Vol. 40, No. 1, March 2014, 109-120 http://dx.doi.org/10.15230/SCSK.2014.40.1.109
추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 항노화 효능
전지민⋅유대성⋅천종우⋅권순식*⋅전소하*⋅박수남*,†
(주)에이씨티 기술연구소, *서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소
(2013년 10월 14일 접수, 2013년 10월 24일 수정, 2013년 11월 20일 채택)
Anti-aging Effect of Inula britannica var. chinensis Flower Extract According to the Extraction Temperature
Ji Min Jeon, Dae Sung Yoo, Jong Woo Cheon, Soon Sik Kwon*, So Ha Jeon*, and Soo Nam Park,*,†
R&D Center, ACT Co., Ltd., 102-201, Digital Empire II, 88, Sinwon-ro, Youngtong-gu, Suwon, Gyeonggi-do 443-734, Korea,
*Department of Fine Chemistry, Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, 232, Gongneung-ro, Nowon-gu, Seoul 139-743, Korea.
(Received October 14, 2013; Revised October 24, 2013; Accepted November 20, 2013)
요 약: 본 연구에서는 추출 온도에 따른 금불초 꽃(I. britannicavar. chinensis) 추출물의 항노화 효능을 알아 보았다. 추출 온도에 따른 세포독성을 살펴본 결과, 상온, 45 ℃와 65 ℃ 추출물 모두 0.1% 이하의 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았다. 0.1% 이하의 농도에서 항노화 효능평가를 수행한 결과, 0.1% 농도의 상온 추출물 경우에 멜라닌 생성 억제율은 24.5%로 45 ℃와 65 ℃ 추출물과 비교하여 멜라닌 생성 억제율이 큰 것으로 나타났 다. 0.1% 농도의 상온 추출물을 처리한 세포의 히알루론산 합성 관련 유전자 HAS-1, HAS-2 및 HAS-3의 발현 율은 각각 123.3%, 137.8% 및 133.2%를 나타냈으며, 이는 비교물질인 L-ascorbic acid (115.6%, 121.0%
및 131.4%) 경우 보다 약간 크게 나타났다. 금불초 꽃 45 ℃ 추출물의 경우, 0.1%의 농도에서 염증유발 유전자인 TNF-α, COX-2 및 IL-1α의 발현율이 대조군 대비 각각 30.3%, 12.8%, 25.7%로 감소하였으며, 이는 상온, 65 ℃ 추출물과 비교하여 염증유발 유전자 발현 억제 효과가 더 큰 것으로 나타났다. 이상의 결과들로 볼 때, 금불 초 꽃 추출물은 추출 온도에 따라 멜라닌 생성 억제, 히알루론산 합성 관련 유전자 발현 증가 효과, 염증유발 유전자 발현 억제 효과를 나타내며, 그로 인하여 피부에서 미백, 보습, 항염 효능을 통해 피부 항노화 효능을 가질 것으로 사료된다. 이는 금불초 추출물이 항노화 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
Abstract: In this study, the extracts of Inula britannica var. chinensis (I. britannica) flower were extracted at three dif- ferent temperatures (room temperature, 45 ℃, and 65 ℃) and their anti-aging effects were studied. Before investigating anti-aging effects of the extracts, their cytotoxicity was tested on B16F10, Hs683, and HaCaT cells. All extracts showed no cytotoxicity at the concentration less than 0.1% (v/v). Melanin synthesis inhibitory activities in B16F10 cells and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) in Hs683 and HaCaT cells were used to see their anti-aging effects. The room temperature extract at 0.1% showed 24.5% melanin synthesis inhibition, which was better than the 45 ℃ and 65 ℃ extracts. In addition, expression rates of the room temperature extract at 0.1% on HAS-1, HAS-2, and HAS-3 related to hyaluronan synthase genes were 123.3%, 137.8%, 133.2%, respectively. which were higher than reference material of L-ascorbic acid. Expression rates of the 45 ℃ extract at 0.1% on TNF-α, COX-2, and IL-1α, which are inflammatory related genes, was suppressed to 30.3%, 12.8%, 25.7%, respectively. It was better in anti-in
1)
† 주 저자 (e-mail: [email protected])
flammatory effect than the room temperature and 65 ℃ extracts. As results, we showed that I. britannica var. chinensis flower extarcts decreased melanin production and expression of inflammatory related genes and increased the expression rate of hyaluronan synthase genes. Thus, it is believed that the extracts affect anti-aging effects of skin through whiten- ing, moisturizing, and anti-inflammatory processes and could be applicable to cosmetics as a functional cosmetic ingredient.
Keywords: Inula britannica flower, anti-aging, whitening, moisture, anti-inflammation
1. 서 론
피부는 전신을 둘러싸며 외부로부터 여러 가지 자 극 및 장해, 혹은 건조로부터 생체를 보호하는 역할을 하고 있다. 몇 가지 내인적 및 외인적 인자들이 복잡 한 피부 노화 현상에 기여하고 있다. 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 발생하는 내인적 노화와는 달리 외 인적 피부노화는, 특히 태양광선에 매일 노출되는 신 체 부분에서 자외선의 작용으로 야기된다[1]. 자외선 의 작용으로 피부에는 과잉의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 이러한 ROS는 피부 내 항산화 효소와 비타민 E 및 C, 유비퀴놀, 글루타치 온과 같은 저분자량의 항산화제들에 의해 감소한다.
이와 같이 자외선에 의해 생성된 활성산소종은 실질 적으로 피부의 효소적 그리고 비효소적 항산화 방어 를 위태롭게 한다. 결과적으로 산화적 스트레스는 피 부 세포 및 성분들의 손상을 유발한다. 특히 피부 진 피층의 결합조직인 콜라젠 및 엘라스틴 섬유의 절단 및 비정상적인 교차결합, 세포 외 매트릭스 구성 성분 들의 함량 감소뿐만 아니라 피부 면역 세포인 랑게르 한스 세포의 감소 및 섬유 단백질과 히아루론산 (hyaluronic acid, HA)과 같은 글라이코사미노글라이칸 (glycosaminoglycan, GAG) 등의 세포 외 매트릭스 구 성 성분들을 생성하는 섬유아세포의 능력 감소 등 심 각한 손상이 발생한다. 히아루론산은 GAG의 중요한 성분으로서 피부조직의 수분 유지/보유 능력이 뛰어 나며, 영양성분의 저장과 확산뿐만 아니라 세포의 분 열, 분화 및 이동에도 관여한다[2-4]. 섬유아세포와 각 질형성세포에 존재하는 히알루론산 합성효소인 hya- luronan synthase (HAS)-1, HAS-2, HAS-3의 발현 감소 는 주름발생 및 탄력감소로 이어지기 때문에, HAS의 발현정도가 노화의 지표가 되기도 한다[5-8]. 이와 같 이 자외선으로 인한 활성산소 발생을 포함하여 일어 나는 일련의 피부노화 현상을 광노화라고 한다[9-13].
피부가 자외선에 노출되어 과잉의 ROS가 생성되면 피부에는 광산화적 손상이 일어나 피부노화가 가속화 된다. 멜라닌은 자외선으로부터 피부를 보호하기 위 한 하나의 방어수단이기도 하다. 그러나 피부에서 자 외선 및 몇몇 인자들에 의한 증가된 멜라닌 생성 혹은 멜라노사이트의 증식은 기미⋅주근깨와 같은 색소침 착 증상의 원인이 된다[14-16].
색소침착 이외에도 피부에서는 자외선의 작용으로 홍반과 같은 염증반응이 일어날 수 있다. 피부가 자외 선에 노출되면 다양한 종류의 염증 유발인자들이 발 현된다. 대표적인 염증 관여 효소 중 하나인 cyclo- oxygenase-2 (COX-2)는 세포막에 있는 아라키돈산으 로부터 염증 매개체인 프로스타글란딘(prostaglandins) 의 합성을 촉매한다. 또한 COX-2의 발현은 염증반응 을 매개하는 tumor growth factor- (TNF-), inter- leukin-6 (IL-6), interleukin-1 (IL-1) 및 interferon-
(IFN-) 등의 다양한 염증성 인자들의 발현을 도와 피 부 염증반응을 촉진시킨다[17-21]. 따라서 자외선에 의한 피부노화를 억제하고 예방하기 위해서 항산화, 항염증, 콜라젠 및 히아루론산의 합성을 촉진하는 다 양한 기능성 소재 등 항노화 물질 개발에 많은 관심이 모아지고 있다[22-25].
본 연구에 앞서 저자들은 금불초 꽃 추출물의 피부 상재균에 대한 항균 및 항산화활성을 측정하였다. 실 험결과 추출물 중 에틸아세테이트 분획이 여드름균에 대한 항균 및 총항산화능에 있어서 큰 활성을 나타냄 을 확인한 바 있다[22]. 이어 금불초 꽃 추출물 함유 크림을 제조한 후 크림의 안정성 및 인체 시험을 수행 하여 화장품에 금불초 꽃 추출물의 응용 가능성을 제 시하였다[26]. 또한 금불초 꽃 추출물을 화장품 원료 로 개발하기 위해서 최근 금불초 종(種) 및 개화시기 에 따른 항산화 효능과 최적 추출조건을 확립하였다.
그 결과 추출용매는 에탄올, 추출온도는 65 ℃와, 만 개한 금불초(I. britannica) 꽃 추출물을 이용하는 경우
가 free radical 소거활성과 활성산소로 유도된 세포 손 상에 대하여 세포를 보호하는 효과가 가장 우수한 최 적의 추출 조건임을 확인하였다[25].
본 연구에서는 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물 의 항노화 효능을 세포 및 유전자 수준에서 검토하고 자 하였다. 미백, 보습, 항염 효능 평가 전에 세포 수준 에서 금불초 꽃 추출물의 세포독성을 조사하고 실험 에 필요한 추출물의 농도를 결정하였다. 멜라닌 생성 저해율, 콜라젠과 히알루론산 합성 관련 유전자 및 염 증유발 유전자의 발현에 온도별 추출 조건에 따른 금 불초 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 평가하였 다. 이를 통해 궁극적으로 금불초 꽃 추출물의 최적 추출 조건을 확립하였고 또한 금불초 꽃 추출물이 세 포 및 유전자 수준에서 항노화 효능을 갖는 기능성 화 장품 소재로서 응용 가능성이 있음을 알았기에 이를 보고하고자 한다.
2. 실험 재료 및 방법
2.1 실험 재료 및 기기
본 연구에 사용한 금불초는 봉양야생화(충북 제천 시 신월동 205-2)로부터 재배된 것으로 사용하였고, 상온에서 자연건조 72 h 후 추출하였다. Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), -arbutin 및 L-ascorbic acid 는 Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급시약을 사용하였다.
ELISA reader는 Spectra Max190 (Molecular device, USA), 역전사중합효소 연쇄반응 (reverse transcripta- se-polymerase chain reaction, RT-PCR)은 TC-E-48D (GenePro, China) Termalcycler를 사용하였다.
2.2 세포 배양
사람 섬유아세포주(human fibroblast cell line, Hs683) 와 마우스 유래 멜라닌 세포주(mouse melanoma, B16F10)는 Korean Cell Line Bank (KCLB, Korea)에서 분양 받았으며, 사람 각질형성 세포주(human keratino- cyte cell line, HaCaT)는 Fusenig 박사(German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg, Germany)로부터 분양 받아 사용하였다. 이를 10% (v/v) fetal bovine se- rum (FBS, Gibco, USA), 100 U/mL의 streptomycin, 100 U/mL의 penicillin 항생제(Gibco, USA)가 포함된
Dulbeco’s modified eagle’s medium (DMEM, Gibco, USA)배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건의 세포 배 양기에서 배양하였다.
2.3 금불초 꽃 추출물의 제조
만개한 금불초의 꽃을 상온에서 자연 건조 72 h 후 추출에 사용하였다. 이전 연구의 추출조건을 참조하 여 에탄올을 추출용매로 사용하였고[25], 상온, 45 ℃ 와 65 ℃에서 4 h 동안 추출하였다. 추출 후 여액을 항 노화 효능 평가에 이용하였다.
2.4 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 항노화 효능 평가
2.4.1 세포독성 평가
미백 효능 평가를 위한 B16F10 (mouse melanoma) 세포주, 주름개선 및 보습 효능 평가를 위한 Hs683 (human fibroblast) 세포주, 항염 효능평가를 위한 HaCaT 세포주(human keratinocyte)를 각 well에 1 × 105 cells/well의 농도로 분주한 후 37 ℃, 5% CO2하에서 24 h 동안 배양하였다. 다음날 세포의 배양 배지를 제 거하고 금불초 꽃 추출물이 각각 농도별로 첨가된 배 지를 분주하여 다시 24 h 동안 배양한 후 배지를 제거 하고 인산완충용액으로 세포를 두 번씩 세척해주었 다. MTT를 3 mg/mL 농도가 되도록 인산완충용액에 녹이고 이를 다시 새 배지를 이용하여 1/10 로 희석한 후 각 well에 100 μL 첨가하여 37 ℃, 5% CO2하에서 4 h 동안 배양하였다. 각 well에 들어있는 여분의 배지 를 제거하고 DMSO를 한 well당 150 μL씩 넣어 30 min 동안 교반 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측 정하여 아래 식에 따라 세포생존율을 계산하였다.
세포생존율(%) = (시료 첨가구의 흡광도 / 대조구의 흡광도) × 100
2.4.2 미백 효능 평가
B16F10 세포를 12 well plate에 각 5×104 cells/well의 농도로 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2하에서 24 h 동안 배 양하였다. 다음날 세포의 배양 배지를 제거하고 금불 초 꽃 추출물을 적정 농도에 맞도록 희석한 희석액을 처리하여 24 h 배양한 후에 세포를 수거하여 용해, 건 조시키고 1N NaOH 용액에 멜라닌을 용해시켜 400
Gene Primer sequence
GAPDH Forward 5' - AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC - 3'
Reverse 5' - TGA GGA GGG ATT CAG TG - 3'
COL1A1 Forward 5' - AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT - 3'
Reverse 5' - TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG - 3'
MMP-1 Forward 5' - GAT GTG GAG TGC CTG ATG TG - 3'
Reverse 5' - TGC TTG ACC CTC AGA GAC CT - 3' MMP-2 Forward 5' - GTG CTG AAG GAC ACA CAC TAA AGA AGA - 3'
Reverse 5' - TTG CCA TCC TTC TCA AAG TTG TAG G - 3' Table 1. Primer Pair of GAPDH, COL1A1, MMP-1, and MMP-2 on Hs683 Cell
Gene Primer sequence
GAPDH Forward 5' - AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC - 3'
Reverse 5' - TGA GGA GGG ATT CAG TG - 3'
HAS-1 Forward 5' - GAG TCC TGG GTC AGC TTC CTA AG - 3'
Reverse 5' - GTA GAA CAG ACG CAG CAC AG - 3'
HAS-2 Forward 5' - GCT ACC AGT TTA TCC AAA CG - 3'
Reverse 5' - GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G - 3'
HAS-3 Forward 5' - GAG GAC TGG TAC CAT CAG AA- 3'
Reverse 5' - GCC AGA TTT GTT GAT GGT AGC - 3' Table 2. Primer Pair of GAPDH, HAS-1, HAS-2, and HAS-3 on Hs683 Cell
Gene Primer sequence
GAPDH Forward 5' - AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC - 3'
Reverse 5' - TGA GGA GGG ATT CAG TG - 3'
TNF-α Forward 5' - ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC - 3'
Reverse 5' - TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC CTG CCC - 3' COX-2 Forward 5' - TTC AAA TGA GAT TGT GGA AAA ATT GCT - 3'
Reverse 5' - AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT - 3' IL-1α Forward 5' - CTG TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC- 3'
Reverse 5' - CAT GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C - 3' Table 3. Primer Pair of GAPDH, TNF-α, COX-2, and IL-1α on HaCaT Cell
nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.4.3 주름개선 효능 평가
콜라젠의 합성과 관련된 유전자 발현은 primer를 이 용하여 RT-PCR로 측정하였다. Hs683 세포를 6 well plate에 각 5×105 cells/well의 농도로 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2하에서 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 배지를
제거하고 금불초 꽃 추출물을 적정 농도에 맞도록 희 석액을 처리하여 24 h 배양한 후에 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였 다. RNA의 순도와 무결성은 A260/A280비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수득률은 260 nm에서 흡광도 를 측정하여 계산하였다. cDNA합성은 3 μg의 total RNA를 Oligo dT 15 (500 ng/μL) primer, dNTP (10
(A) B16F10 cell
(B) Hs683 cell
(C) HaCaT cell
Figure 1. Cell viability of I. britannica var. chinensis flower extract according to the extraction temperature and concentration.
(A) B16F10 (mouse melanoma) cell, (B) Hs683 (human fibroblast) cell, (C) HaCaT (human keratinocyte) cell. *p < 0.05.
mM), RTase inhibitor (40 units/μL), Powerscript Ⅱ RTase (Clontech, USA)를 첨가하여 25 ℃에서 10 min 간 primer annealing, 42 ℃에서 60 min간 cDNA를 합성 하고 95 ℃에서 5 min간 RTase denaturation 시켰다.
PCR은 cDNA로부터 COL1A1 (Procollagen type I), MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1)과 MMP-2 유전자 를 증폭하기 위하여 cDNA 3 μL, 10X buffer [10 mM Tris - HCl (pH 8.8), (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4] 5 μL,
Figure 2. Melanin synthesis inhibition of I. britannica var. chinensis flower extract according to the extraction temperature and concentration. *p < 0.05.
2.5 mM dNTP 2 μL, 10 pmol primer 각각 2 μL, taq pol- ymerase 0.5 μL를 혼합하고 증류수를 더하여 50 μL로 조정하였다. 각 유전자들의 primer 서열은 Table 1과 같다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에 서 전기영동 하여 image analyzer로 확인하였으며 각 band의 intensity는 Densitometric program (Gene Tools, Syngene, UK)을 이용하여 측정하였다.
2.4.4 보습 효능 평가
보습 효능 평가는 주름개선 효능 평가와 동일한 방 법으로 Hs683 세포에서 RT-PCR 기법을 이용하여 보 습 관련 유전자의 발현 양을 확인하였으며, 각 유전자 들의 primer 서열은 Table 2와 같다.
2.4.5 항염 효능 평가
항염 효능 평가는 HaCaT 세포에서 주름개선 및 보 습 효능 평가와 동일한 방법으로 RT-PCR 기법을 이 용하여 염증 관련 유전자의 발현 양을 확인하였으며, 각 유전자들의 primer 서열은 Table 3과 같다.
2.4.6 통계처리
실험결과는 각 군의 t-test를 실시하여 대조군과 실 험군 간 유의성 여부를 가설평균 차 5% (p < 0.05)로 하여 p-value가 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 해석하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 세포독성
추출 온도별 금불초 꽃 추출물의 항노화 효능 평가 를 위하여 각 효능 평가에 사용되는 세포주에 대한 세 포독성 평가를 수행하였고, 이에 대한 결과는 Figure 1 과 같다. 상온, 45 ℃와 65 ℃ 추출물 모두 추출 온도 와 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감 소하는 경향을 나타내었다. 또한 각 세포주에 대한 독 성평가 결과, 사람유래의 Hs683 세포와 HaCaT 세포의 경우 세포 생존율의 감소가 모두 비슷한 수준으로 나 타났으며, 마우스유래의 B16F10 세포의 경우에는 금 불초 꽃 추출물의 농도가 2% 이상인 경우에 급격하게 세포 생존율이 감소하였다. 상온, 45 ℃와 65 ℃ 추출 물은 모두 0.1% 이하의 농도에서 온도와 세포주에 대 한 독성이 없는 것으로 나타났기 때문에 항노화 효능 평가는 0.1% 이하의 농도로 수행하였다.
3.3 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 주름개선 효능 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 주름개선 효 능 평가를 위하여 Hs683 세포에서 RT-PCR 수행을 통 해 콜라겐 합성 관련 유전자 발현을 측정하였다. 주름 개선 효능에 있어서 비교물질로는 강력한 항산화 작 용 및 콜라젠 합성으로 항노화 효능이 우수한 것으로 알려져 있는 L-ascorbic acid를 사용하였다[28,29].
Figure 3에서와 같이, 상온 추출물의 경우는 농도가 증 가함에 따라 MMP-1 유전자의 발현을 감소시키는 것 으로 나타났으나 COL1A1과 MMP-2 유전자 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 45 ℃, 65 ℃ 추 출물의 경우는 모두 COL1A1, MMP-1와 MMP-2 유전 자 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러 나 상온, 45 ℃와 65 ℃ 추출물들은 L-ascorbic acid와
(C) HAS-3 Expression (B) HAS-2 Expression (A) HAS-1 Expression
Figure 3. RT-PCR analysis of I. britannica var. chinensis flower extract according to the extraction temperature and conceentration (A) COL1A1, (B) MMP-1, (C) MMP-2. *p < 0.05.
비교하여 콜라젠 합성 관련 유전자의 발현에 미치는 영향은 미미한 것으로 나타났다.
3.4 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 보습 효능 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 보습 효능 평 가를 위하여 주름개선 효능 평가와 동일한 방법으로
Hs683 세포에서 RT-PCR 수행을 통해 히알루론산 합 성 관련 유전자 발현을 측정하였다. 보습효능에 대한 비교물질로는 주름개선 효능과 마찬가지로 항노화 효 능이 우수한 것으로 알려져 있는 L-ascorbic acid를 사 용하였다. Figure 4에서와 같이, 상온 추출물의 경우, 농도 증가와 함께 히알루론산 합성 관련 유전자인
(A) HAS-1 Expression
(B) HAS-2 Expression
(D) mRNA Expression of RT-PCR (C) HAS-3 Expression
Figure 4. RT-PCR analysis of I. britannica var. chinensis flower extract according to the extraction temperature and concentration. (A) HAS-1, (B) HAS-2, (C) HAS-3, (D) mRNA expresstion of RT-PCR. *p < 0.05.
(A) TNF-α Expression
(D) mRNA Expression of RT-PCR (C) IL-1α
(B) COX-2 Expression
Figure 5. RT-PCR analysis of I. britannica var. chinensis flower extract according to the extraction temperature and concentration. (A) TNF-α, (B) COX-2, (C) IL-1α, (D) mRNA expresstion of RT-PCR. *p < 0.05.
HAS-1, HAS-2와 HAS-3 모두의 발현을 증가시키는 것 으로 나타났으며, L-ascorbic acid와 비슷한 수준의 발 현 증가를 보였다. 45 ℃ 추출물의 경우에는 농도가 증가함에 따라 오히려 HA1-1 유전자의 발현을 감소시 키는 것으로 나타났고, HAS-2과 HAS-3 유전자 발현 에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한 65
℃ 추출물의 경우에는 농도가 증가함에 따라 HAS-2 유전자의 발현을 증가시키고, HAS-1과 HAS-3 유전자 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
3.5 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 항염 효능 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 항염 효능 평 가를 위하여 주름개선 및 보습 효능 평가와 동일한 방 법으로 HaCaT 세포에서 RT-PCR을 수행하여 염증유 발 관련 유전자 발현을 측정하였다. 염증 효능에 대한 비교물질로는 항염 효능이 우수한 것으로 알려져 있 는 D-panthenol을 사용하였고[30], 이에 대한 결과는 Figure 5와 같다. 상온 추출물과 65 ℃ 추출물의 경우 에는 염증유발 관련 유전자인 TNF-, COX-2와 IL-1
모두의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났 다. 45 ℃ 추출물의 경우에는 농도가 증가함에 따라 TNF-, COX-2와 IL-1 모두의 발현을 감소시키는 것으로 나타났고, 비교물질인 D-panthenol과 비슷한 수준의 발현 감소를 보였다.
4. 결 론
본 연구에서는 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물 의 항노화 효능을 알아보기 위하여 세포독성, 멜라닌 생성 저해율, 콜라젠과 히알루론산 합성 관련 유전자 및 염증유발 유전자의 발현을 측정하였다.
1) 추출 온도별 세포독성 평가 결과 B16F10, Hs683, HaCaT 세포 모두 0.1%의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타나 0.1% 이하의 농도에서 각 세포를 이용 한 효능 평가를 수행하였다.
2) 추출 온도에 따른 금불초 꽃 추출물의 멜라닌 생 성 저해율 평가 결과, 0.1% 농도의 상온 추출물에서 멜라닌 생성 저해율이 24.47%로 45 ℃, 65 ℃ 추출물 보다 높은 것으로 나타나 멜라닌 생성을 저해하여 미 백 효능이 있을 것으로 사료되며, 미백 효능은 상온
추출물의 경우가 가장 우수할 것으로 사료된다.
3) 콜라겐 합성 관련 유전자의 발현 측정 결과, 45
℃와 65 ℃ 추출물의 경우에는 COL1A1, MMP-1와 MMP-2 유전자 모두 발현에 영향을 미치지 않는 것으 로 나타났고, 상온 추출물의 경우에는 0.1%의 농도에 서 MMP-1 유전자 발현율이 71.3%로 대조군 대비 28.7% 감소되는 것으로 나타났으나 COL1A1과 MMP-2 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 또한 L-as- corbic acid와 비교하여 콜라겐 합성 관련 유전자의 발 현에 미치는 영향이 미미한 것으로 나타났다. 이에 따 라 금불초 꽃 추출물은 콜라젠 합성 유전자 발현 촉진 에 의한 주름개선 효능은 없을 것으로 사료된다.
4) 히알루론산 합성 관련 유전자 발현 측정 결과, 상온 추출물의 경우에서만 농도 의존적으로 HAS-1, HAS-2와 HAS-3 유전자 모두 발현을 증가시키는 것으 로 나타났다. 상온 추출물 0.1%의 농도에서 HAS-1, HAS-2와 HAS-3의 발현율은 각각 123.3%, 137.8%, 133.2%로 L-ascorbic acid 115.6%, 121.0%, 131.4%보다 높았고, 이에 따라 금불초 꽃 추출물은 히알루론산 합 성 관련 유전자 발현 증가로 인한 보습 효능이 있을 것으로 사료되며, 상온 추출물의 경우 보습 효능이 가 장 우수할 것으로 사료된다.
5) 염증유발 유전자 발현 측정 결과, 45 ℃ 추출물 의 경우에서만 농도 의존적으로 TNF-, COX-2와 IL-1 유전자 모두 발현을 감소시키는 것으로 나타났 다. 45 ℃ 추출물 0.1%의 농도에서 TNF-, COX-2와 IL-1의 발현율은 각각 69.7%, 87.2%, 74.3%로 나타 났고, D-panthenol은 71.2%, 103.1%, 61.3%로 나타나 염증유발 유전자의 발현을 억제하여 항염 효능이 있 을 것으로 사료되며, 45 ℃ 추출물의 경우 가장 우수 한 항염 효능 나타낼 것으로 사료된다.
따라서, 추출 온도에 따른 금불초 꽃의 항노화 효능 을 평가한 결과, 상온 추출물의 경우 미백, 보습 효능 이 우수한 것으로 나타났고, 45 ℃ 추출물의 경우에는 항염 효능이 우수한 것으로 나타났다. 65 ℃ 추출물의 경우에는 앞서 밝힌 이전의 연구결과 항산화 효능이 가장 우수한 것으로 나타났다. 상기 결과를 통해 금불 초 꽃 추출물은 추출 온도에 따라서 나타나는 항노화 효능이 각기 다름을 알 수 있었다. 따라서 금불초 꽃 추출물은 목적하는 효능에 따라 추출 온도를 달리 하 여 사용한다면 항노화 화장품 소재로서 다양한 활용
이 가능할 것으로 기대한다.
따라서, 금불초 꽃 추출물은 추출 온도에 따라서 미 백, 보습, 항염, 항산화 효능과 같은 다양한 항노화 효 능을 가지며 이는 금불초 활성성분 중 플라보노이드 에 기인한 것으로 사료된다. 이에 향후 추출 온도에 따른 금불초 꽃의 활성 성분 확인에 대한 연구가 필요 하다고 사료된다.
감사의 글
본 연구는 중소기업청의 기술혁신개발 사업 과제의 연구비에 의하여 수행된 논문이므로 이에 감사드립니 다(과제고유번호: S2048955).
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