규모는 총매출액과 총매출량이 각각 2조 1,260억 원과 4만 3,123톤으로 전년보다 16.6%와 24.7%

가 증가하였고, 기능성별로는 면역기능이 17.0%, 혈행 개선 이 16.8%, 항산화가 16.5%의 순서로 높게 나타나서 항노화 와 관련성이 높은 제품군이 50.3% 이상 판매된 것으로 나타 났다(3). 이와 같은 건강기능식품 시장규모의 증가는 체내의

면역시스템에 영향을 주는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 제거에 효과적인 식품소재나 이를 활용한 건강기능성 식품에 관심이 높은 국내 고령화 사회의 현실이 반영된 결과로 판단된다(4).

기와지붕이나 산지의 바위에서 자라는 와송(Orostachys japonicus)은 암송, 옥송, 작엽화초, 바위솥 등으로 불리는 다년생 돌나무과 식물로 분포지가 한국, 일본, 중국 등의 동 북아시아 지역이며 민간에서는 해열과 해독을 목적으로 사 용하는 약용 식물이다(5). 최근 들어 와송에 관한 연구가 진 행되면서 와송에는 kaempferol, quercetin, campesterol, hydroxybenzoic acid, gallic acid 등과 같은 생리활성 성분 을 다량 함유하고 있어 항산화, 항균, 항암, 항염증, 항비만 등에 다양한 생리활성이 있다고 알려져 건강기능성 식품에 적용하기 적합한 식품이다(6-9). 그러나 현재까지 와송에 관한 연구는 와송 그 자체의 생리활성이나 와송을 첨가한 화장품이나 한약재에 관한 연구(10,11)가 주로 이루어져 아 직 와송이 첨가된 분말 청국장에 관한 연구는 미비한 실정이 다. 최근에는 천연 식품소재의 생리활성을 증가시키기 위해

가열, 발효, 숙성 등의 다양한 가공방법이 사용되고 있으며, 이런 가공방법으로 제조한 식품 중의 하나가 대두를 활용한 청국장이다(12). 이에 본 연구는 와송 첨가 청국장의 건강기 능식품으로서의 가능성을 검토하고자 와송을 0%(대조구), 2.5%, 5%, 7.5% 및 10%를 각각 첨가하여 발효시킨 후에 동결 건조한 분말 상태의 청국장을 대상으로 이들 자체의 품질특성 및 에탄올 추출물의 기능성(항산화 활성, 항염증 및 항비만 활성)을 비교 분석하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 기기

본 연구에 사용한 분말 상태의 와송 첨가 청국장(Cheong- gukjang added with Orostachys japonicus, COJ)은 전북 순창지역의 장류 생산업체인 성도집전통고추장의 제품을 제 공받아 실험에 사용하였다. Butylated hydroxytoluene (BHT), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azi- no-bis(3-ethylenebenzothiozoline-6-sulfonic acid)(ABTS), gallic acid, catechin, Folin-Ciocalteu reagent 등은 Sig- ma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 그 밖에 시약들은 analytical grade를 구입하여 사용하였다.

항염증 활성 평가를 위한 세포주는 RAW 264.7(대식세 포), 항비만 활성 평가를 위한 세포주는 3T3-L1(지방전구 세포)을 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용 하였다. 세포활성 평가를 위한 Escherichia coli O111:B4 lipopolysaccharides(LPS), Griess reagent, insulin, dex- amethasone, rosiglitazone, epigallocatechin gallate, 3- isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), formalin, isopropanol 과 Oil red O 시약은 Sigma-Aldrich사에서 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), penicil- lin-streptomycin, fetal bovin serum(FBS), bovine calf serum과 phosphate buffer saline(PBS)은 Gibco/BRL사 (Burlington, ON, Canada) 제품을 사용하였다. 세포생존율 측정을 위한 Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하였다.

추출물 제조

추출물은 시료 50 g에 80% 에탄올 300 mL를 첨가하여 상온에서 교반(200 rpm, 1.5시간)한 후에 원심분리(10,000 rpm, 15분) 하여 상등액을 얻는 과정을 3회 반복하였다. 상 등액은 여과(Whatman No. 4, GE Healthcare Bio-Sci- ences AB, Uppsala, Sweden)하였다. 이렇게 얻어진 여액 은 동결 건조하여 -20°C에서 보관하면서 기능성 검증(항산 화 활성, 항염증 및 항비만 활성)을 위한 분석 시료로 사용하 였다. 와송 첨가량별 청국장(0~10% COJ) 추출물의 수율은 각각 12.4%, 12.8%, 12.7%, 11.7% 및 11.8%(w/w)였다.

일반성분 및 색도 분석

일반성분 함량은 AOAC(13) 방법을 이용하여 수분은 상 압가열건조법, 조회분은 직접회화법, 조지방은 Soxhlet법, 조단백은 Micro-Kjeldahl법으로 측정하였다.

색도는 색차계(SP-80, Tokyo Denshoku, Tokyo, Ja- pan)를 사용하여 L(명도), a(적색도), b(황색도) 값을 측정 하였다.

총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량 분석

총 페놀성 화합물 함량(total phenolic content)은 ISO 14502-1(14)의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 5 mL를 첨가하여 3분간 반응시킨 후에 7.5% Na₂CO₃ 4 mL를 첨가하였다. 이 반응액을 암소에서 반응(23°C, 1시간)시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였으며, gallic acid를 표준물질로 사용하여 산출한 함량을 시료 100 g당 g gallic acid로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량(total flavonoid content)은 Zhi- shen 등(15)의 방법을 이용하였다. 시료액 500 μL에 5%

NaNO₂ 75 μL를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 후 10%

AlCl₃ 150 μL를 첨가하였다. 이 반응액에 1 N NaOH 0.5 mL와 증류수 275 μL를 첨가한 후에 510 nm에서 흡광도를 측정하였으며, quercetin을 표준물질로 사용하여 산출한 함 량을 시료 100 g당 g quercetin으로 나타내었다.

항산화 활성 분석

DPPH radical assay는 Kano 등(16)의 방법을 일부 변형 하여 측정하였다. 시료 100 μL에 100 μM DPPH 용액 2 mL를 첨가하여 암소에서 20분간 반응시킨 후 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 비교구로는 ascorbic acid를 사용 하였다. DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식으로 산출하여 나 타내었다.

DPPH radical scavenging activity (%)＝

Absorbancecontrol－Absorbancesample

Absorbance_control ×100

ABTS radical assay는 Re 등(17)의 방법을 이용하여 측 정하였다. 시료 30 μL에 ABTS 라디칼 용액 3 mL를 첨가하 여 암소에서 6분간 반응시킨 후에 734 nm에서 흡광도를 측 정하였으며, 비교구로는 ascorbic acid를 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 아래의 식으로 산출하여 나타내었다.

ABTS radical cation scavenging activity (%)＝

Absorbance_control－Absorbance_sample Absorbancecontrol ×100

세포 배양 및 생존율 평가

RAW 264.7(대식세포)과 3T3-L1(지방전구세포)은 pen- icillin(100 U/mL), streptomycin(100 μg/mL) 그리고 FBS 를 10%로 첨가한 DMEM 배지를 이용해 37°C로 설정된 5%

CO₂ 배양기에서 2일마다 신선한 배지로 교체하면서 con- fluency가 80~90%에 이를 때까지 배양하였다.

세포현탁액을 회수하여 5×10⁴ cells/mL의 농도로 조절 한 후 96-well plate의 각 well에 100 μL씩 분주한 다음, 37°C로 설정된 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 농도 별 시료를 100 μL씩 분주하였고, control은 배지 100 μL를 첨가하였다. 5% CO₂ 배양기에서 37°C로 48시간 동안 배양 한 다음 배지를 제거하고 PBS 100 μL를 첨가한 후 CCK-8 solution 10 μL씩을 각 well에 첨가하여 37°C에서 2시간 동안 암소에서 반응시켰고, 0.1 N HCl을 10 μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 종료된 plate는 microplate reader(BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) 를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하여 control의 흡광도 에 대한 시료첨가구의 백분율을 세포생존율로 평가하였다.

Cell viability (%)＝ Absorbancesample

Absorbance_control ×100

항염증 활성 평가

항염증 활성은 Samarakoon 등의 방법(18)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7(대식세포) 세포주에 LPS를 1 μg/

mL 농도로 처리하여 생성되는 nitrite(NO)의 양을 측정하여 평가하였다. 세포현탁액을 2×10⁵ cells/mL 농도로 조제하 여 96-well plate의 각 well에 100 μL씩 분주한 다음, 37°C 로 설정된 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후 농도별 시료를 100 μL씩 분주하였고, control은 배지 100 μL를 첨 가하였다. 2시간 후 LPS를 최종농도 1 μg/mL로 첨가한 다 음 37°C로 설정된 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.

배양 후 상징액 100 μL와 Griess reagent 100 μL를 96- well plate에서 혼합하여 10분 동안 반응시키고 540 nm에 서 흡광도를 측정하였다. NO의 생성량을 비교하기 위해 NaNO₂(Alfa Aesar, Heysham, UK) 표준시약을 이용하였 고, 농도별 흡광도의 상관회귀식으로 시료의 첨가 농도별 활성 변화를 측정하였다.

항비만 활성 평가

항비만 활성은 Zebisch 등의 방법(19)을 이용하여 측정 하였다. 3T3-L1 세포현탁액을 2×10⁵ cells/mL 농도로 조 제하여 24-well plate의 각 well에 500 μL씩 분주한 다음, 37°C로 설정된 5% CO₂ 배양기에서 배양하면서 2~3일마다 신선한 배지로 보충해주면서 80% 이상의 confluency가 될 때까지 기다렸다. 기존 배지를 제거하고 신선한 DMEM 배 지를 첨가하거나 분화 배지(differential media, DM; 0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin, 2 μM rosiglitazone, 10% FBS, 100 unit/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin이 함유된 DMEM 배지)를 첨가하 여 2일간 배양한 다음 기존 배지 제거 후 10 μg/mL insulin 만 첨가된 DMEM 배지로 보충해주고, 2일 간격으로 기존 배지를 제거하고 보충해준 다음 추출물을 농도별로 처리하

여 배양하였다.

8일 경과 후 기존 배지를 제거한 다음 PBS(pH 7.4)를 이용해 세척하고 4% paraformaldehyde 용액으로 30분 고 정한 후 60% isopropanol로 세척하였다. 완전히 건조한 후 60% Oil red O 염색액을 처리하여 20분간 상온에서 염색하 고, 염색약을 제거한 후 증류수로 여러 번 세척하였다. 현미 경(TCM400, Labo America, Inc., Fremont, OH, USA)으 로 관찰한 후 카메라(EyeCam, Bimeince Co., Suwon, Ko- rea)로 기록하였다. 각 well에 100% isopropanol 1 mL를 첨가하여 실온에서 30분간 rocking 한 후 상징액 200 μL를 96-well plate에 옮겨 500 nm에서 흡광도를 측정하였고, control(DM)의 흡광도에 대한 각 시료첨가구의 흡광도 백 분율을 지방축적률로 환산하여 항비만 활성을 평가하였다.

Lipid accumulation (%)＝ Absorbance_sample Absorbance_control ×100

통계처리

각 실험에서 얻은 결과는 SPSS package program(Ver.

12.0K, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료 간의 유의성은 P<0.05 수 준에서 one-way ANOVA로 분산분석한 후에 Duncan’s multiple range test로, 각 군 간의 유의성은 P<0.05 수준에 서 Student’s t-test로 비교하였다.

결과 및 고찰

와송 첨가 청국장의 일반성분 및 색도

와송 첨가 청국장(COJ)의 일반성분 및 색도의 결과는 Table 1과 같다. 와송 무첨가구인 0% COJ의 일반성분 함량 (수분, 조단백, 조지방 및 조회분)은 각각 4.46%, 40.75%, 26.84% 및 4.84%였으며, 이는 동결 건조한 청국장 분말의 일반성분 함량은 각각 4.5%, 39.5%, 20.2% 및 4.6%로 조단 백질과 조지방의 함량이 높게 나타난다는 결과와 유사하였 다(20). 한편 와송 첨가량이 증가할수록 수분과 조회분은 10% COJ가 0% COJ보다 각각 1.3배와 1.3배 증가하였다.

반면에 조단백질과 조지방은 10% COJ가 0% COJ보다 각각 1.2배와 1.1배 감소하였는데, 이는 와송에 함유된 일반성분 의 조성 차이가 영향을 준 것으로 판단된다.

COJ의 색도는 L 값이 46.83~53.11, a 값이 5.79~6.94 및 b 값이 15.49~18.63의 범위로 나타났으며 와송 첨가량 이 0%에서 10%로 증가할수록 각각 1.1배, 1.2배 및 1.3배 감소하였다. 이는 설기떡에 와송즙을 첨가할수록 설기떡의 L 값이 92.38에서 70.27로 감소하였다는 결과와 유사하였 다(21).

와송 첨가 청국장 에탄올 추출물의 항산화 성분 및 항산화 활성

COJ 에탄올 추출물의 항산화 성분 및 항산화 활성의 결과

Table 1. Proximate composition of Cheonggukjang added with Orostachys japonicus

Component 0% COJ¹⁾ 2.5% COJ 5% COJ 7.5% COJ 10% COJ Proximate

composition (%)

Moisture Crude protein Crude lipid Crude ash

4.46±0.02^a2)3) 40.75±0.26^e 26.84±0.05^d 4.84±0.04^a

4.83±0.11^b 40.30±0.06^d 25.84±0.01^c 5.27±0.03^b

5.13±0.02^c 38.98±0.05^c 25.71±0.10^c 5.58±0.02^c

5.83±0.17^d 38.17±0.09^b 24.92±0.14^b 6.03±0.04^d

5.99±0.02^d 36.92±0.32^a 24.50±0.19^a 6.36±0.02^e Hunter’s value

L a b

53.11±0.03^e 6.94±0.02^e 18.63±0.02^e

51.11±0.02^d 6.36±0.06^d 17.65±0.09^d

50.03±0.04^c 5.96±0.01^b 16.82±0.03^c

47.82±0.05^b 6.02±0.02^c 16.09±0.01^b

46.83±0.02^a 5.79±0.00^a 15.49±0.01^a

1)COJ is an abbreviation for Cheonggukjang added with Orostachys japonicus.

2)Values are mean±SD (n=3).

3)Different letters (a-e) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Table 2. Total phenolic content, total flavonoid content, and antioxidant activity of ethanol extract from Cheonggukjang added with Orostachys japonicus

Component Concentration

(mg/mL) 0% COJ¹⁾ 2.5% COJ 5% COJ 7.5% COJ 10% COJ Antioxidant

compound (μg/mg)

TPC²⁾ － 29.39±0.73^a4)5) 30.83±0.40^b 32.30±0.39^c 34.74±0.25^d 40.25±0.68^e TFC³⁾ － 6.85±0.14^a 14.32±0.21^b 15.53±0.05^c 16.68±0.02^d 17.73±0.06^e

Antioxidant activity (%)

DPPH radical assay

2.5 5.0 7.5 10

0.38±0.24^a 3.75±0.60^a 7.70±0.74^a 12.01±0.54^a

3.00±0.06^b 11.37±0.48^b 18.65±0.77^b 26.76±0.21^b

4.13±0.41^c 13.95±0.31^c 22.45±0.12^c 28.71±0.21^c

4.47±0.41^c 14.67±0.12^c 22.83±0.57^c 30.56±0.93^d

5.08±0.16^d 15.50±0.53^d 25.70±0.39^d 34.12±0.21^e APTS　radical

assay

2.5 5.0 7.5 10

8.19±1.00^a 18.10±0.72^a 22.32±0.88^a 32.71±1.04^a

11.41±0.62^b 22.21±0.58^b 35.54±1.42^b 39.90±0.51^b

12.04±0.79^b 24.27±0.36^c 35.83±1.70^bc 43.55±1.37^c

12.03±0.29^b 25.60±0.59^d 37.73±0.08^cd 44.20±0.14^cd

13.82±0.80^c 27.39±0.50^e 38.60±0.17^d 45.41±0.42^d

1)COJ is an abbreviation for Cheonggukjang added with Orostachys japonicus.

2)TPC and TFC are total phenolic content and total flavonoid content, respectively.

3)Comparison (ascorbic acid at 0.1 mg/mL, 0.8 mg/mL, and 0.1 mg/mL for DPPH radical assay and ABTS radical assay) is 95.6%, 91.7%, and 0.75, respectively.

4)Values are mean±SD (n=3).

5)Different letters (a-e) in the same row indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05).

는 Table 2와 같다. 0% COJ의 total phenolic content (TPC)와 total flavonoid content(TFC)는 각각 29.39 μg/

mg과 6.85 μg/mg이었으며, 이는 청국장 에탄올 추출물의 TPC가 22.2 μg/mg이었으며 상업용 청국장 분말에 함유된 TPC가 TFC보다 높았다는 결과와 유사하였다(22,23). 한 편 와송 첨가량이 증가할수록 TPC와 TFC는 증가하여 10%

COJ가 0% COJ보다 각각 1.4배와 2.6배 증가하였다. 이는 와송 에탄올 추출물의 TPC와 TFC가 각각 24.14 μg/mg과 16.02 μg/mg이라는 기존의 보고에 비추어보면 청국장의 원 료인 대두보다 TPC와 TFC의 함유량이 많은 와송의 첨가가 증가할수록 COJ의 TPC와 TFC가 증가한 것으로 판단된다 (24).

COJ 에탄올 추출물을 2.5~10 mg/mL의 농도 범위에서 측정한 항산화 활성(DPPH radical assay와 ABTS radical assay)은 0% COJ가 각각 0.38~12.01%와 8.19~32.71%

로 추출물의 농도가 증가할수록 활성도 함께 증가하는 농도 의존적 경향을 보였다. 또한, 와송 첨가량별 항산화 활성 (DPPH radical assay와 ABTS radical assay)을 5 mg/mL 의 농도에서 살펴본 결과, 10% COJ가 0% COJ보다 각각

4.1배와 1.5배 증가하였다. 이는 발효공정을 통한 와송의 TPC와 TFC의 증가로 인하여 이들의 항산화 활성도 증가하 였다는 결과와 유사하였는데, 이는 TPC와 TFC의 phenolic hydroxyl group이 가진 강한 환원성이 라디칼 소거능을 갖 고 있기 때문이다(25).

한편 COJ 에탄올 추출물이 비교구로 사용된 ascorbic acid보다 높은 농도에서도 낮은 항산화 활성을 보였을지라 도 COJ 발효에 관여한 미생물에 의해서 대두와 와송에 함유 된 TPC와 TFC가 거대분자인 단백질과 결합한 상태에서 유리되어 저분자화 되었기에 체내 흡수율과 이용률의 증가 가 예상되므로 대두와 와송을 활용한 COJ는 건강기능식품 또는 이들의 소재로 적합할 것으로 판단된다(26).

와송 첨가 청국장 에탄올 추출물의 RAW 264.7 및 3T3-L1 세포독성

COJ 에탄올 추출물의 첨가량 및 농도별 RAW 264.7과 3T3-L1 세포생존율 평가를 통한 세포독성 결과는 Fig. 1과 같다. RAW 264.7 세포의 생존율은 LPS 미처리구의 생존율 을 100%로 기준으로 하였을 때 LPS 1 μg/mL 처리구에서

A

B

Fig. 1. Effect of ethanol extract from Cheonggukjang added with Orostachys japonicus on the viability of RAW 264.7 cells (A) and 3T3-L1 cells (B). Error bar indicates the standard deviation of the mean. □, 0% COJ; ■, 2.5% COJ; ■, 5% COJ; ▤, 7.5%

COJ; ▨, 10% COJ. COJ is an abbreviation for Cheonggukjang added with Orostachys japonicus.

Fig. 2. Effect of ethanol extract from Cheonggukjang added with Orostachys japonicus on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Error bar indicates the standard deviation of the mean. □, 0% COJ; ■, 2.5% COJ; ■, 5% COJ; ▤, 7.5%

COJ; ▨, 10% COJ. COJ is an abbreviation for Cheonggukjang added with Orostachys japonicus. An asterisk indicates a sig- nificant difference compared with 10% COJ at 0 and 250 μg/mL according to Student’s t-test (P<0.05). COJ is an abbreviation for Cheonggukjang added with Orostachys japonicus.

미처리구보다 17.25%가 감소한 82.75%로 나타났다. LPS 가 처리된 배지에 0~10% COJ 에탄올 추출물을 0~1,000 μg/mL의 농도 범위로 첨가하여 세포생존율을 살펴본 결과, 생존율이 80% 이상을 유지하는 0~10% COJ 에탄올 추출물 의 농도는 250 μg/mL 이하로 나타났다(Fig. 1A). 한편 3T3- L1 세포생존율은 0~10% COJ 에탄올 추출물을 62.5 μg/

mL의 농도로 첨가하였을 때 88.32~94.58%로 대조구(con- trol, 0 μg/mL의 농도에서 100%)보다 감소하였으며 생존율 이 80% 이상을 유지하는 0~10% COJ 에탄올 추출물의 농 도는 125 μg/mL로 나타났다(Fig. 1B).

따라서 추후 연구에서는 RAW 264.7 세포와 3T3-L1 세 포의 생존율이 80% 이상 유지되는 0~10% COJ 에탄올 추 출물의 농도에서 항염증 및 항비만 활성을 측정하여 비교하 고자 한다.

와송 첨가 청국장 에탄올 추출물의 항염증 및 항비만 활성 COJ 에탄올 추출물의 항염증 활성 결과는 Fig. 2와 같다.

RAW 264.7 세포의 생존율이 80% 이상 유지되는 0~10%

COJ 에탄올 추출물의 농도 범위(0~250 μg/mL)에서 LPS(1 μg/mL) 처리로 생성된 NO(염증 유발 지표) 생성량을 비교 한 결과, 24시간 배양 후 LPS 처리구의 NO 생성량은 5.08

μM이었다. 그러나 0~10% COJ 에탄올 추출물의 첨가 농도 가 증가함에 따라 LPS 처리구의 NO 생성량은 감소하는 경 향이었으며 10% COJ를 250 μg/mL 농도로 처리하였을 때 NO 생성량은 4.28 μM로 LPS 처리구보다 1.2배 감소하여 염증 유발 지연에 가장 효과적이었다(Fig. 2). 이는 와송 추 출물의 농도가 증가할수록 RAW 264.7 세포의 NO 생성량이 농도 의존적으로 감소하였다는 결과와 유사하였다(8,27).

COJ 에탄올 추출물의 항비만 활성 결과는 Fig. 3과 같다.

3T3-L1 세포의 생존율이 80% 이상 유지되는 0~10% COJ 에탄올 추출물의 최대 첨가 농도인 125 μg/mL 농도에서 DMEM 배지(대조구)와 분화 유도제를 처리한 DM 배지에 0~10% COJ 에탄올 추출물을 첨가하여 Oil red O 염색 비 교법으로 지방 축적량을 비교한 결과(Fig. 3A), 분화 유도제 를 넣지 않은 DMEM 배지에서는 지방분화가 관찰되지 않았 으나 분화 유도제를 넣은 DM 배지는 지방분화가 정상적으 로 확인되었다. 한편 DM 배지에 0~10% COJ 에탄올 추출 물이 첨가된 DM 배지가 DM 배지보다 지방분화가 적게 관 찰되었고 10% COJ에서만 지방 축적량이 43.83%로 나타나 서 양성 대조구인 EGCG(0.1 mM) 첨가구 42.45%와 유사한 활성을 보였다(Fig. 3B). 이는 와송 추출물의 첨가 농도가 증가할수록 지방이 분화된 3T3-L1 세포의 Oil red O의 붉 은 정도가 감소하였고 이들의 지방 축적량도 함께 감소하였 다는 결과와 유사하였다(28,29).

요 약

본 연구에서는 다양한 생리활성을 가졌다고 알려진 와송의 활용도를 높이고자 와송을 첨가한 청국장을 제조하였으며, 이들 자체의 품질특성 및 에탄올 추출물의 기능성을 확인하

A

B

Fig. 3. Effect of ethanol extract from Cheonggukjang added with Orostachys japonicus on lipid accumulation in 3T3-L1 adipo- cytes. Error bar indicates the standard deviation of the mean. The effect of treatment with different addition amount of COJ as measured with Oil red O staining. Different letters (a-c) above the bar indicate a significant difference according to Duncan’s multiple range test (P<0.05). COJ is an abbreviation for Cheong- gukjang added with Orostachys japonicus.

고자 하였다. 와송 첨가 청국장(Cheonggukjang added with Orostachys japonicus, COJ)의 일반성분 함량은 와송 첨가 량이 0~10%로 증가할수록 수분과 조회분은 증가하였으나 조단백질, 조지방 및 색도의 L, a 및 b 값이 감소하였다. 0%

COJ 에탄올 추출물의 total phenolic content(TPC)와 total flavonoid content(TFC)는 각각 29.39 μg/mg과 6.85 μg/

mg이었으며, 와송 첨가량이 증가할수록 TPC와 TFC는 증가 하였고 항산화 활성에서도 유사한 경향이었다. RAW 264.7 세포의 NO 생성량은 0~10% COJ 에탄올 추출물의 첨가량 이 증가할수록 감소하였으며, 10% COJ 추출물을 250 μg/

mL 농도로 첨가하였을 때 NO 생성량은 LPS만 처리한 군보 다 1.2배 감소하였다. 10% COJ 에탄올 추출물을 125 μg/

mL 농도로 첨가한 처리구의 지방 축적량은 43.83%로 양성 대조구인 EGCG(0.1 mM) 첨가구와 유사한 활성을 나타내 었다. 결과적으로 COJ는 항산화, 항염증 및 항비만 활성 등 의 다양한 기능성을 나타내었기에 와송은 청국장의 건강기 능성 증진에 적합한 천연소재로 판단된다.

감사의 글

본 논문은 농림수산식품부 지역 전략 식품산업 육성사업(과 제명: 동부권 고기능 토종발효미생물과 향토자원을 이용한 발효제품 개발 및 기능성, 분석, 과제번호: MIFI 2017-1)의 연구비 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.

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