서 론
IT 기술과 BT 기술의 접점에서 가장 활발하게 연 구되고 있는 분야가 바이오칩 분야이다. 바이오칩은 크게 마이크로어레이(microarray) 칩과 마이크로플 루이딕스 칩 (microfluidic chip)으로 분류할 수 있다.
마이크로어레이 칩 기술은 DNA, 펩타이드, 단백질, 세포 등을 미세간격으로 배열시키고, 분석 대상 물질 과의 상호작용을 주로 분석하는 기술이다. 마이크로 플루이딕스 칩 기술은 미세유체 제어 기술을 이용하 여 유체샘플에 포함되어 있는 분석 대상 물질을 칩 위 에 있는 생체물질, 세포, 조직 또는 검출 장치와의 상 호작용을 측정·분석하는 기술이다.
최초로 개발된 마이크로플루이딕스 시스템을 이용 한 분석 시스템은 실리콘 웨이퍼에 구현된 크로마토 그래피였다. 1990년대에 와서 소형화된 total analysis system(µTAS)이 개발된 이후로 마이크로플루이딕 스 시스템을 이용한 분석시스템에 대한 본격적인 연 구가 진행되고 있다. 생화학 분석 시스템에 마이크로 플루이딕스를 이용하면 다음과 같은 장점이 있다. 분 석 시스템을 소형화시키기 때문에 샘플 및 고가의 생 화학 시약을 적게 사용할 수 있고, 분석 실험을 병렬 로 동시에 진행할 수 있으므로 분석 시간과 경비를 줄 일 수 있다. 미세유체는 난류(turbulence)가 없는 균
일한 층류(laminar) 특성의 흐름을 얻을 수 있고, 유 체 흐름 특성도 조절하기 쉬우므로 재현성 있는 생화 학 분석 자료를 얻을 수 있다.
세포를 이용한 분석 시스템은 살아있는 세포를 직 접 활용하기 때문에 DNA칩, 단백질 칩 등에 비해 대 사활성의 변화, 약물 활성 분석 등 한 단계 높은 생체 반응 결과를 얻을 수 있다. 세포 기반의 분석시스템은 주로 약물 선별, 약리동력학, 독성분석 등에 널리 활용 되어 왔다. 그러나 지금까지의 정지상 세포 에세이 (static cell-based assay)는 주로 한 가지 종류의 세 포 또는 조직을 사용하기 때문에 세포 및 조직 사이의 대사물질 교환 등에 의해 나타나는 여러 가지 생리작 용에 대한 평가가 불가능하였다. 즉, 약물 또는 독성물 질에 대한 세포 및 조직 사이의 간섭에 대한 동적인 반응(dynamic response)을 얻기 어려웠다. 이러한 문 제점은 동물실험을 통해 보완할 수 있으나, 비용이 높 으며 실험동물 관련 윤리적인 문제가 제기된다는 또 다른 문제점이 있다.
세포를 이용한 분석은 많은 장점이 있음에도 불구하 고, 기존의 정지상 세포 에세이 방법은 생체 시스템의 약물 작용과 동적인 반응 등과 관련하여 약물 동태학 모델 (physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) model)과 연계한 in vitro ADMET (absorption,
이 은 열
경희대학교 화학공학과 나노바이오연구실, [email protected]
distribution, metabolism, excretion, toxicity) 에세이 등에 활용하기에는 제한이 있다. 이러한 문제점을 극 복하기 위하여 최근에는 마이크로플루이딕스 기반의 세포 에세이 시스템 개발이 활발하게 진행되고 있다.
이 시스템은 미세유체의 장점을 활용하고, 적은 양의 샘플을 사용하며, 분석시간을 줄일 수 있다는 마이크 로플루이딕스의 장점과 생체 반응과 가장 유사한 결 과를 얻을 수 있는 세포 에세이를 결합함으로써 다양 한 분야에 응용할 수 있다. 본고에서는 세포 에세이와 마이크로플루이딕스의 기본원리를 정리해보고, 두 방 법의 장점을 결합한 마이크로플루이딕스 세포 칩의 원리와 organ/animal-on-a chip 관련 최신 연구개발 동향을 소개하고자 한다.
세포 기반의 생리활성 에세이
생명공학 관련 응용 연구에서 배양된 세포를 이용 한 활성 검색, 부작용 평가, 약리작용 분석 등은 생리 활성 물질 개발 연구에서 필수적이다. 최근에는 배양 된 세포뿐만 아니라 조직을 이용하여 생리활성을 분 석하기도 한다. 특히 제약회사에서는 의약품 연구 개 발 초기단계에서부터 세포 기반의 에세이를 널리 사 용한다. 많은 수의 후보물질을 검색하기 위하여 효소 나 항체 등을 이용한 생화학 에세이를 수행하기도 하 나, 의약품의 복잡한 작용기작을 단순한 생화학 반응 만으로는 평가하기 어렵기 때문에 세포 기반의 에세 이를 사용하는 것이다. 살아있는 세포를 이용하기 때 문에 세포 형태 변화 및 대사 작용 분석을 통해 약물 에 대한 동적인 반응을 평가할 수도 있다. 세포 에세 이 관련 시장 규모도 커지고 있는데, Frost and Sullivan 사의 시장조사 자료에 의하면, 유럽지역에서 세포 에세이 관련 시장규모는 2004년 기준 약 1억4천 만 불 규모이며, 그 중에서 형광 기반의 세포 에세이 (fluorescence-based cellular assay)분야가 약 7천5백 만 불 규모가 되는 것으로 평가되고 있다.
한편, 미국 Tufts 대학의 의약품 개발 연구센터에 의하면, 2004년 기준 미국에서 한 개의 의약품이 임상
실험을 거쳐 시판되기까지 드는 평균 비용이 약 4억7 천만 달러가 넘는다고 보고하였다. 비용이 증가하는 주요 원인 중 하나는 전 임상 단계에서는 예상하지 못 했던 독성이 임상과정에서 발견되어 임상과정 이후에 서 반 이상 실패했기 때문이다. 비용이 매우 많이 드 는 임상 후반부에서 후보물질이 탈락하는 경우, 그 때 까지의 막대한 비용이 성공한 신약 개발 비용으로 포 함된다. 따라서 전 임상 및 임상 초반에서 독성 검사 및 약효 검증에 활용되는 기존의 세포 에세이의 신뢰 성을 높일 수 있으며, 저비용·고효율로 평가할 수 있 는 개선된 세포 에세이 방법이 요구되고 있다. 세포 에세이의 효율성을 높이기 위해서는 에세이 과정에서 시약 준비 및 분석과정이 짧아야하고 검색시스템의 소형화와 자동화가 필요하며, 신뢰성을 높이기 위해 서는 분석 시그널이 정확하면서 안정되게 나와야 하 고 병렬로 다수의 검색 작업을 동시에 수행함으로써 결과의 재현성을 확보해야 한다. 이러한 개선된 목표 는 세포 에세이에 마이크로플루이딕스를 접목시킴으 로써 해결할 수 있다.
마이크로플루이딕스 원리
마이크로플루이딕스는 마이크로수준에서 유체의 흐름을 조절하는 방법, 장치 및 시스템 제작 기술이라 고 정의할 수 있다. 마이크로플루이딕스 시스템은 미 세유체의 특성을 이용하여 다양한 생명현상에 대한 연구에 응용할 수 있다. 미세유체는 일상의 유체와는 다른 여러 가지 특징을 가질 수 있다. 미세유체는 레 이놀즈수 (Reynolds number; Re = ρvd/µ, ρ는 유 체 밀도(g/cm3), v는 유체속도(cm/s), d는 채널의 직경(cm), µ는 점도(g/cm·s))가 2000 이하로 층류 흐름 특성을 가진다. 이 조건에서는 유체의 흐름이 주 로 점성에 의해 좌우된다. 마이크로플루이딕스에서는 두 종류의 유체가 접하면서 흐르는 경우, 두 유체는 접촉면에서 확산에 의해서만 혼합하게 되므로 안정된 농도 구배(gradient)를 얻을 수도 있다. 마이크로플루 이딕스 기반의 세포 에세이 시스템에서는 마이크로
chamber에 여러 종류의 세포 또는 조직을 심을 수 있 고, 마이크로채널을 이용하여 chamber에 연속적으로 영양분을 공급할 수 있고, 세포 대사과정에서 생성되 는 부산물을 제거할 수도 있다. 소형화된 디바이스를 사용하므로 세포 시료 및 세포 배양 등에 사용하는 생 화학약품의 양을 줄일 수 있다는 장점도 유지할 수 있 다. 바이오에세이로의 응용에서 기대되는 가장 큰 장 점은 마이크로플루이딕스 칩의 집적도를 높여 같은 분석을 병렬로 동시에 진행함으로써 생물학 실험에서 당면하는 어려운 문제점 중에 하나인 재현성을 확보 할 수 있다는 점이다. 또한 서로 관련성 있는 분석을 병렬로 동시에 진행할 수 있으므로 분석 효율을 높일 수 있다는 장점도 있다.
마이크로플루이딕스 칩은 반도체 공정에서 사용 되던 포토리소그라피(photolithography) 등의 microfabrication 기술을 이용하여 제작할 수 있다. 정 제된 Si 기판 위에 감광제(photoresist, PR)를 도포하 고, 패터닝된 마스크를 통해 UV를 쪼여주어 패턴을 형성시킨다. PR을 현상하여 생성된 감광제상의 패턴 은 식각법으로 깎여지고, PR을 제거하여 칩을 제조한 다. 포토리소그라피법은 매우 정교한 패턴을 얻을 수 있고, Si 기판이 물리화학적으로 안정하고, 여러 가지 용매를 사용할 수 있고, 광학 특성이 우수하다는 장점 이 있다. 반면에 클린룸 등의 고가의 장비가 필요하고 비용이 비싼 편이다.
기존의 포토리소그라피 이외에 마이크로플루이딕 스 패턴 형성을 위한 다양한 방법들이 사용되고 있다.
마이크로플루이딕스의 생물공학 분야 응용에 널리 활 용될 수 있는 방법으로 soft lithography법이 있다 [Xia & Whitesides, Angew Chem Int Ed, 1998].
예를 들어, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)으로 제 조한 마이크로플루이딕스 칩은 고분자이므로 유연성 이 좋으며, 분석 실험에 사용되는 세포 및 생체물질에 대해 생체적합성이 우수하며, 가시광선이나 UV에 대 한 투과성이 좋아 생화학 반응 결과 등을 관측하기가 용이하다[그림 1]. 표면을 화학적으로 손쉽게 개질할
수 있으므로 필요한 화학 관능기를 도입할 수도 있다.
또한, 소프트리소그라피는 기존 방법에 비해 경제적 이고, 짧은 시간에 마이크로플루이딕스 칩을 제조할 수 있다는 장점이 있어 마이크로플루이딕스 기반의 세포 칩 제작에 가장 많이 활용될 수 있는 기술이라고 할 수 있다.
미세유체 기반의 세포 칩
기존의 정지상 세포 에세이의 단점을 극복하기 위 하여 마이크로플루이딕스 기반의 세포 칩을 활용할 수 있다. 약물의 생리활성 분석이나 독성 평가에 활용 할 수 있는 마이크로플루이딕스 기반의 세포 칩은 일 반적으로 세포가 있는 마이크로 chamber와 각 chamber들을 연결하는 마이크로 채널로 구성된다.
Chamber에 있는 세포들은 마이크로 채널을 순환하
그림 1. 마이크로플루이딕스 패터닝, 마이크로스템핑 및
stencil 패터닝을 위한 일반적인 softlithography 방법
모식도[Li et al., Crit Rev Biomed Eng, 2003].
는 배지나 시약, 독극물 등에 연속적으로 노출되고, 이 때 나오는 세포 반응을 생화학적 분석 방법이나 표지 물질에 대한 형광 현미경 등을 사용하여 관찰한다. 투 명성 플라스틱으로 칩을 제작하는 경우, 비표지식 광 학적 센싱도 가능하다 [Kim et al., Lab Chip, 2007;
Yang et al., Curr Drug Discov Technol, 2007]. 마이 크로플루이딕스 기반의 세포 칩의 가장 큰 장점은 고 효율로 세포 에세이를 할 수 있다는 점이다. 세포배양 관련 고가의 시약들을 적은 양 사용하므로 경제성도 우수하며, 여러 개의 칩을 병렬로 제작하여 동시에 사 용할 수 있으므로 반복 실험을 통해 결과의 정확성을 높일 수 있다 [Khetani & Bhatia, Curr Opin Biotechnol, 2006]. 최근에는 전극을 사용하여 나노리 터 수준으로 유체를 작동시킬 수 있으며 효소 및 세포 에세이가 가능한 디지털 마이크로플루이딕스 칩 (digital microfluidics, DMF)이 개발되었다. 여러 개 의 전극이 array되어 있는 평판형 칩에서 Jurkat T- cell을 이용하여 cytotoxicity를 분석한 결과, 기존의 well plate형 세포 에세이 대비 20배 이상의 민감도를 얻을 수 있었다 [Barbulovic-Nad et al., Lab Chip,
2008]. 마이크로플루이딕스 기반 세포 칩을 이용한 독 성 및 활성 평가는 연구단계를 넘어 향후에는 스크리 닝 단계에서 다음 전 임상 및 임상 단계로 넘어갈 선 도화합물 결정에 활용될 수 있을 것이다.
Microfluidic tissue/organ/animal/
human-on-a-chip
마이크로플루이딕스 세포 칩에서는 기존의 세포 에 세이에서는 분석할 수 없는 조직, 기관(organ), 개체 수준에서의 생리반응을 모사할 수 있다. 마이크로플 루이딕스 칩에서는 배지 또는 약물의 머무름 시간 (residence time)과 같은 생리 인자(physiological parameter) 등을 조절할 수 있으므로 다양한 대사환 경에서의 약리학 및 독성학을 평가할 수 있다. 이러한 마이크로플루이딕스 칩의 생체 모방 기능성을 높이기 위해, 조직 등을 chamber에 고정시켜 약물 동력학 또 는 독성에 대한 동적인 반응을 분석할 수 있다. 또한, 마이크로플루이딕스 기반의 마이크로칩을 이용하여 조직을 구성하고 배양하고 분석할 수 있다. Chamber 에 구현된 3-D scaffold를 이용하여 세포조직을 성장
그림 2. 마이크로플루이딕스 기반의 칩을 이용하여 조직 구성, 세포 분리 및 생화학 분석을 할 수 있는 마이크로 시스템
모식도[El-Ali et al., Nature, 2006].
시키고, cytokine 등 다양한 성장인자와 영양분을 미 세유체를 이용하여 공간적 및 양적 조절이 가능하게 공급해줄 수 있다. 반대로 불균일한 세포 조직체에서 서로 다른 세포들을 따로 분리한 다음, 각각의 세포에 대한 유전자나 단백질 분석이 가능하다[그림 2].
마이크로플루이딕스 기능성 세포 칩에서는, 예를 들어 마이크로 perfusion 배양 단위를 칩 위에 구성하 면 3차원으로 세포를 배양할 수 있어, 생체내의 세포 환경과 유사하게 만들어줌으로써 보다 정확한 에세이 결과를 얻을 수 있다. 세포 수준을 넘어 조직 수준에 서 마이크로플루이딕스 기술을 접목시킨 3차원 microorgan 기반의 조직 칩(tissue-on-a-chip) 등이 개발되어 약물동력학과 독성 평가에 활용된 결과도 보고되고 있다 [Chang et al., Tissue Engineering Part C: Methods, 2008]. Hydrogel 기반의 direct cell writing (DCW) bioprinting process를 이용하여 생체 내에서 세포가 접하는 환경과 유사하도록 조절 한 3차원 microorgan을 제작하고 고정시킨 칩을 만들 었다. 이러한 direct cell deposition 기술은 세포의 공 간적 배치를 조절할 수 있고 scaffold에서의 복잡한 cell migration에 의존하지 않아도 되기 때문에 다양 한 종류의 세포에 대하여 3차원 배양을 할 수 있다.
이와 같이 마이크로플루이딕스와 조직공학을 결합시
키면, 생체 내에서의 혈액순환과 유사하게 chamber 조직 세포간의 순환이 가능해져 세포와 분화된 조직, 생물학적 인자 등이 조직에 미치는 미세 영향에 대한 실험결과를 얻을 수 있다. 이처럼 마이크로플루이딕 스와 3차원 조직배양 기술을 효과적으로 접목시킨 microfluidic tissue-on-a-chip은 조직 수준에서 약리 효과와 독성 평가 등에 활용될 것이다.
최근에 organ-on-a-chip 개념을 바탕으로 허동은 박사가 소속된 하버드대학 Wyss 연구소에서 lung- on-a-chip이 개발되었다[Huh et al., Science, 2010].
동전크기의 PDMS 기판 위에 허파의 공기주머니와 폐포의 모세혈관을 모사한 미세유체 칩을 구현한 것 이다[그림 3].
칩의 중간 부분에 2개의 층을 구성하였는데, 아래층 은 폐 모세혈관의 endothelium cell 층을 구축하여 산 소가 많은 폐정맥을 모사하였다. 위층에는 허파꽈리 세포층을 구축하여 기체와 혈류사이의 물질전달을 모 사하였으며, 이들 두개 층을 다공성 막으로 분리시켜 허 파 구조를 모사하였다[그림 3 (A), (B)]. 두 개 channel 의 air pressure를 주기적으로 변화시켰으며, 이에 따라 폐세포를 확장시키거나 수축시킴으로써 허파 기능을 모사하였다. 이러 식으로 숨쉬기 기작을 구현함으로 써 호흡을 통해 인체로 흡입되는 유해물질의 독성 등
그림 3. 인간 허파를 모사한 lung-on-a-chip[Huh et al., Science, 2010].
을 평가하는데 마이크로플루이딕스 세포 칩을 활용할 수 있는 길을 열었다. 이러한 칩은 최근에 많이 합성 되고 있는 나노입자들이 페로 흡입된 경우 인체 내에 서의 거동 또는 독성 유발 유무 등을 고해상도 형광 현미경을 이용하여 측정할 수 있으므로 나노물질 독 성 연구에도 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
앞으로는 폐 이외에도 다양한 인간의 장기를 칩 위에 구현한 human organ-on-a-chip이 구현될 것으로 기 대된다.
마이크로플루이딕스 세포 칩에 만든 여러 chamber 에 다른 종류의 세포나 조직들을 고정화시켜 세포 및 조직들 사이에서 서로 미치는 영향 등을 분석할 수 있 는 animal-on-a-chip이 개발되기도 하였다. 코넬 대 학의 Shuller 교수 연구팀이 개발하고 microscale cell culture analog (µCCA)라고 명명된 animal-on-a- chip은 마이크로플루이딕스 세포 칩의 개념을 확장시 킨 것으로 생리기반 약물 동태학 모델(PBPK)과 마 이크로플루이딕스 세포 칩을 결합한 형태의 칩 디바 이스이다 [Viravaidya et al., Biotechnol Prog, 2004;
Khamsi, Nature, 2005]. 칩 위에 분리되어 있는 compartment에 간, 폐, 신장, 지방, 피부 등 생체 시 스템을 대표하는 기관의 세포를 고정화시키고, 각 compartment 사이를 마이크로 채널로 연결시켜 약
물을 포함한 배지를 순환시킬 수 있는 구조를 가지고 있다[그림 4].
홍익대 성종환 교수는 hydrogel을 이용한 세포 배 양법을 응용하여 간, 암세포, 골수세포를 각각µCCA 의 3개의 chamber에서 배양한 다음, 항암 약물인 5- fluorouracil의 toxicity에 대한 약효와 약물동태학 및 동력학을 분석하였다 [Sung et al., Lab Chip, 2010].
Animal-on-a-chip의 활용을 통해 약물 독성이나 작 용기작에 대해 보다 효율적인 해석이 가능해졌으며, 기존의 동물실험이 느리고 비용이 많이 든다는 단점 을 줄일 수 있다. Animal-on-a-chip이 HTS 형태로 개발되면 약물 후보물질 검색과 독성 평가에 있어서 많은 수의 후보물질들을 테스트해야 하는 과정에서 유발되는 병목 현상과 동물실험에의 의존도를 줄여줄 것으로 예상된다. 그리고 실험동물사용을 없앰으로써 연구 윤리적 문제를 원천적으로 예방할 수 있다는 장 점도 있다. 또한, 실험동물과 animal-on-a-chip에서 얻은 결과를 비교 분석하여 인간 반응에 대한 예측치 를 얻는데 활용할 수 도 있다. 각각의 compartment 에 동물세포 대신에 인간 세포를 고정화시킨 경우 human-on-a-chip으로 활용할 수 있다. 이 기술과 관 련된 특허가 등록되었으며 [Shuller et al., US Patent 7288405, 2007], 미국의 Hµrel사가 상업화를 진행하
그림 4. 네 개의 chamber로 구성된 미세유체 바이오칩인 human/animal-on-a-chip의 모식도(A) 및 칩 형태(B)[H µREL사의
homepage; Weiss, Science News, 2005].
(A) (B)
고 있다. 이 회사는 animal-on-a-chip을 이용하여 새 로운 약물의 효능 및 독성을 평가하는 lab-on-a-chip 개념으로 상업화를 진행하고 있으며, animal-on-a- chip의 가격으로 세포 고정화 단계까지 시킨 비용까 지 포함하여 50달러 정도를 예상하고 있다. 일반적으 로 실험동물이 수백 달러에서 수천달러의 비용이 든 다는 점에서 향후에 가격 경쟁력이 있을 것으로 기대 된다. 만약 실험동물을 대체할 수 있는 마이크로플루 이딕스 세포 에세이 시스템의 개발과 검증 데이터베 이스가 확보되면 관련 법령 등의 개정작업이 진행될 것으로 예상된다. Hµrel사는 최근에L、ORÉAL과 새 로운 화장품 소재가 피부에 알레르기를 유발하는지에 대한in vitro 분석에서 local lymph node assay로 알 려진 동물실험을 대체하는 마이크로플루이딕스 세포 칩 개발을 진행하기로 하였다. Allergy Test on a Chip™이라고 명명된 바이오칩은 인간 피부조직을 구 축한 chamber와 면역반응 세포들을 구축시킨 chamber를 통합시킨 미세유체 칩을 구현함으로써 피 부 chamber에서 발생된 알레르기가 의심되는 물질들 이 면역반응 활성으로 유도되는지를 평가하고자 한다.
이러한 Allergy Test on a Chip™은 동물을 사용하지 않는다는 점에서 화장품 회사 이미지제고에도 큰 도 움을 줄 것으로 기대하고 있다.
맺음말
지금까지 언급한 마이크로플루이딕스 세포 칩의 응 용성에 대한 기대를 충족시키기 위해서는 기술적으로 해결해야 할 사항들이 많이 남아있다. Chamber사이 에서 배지 또는 화학물질들이 순환되는 과정에서 세
포에 미치는 전단응력, 기포 생성 영향 등에 대한 정 량적 해석이 필요하며, 이러한 데이터를 바탕으로 보 다 재현성 있는 결과를 줄 수 있는 chamber 및 칩 디 자인이 가능해야 한다. 칩의 chamber에 고정화 시킨 세포가 실제 신체 내의 기관과 유사한 형태를 가질 수 있도록 3차원 조직 배양과 관련하여 보다 진보적인 기술 개발도 필요하다. 또한 수용성이 낮은 약물 후보 물질을 다룰 수 있는 마이크로플루이딕스 세포 칩 개 발도 필요하다. 약물동력학 분석 관련해서는 간, 신장, 내장 등의 조직세포에서 약물에 대한 absorption, distribution 및 excretion에 관여하는 수송 단백질에 대한 분석 자료를 얻을 수 있는 마이크로플루이딕스 세포 칩 개발도 중요하다.
Animal-on-a-chip의 각 compartment에 다른 종 류의 실험동물 유래의 세포, 조직 들을 조합하여 사용 하는 경우 종간의 organ 기능상의 특성 차이로 인한 차이점을 분석할 수도 있을 것이다. 인간 세포 및 조 직을 이용하면 human-on-a-chip으로 발전시킬 수 있다. 만약 두 종류의 실험동물을 사용하여 진행한 약 물의 효능 및 독성에 대한 실험 결과가 다르게 나온 경우 인간에 대한 효과는 어떤 식으로 될 것인지를 예 상하기가 어려운데, 이러한 문제를 human-on-a-chip 이 해결해줄 수 있을 것으로 기대되어, 가까운 장래에 human-on-a-chip 기반의 예측 독성평가 (predictive toxicology)가 가능해 질 것으로 기대된다. 특히 환자 의 조직과 신체 내 혈류와 유사한 동적 특성을 주는 마이크로플루이딕스 세포칩을 구현하면 개인 특성화 약물 개발을 위한“You-on-a-chip”플랫폼을 제작할 수 있을 것으로 기대된다.
