Effect of Aqueous Extract of Sukjiyanggeun-Tang(shu?d?lya?ngj l?n-ta?ng ) on Functional Recovery and Expressions of Inflammatory Mediators after Sciatic Nerve Crushed Injury in Rat

￭ 접 수 : 2013년 3월 18일, 수정 : 2013년 3월 27일, 채택 : 2013년 4월 5일

￭ 교신저자 : 임형호, 인천시 남동구 구월동 1200-1번지 가천대학교부속 한방병원 한방재활의학과 Tel : (070) 7120-5011, Fax : (032) 468-4033, E-mail : [email protected]

熟地養筋湯 추출물이 흰쥐 좌골신경 손상 후에 기능회복과 염증 매개 인자 발현에 미치는 영향

장 건⋅송윤경⋅임형호

가천대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Effect of Aqueous Extract of

Sukjiyanggeun-Tang ( ) on Functional Recovery and Expressions of Inflammatory Mediators

after Sciatic Nerve Crushed Injury in Rat

Gun Jang, O.M.D., Yun-Kyoung Song, O.M.D., Hyung-Ho Lim, O.M.D.

Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Gachon University

Objectives :

Peripheral nerve injuries are commonly encountered clinical problems and often result in severe functional deficits. Sukjiyanggeun-Tang(shúdˋ

yǎngj

n-tāng ), in oriental medicine, has been used to treat various musculoskeletal disorders.

Methods :

In the present study, the effects of aqueous extract of Sukjiyanggeun-Tang(shúdˋ

yǎngj

n-tāng ) on functional recovery, severity of pain, and expressions of neurofilament, cycloxygenease-2(COX-2), inducible nitric oxide synthase(iNOS), and tumor necrosis factor-α(TNF-α) following sciatic crushed nerve injury in rats were investigated. For this study, walking tract analysis, plantar test, western blot analysis for COX-2 iNOS, and TNF-α, and Immunofluorescence test for neurofilament were performed.

Results :

In the present results, sciatic functional index(SFI) in walking tract analysis was significantly decreased following sciatic crushed nerve injury, and pain severity in plantar test was significantly increased. COX-2, iNOS and TNF-α expressions were increased whereas neurofilament expression was decreased by sciatic crushed nerve injury, In contrast, treatment with Sukjiyanggeun-Tang(shúdˋ

yǎngj

n-tāng ) improved SFI in walking tract analysis and suppressed the pain severity in sciatic crushed nerve injury. Sukjiyanggeun-Tang(shúdˋ

yǎngj

n-tāng ) treatment also suppressed COX-2, iNOS, and TNF-α expressions and enhanced the neurofilament expression in sciatic crushed nerve injury.

Conclusions :

In the present study, we have shown that Sukjiyanggeun-Tang(shúdˋ

yǎngj

n-tāng ) is the effective therapeutic modality to ameliorate the symptoms of sciatic crushed nerve injury.

Key words : Sukjiyanggeun-Tang(shúdˋ

yǎngj

n-tāng ), Sciatic nerve injury, Axonal Regeneration, Sciatic functional index, COX-2, iNOS, TNF-α

Ⅰ. 서 론

좌골 신경은 골반, 엉덩이와 대퇴부 근육들로 완충되기는 하지만 좌골 반흔(sciatic notch)에서 대퇴부로 내려가는 긴 해부학적 경로 때문에 외 부 압력에 의해 손상되기 쉽다

. 좌골신경손상의 원인은 대퇴골 골절, 대퇴부 압박, 고관절 골절이나 탈구, 고관절 치환술의 부작용 등이며. 좌골신경손 상의 주요 원인인 비구골절(acetabular fracture)의 유병률은 10~36%로 보고되고 있다

.

중추신경과 달리 좌골신경과 같은 말초신경은 신경이 손상되어도 손상 전 상태로 재생되어 기 능을 회복할 수있다. 그럼에도 불구하고 여전히 축삭의 소실은 많은 수초 질환에서 영구적인 신 경학적 장애를 일으키는 중요한 원인이다

. 말 초신경 손상은 치료 후에도 운동신경과 감각신경 세포의 감소, 느리고 불충분한 축삭 생성, 중추신 경계의 지속적인 변화와 신경병변성 통증인 이질 통증(allodynia)과 통각과민(hyperalgesia) 등을 초래하게 된다

.

말초신경 손상은 흔하게 발생하는 임상적인 질환이며, 장기간에 걸쳐 기능적 결손을 가져오 게 된다. 지금까지 신경손상 후 호전되는 결과를 얻기 위한 방법을 개발하기 위하여 지속적인 연 구가 진행되고 있으나 말초신경은 불완전 손상 후 어느 정도의 신경 재생이 가능하지만 이 과정이 너무나 느리고 완전한 회복력이 어렵다는 데에 문제가 있고, 완전절단과 같은 심한 손상 시 신경 접합술과 같은 외과적 방법이 사용되고 있지만 완전한 회복을 기대 하기 어려운 실정이다

.

좌골신경 손상 회복을 촉진시키기 위한 한의 학적 연구들은 침, 전침, 봉침, 약침과 같은 침

10-14)

과 관련한 연구, 시호

, 우슬

, 두충

, 갈근

18)

, 진교

, 초오

등과 같은 약재와 관련한 연

구, 오약순기산

, 독활탕

, 육미지황탕

, 사물제 통탕

해인탕

등과 같은 처방과 관련한 연구 등으로 다양하게 보고되고 있으나, 임상에서 효과 가 있는 경험 처방에 대한 보고는 없는 실정이다.

숙지양근탕(熟地養筋湯)은 숙지황, 산약, 산수 유, 목단피, 백복령, 택사, 당귀, 우슬, 육계, 부자, 위령선, 구기자, 백지, 강활, 두충, 목과, 백작약, 감초로 구성되어 임상에서 요추추간판 탈출증이 나 협착증으로 인한 신경병증에 좋은 효과를 보 였던 경험처방으로, 구성약물들은 신경재생효과

16,21,24),

소염효과 및 진통효과

, 근위축억제효과

32)

, 면역증강효과

의 효과가 알려져 있다.

지금까지 숙지양근탕의 주재료인 한약재에 대 한 효능에 관한 연구는 많이 알려져 있으나 숙지 양근탕이 임상에서 쓰여지는 효능과 관련된 좌골 신경손상에 미치는 연구는 없는 실정이다. 따라 서 본 연구에서는 좌골신경 압박 손상 모델 흰쥐에 서 숙지양근탕 추출물의 투여가 기능적 회복을 관 찰할 수 있는 좌골신경 기능지수(sciatic functional index, SFI)와 축삭의 손상 정도와 신경 회복 정 도의 지표인 neurofilament, 좌골신경손상에서 신경의 염증관련인자인 COX-2, iNOS, TNF-α에 어떠한 영향을 주는지를 알아보고자 하였다.

Ⅱ. 연구방법

1. 재료

1) 동물

본 실험에 사용된 동물은 7주령의 수컷 흰쥐

Sprague-Dawley계(230±10 g)를 국가공인 동물취

급업체(Orient Co., Chungbuk, Korea)로부터 공

급받았다. 실험동물들은 3일 간의 환경적응 기간

을 거치게 하였으며, 각 실험군 별로 4마리씩의 쥐들을 한 개의 사육케이스(30 cm×20 cm)에 넣고 항온(20±2 ℃), 항습(60%)이 유지되고 12시간 간격 으로 낮과 밤을 교대되는 동일한 실험실 환경에서 사육하였다. 실험동물의 사육 및 처치는 동물실험 윤리위원회의 윤리 요강에 준하여 실험하였다

2) 실험군 분류

실험동물은 정상군과 대조군, 실험군으로 구분 하였고, 각 그룹당 8마리씩 할당하였다. 농축된 숙지양근탕 시료를 3차 증류수에 녹여 좌골신경 손상 후 8일간 실험군의 쥐들에게 각각의 농도별 로 1일 1회 구강 투여하였다.

정상군은 우측 둔부를 절개한 후 좌골신경의 손상없이 다시 봉합한 군(sham operation group, sham군)이며, 대조군은 좌골신경 압박손상 후 아 무런 처치를 하지 않은 군(sciatic nerve injury group, SNI군)이며, 실험군은 좌골신경 손상 후 숙지양근탕을 투여한 군으로서 숙지양근탕 추출 물을 증류수에 녹여 좌골신경 손상 후 8일간 각 각 100 mg/kg(SNI+100군), 200 mg/kg(SNI+200 군), 400 mg/kg(SNI+400군)을 투여하였다.

3) 시료의 준비

숙지양근탕의 한 첩당 내용 및 용량은 아래와 같다(Table I). 약제는 자생한방병원의 복정 원외 탕전원에서 구입한 것을 사용하였다. 숙지양근탕 에 1 L의 3차 증류수을 넣어 80 ℃에서 2시간 동 안 추출하였고, rotary evaporator(Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축하였다. 그리고 농축된 숙지양근탕을 24시간 동안 동결건조하여 22.81 g (회수율 28.51%)의 시료를 얻었다.

Herbal name Phamacognostic name Amount(g)

숙지황

Rehmanniae radix preparat

산약

Dioscorea Rhizoma

산수유

Corni Fructus

목단피

Moutan Cortex Radicis

백복령

Poria Cocos

택사

Alismatis Rhizoma

당귀

Angelicae Gigantis Radix

우슬

Acyranthes Radix

육계

Cinnamomi Cortex

부자

Aconiti Radix Lateralis Preparata

위령선

Clendtidis Radix

구기자

Lycii Fructus

백지

Angelicae Davuricae Radix

강활

Notoptergii Rhizoma

두충

Eucommiae Cortex

목과

Chaenomelis Fructus

백작약

Paeoniae Radix alba

감초

Glycyrrhizae Radix

Total amount 80

Table I. Composition of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n -ta ̄ ng) and Amount

2. 방법

1) 좌골신경 압박손상 유발 방법

Sham 그룹을 제외한 각 군의 쥐들은 Zoletile 50

(Virbac Laboratories, Carros, France)을 복강 에 주입(intraperitoneal injection)하여 마취시킨 후 우측 둔부의 근육과 대퇴 근육의 경계선을 절개하 였고, 좌골신경을 드러내어 surgical clip(pressure:

125 g; Fine Science Tool Inc., San Francisco, USA)으로 30초 동안 압박 손상을 가하였다.

Sham 그룹의 경우 Zoletile 50

을 복강에 주입하 여 마취시킨 후 우측 둔부의 근육과 대퇴 근육의 경계선 부위를 절개한 후 압박손상을 가하지 않 았다. 모든 그룹은 수술 후 1일 동안은 휴식을 취하게 한 후 실험을 수행하였다.

2) 좌골신경 기능지수(Sciatic Functional Index, SFI) 측정

좌골신경 손상 후 기능의 회복 정도를 평가하

기 위하여 손상 전, 손상 후 2일, 4일, 6일, 8일 째에 흰쥐의 족적을 이용한 좌골신경 기능지수를 측정하였다. 흰지의 족적은 쥐의 모든 발바닥에 검은색 잉크를 묻힌 후 하얀 종이가 깔린 통로 (80×7×10 cm

)를 걷도록 하여 측정되었다. 통로 의 진행방향 끝에는 암실을 제작하여 실험동물이 전방으로 진행될 수 있도록 유도하였다.

상해 받은 쪽 발의 발가락 펴짐 정도(experimental toe spread, ETS), 정상인 발의 발가락 펴짐 정도 (normal toe spread, NTS), 상해 받은 쪽 발의 프 린트된 발의 길이(experimental paw length, EPL), 정상인 발의 프린트된 발의 길이(normal paw length, NPL), 상해 받은 쪽의 두 번째 발가락에서 네 번째 발가락까지의 거리(exprrimental intermediary toe spread, EIT), 정상인 발의 두 번째 발가락에서 네 번째 발가락까지의 거리(normal intermediary toe spread, NIT)이라 정하고 각각을 측정하였으며, 이 들의 관계식을 통해 SFI를 구하였다(Fig. 1). 얻어진 SFI 값이 0이면 정상으로 판정하고, -100이면 좌골 신경의 기능이 완전히 상실했다는 것을 의미한다

.

Fig. 1. Sciatic functional index(SFI).

3) Plantar test

열 자극에 대한 통증 역치를 측정하기 위하여 Hargreaves method

를 이용하였다. 바닥이 투 명한 상자(12×11.5×14 cm) 위의 유리면에 쥐를 놓고 새로운 환경에 적응시키기 위하여 약 5분간 지켜 본 후에 아래쪽에서 우측 뒷발바닥에 적외선 을 조사하여 열 자극의 통증반응으로 뒷다리를 들 어 올리는 시간(paw withdrawal latency)을 plantar apparatus(Ugo Basile Biological Apparatus, Comero, Italy)로 측정하였다(Fig. 2). 예비실험에서 기본 반응시간이 20초가 되도록 광원의 강도를 조절하고 조직손상을 방지하기 위해 30초를 cut off time으 로 설정하였다.

Fig. 2. Plantar test.

4) 조직 처리

실험 8일 후 모든 쥐들은 Zoletile 50

로 마취

시킨 후 흉강을 열고 좌심실을 통하여 50 mM

phosphate buffer saline(PBS)를 5분간 주입하였

다. 이어서 100 mM의 phosphate buffer(PB)에

녹인 4% paraformaldehyde(PFA)용액을 4 ℃에

서 10분간 관류시킨 후 좌골신경을 적출하고, 4 ℃ 에서 4% PFA용액에 24시간 침전시켜 후 고정하였 다. 고정된 좌골신경 조직을 30% sucrose 용액에 3 일 간 침전시킨 후 freezing microtome(Leica, Nussloch, Germany)을 사용하여 15 μm의 두께 로 연속관상 절편을 제작하였다.

5) Neurofilament 면역형광 염색법

좌골신경 손상 후에 neurofilament 200 발현을 측정하기 위하여 neurofilament 200 면역형광 염 색법을 시행하였다. 좌골신경 조직은 그 후 0.5%

nonidet P-40이 함유된 PBS를 각 조직에 처리하 여 세포에 투과성을 높여주고, 항체와의 비특이적 결합을 막기 위해 PBST에 2.5% bovine serum albumin(BSA), 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후 anti-neurofilament 200 항체(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 처리하였다. 이 때 항체는 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 1:200에 비율로 혼합하여 처리한 후 4 ℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 첫 번째 항체의 반응이 끝난 후 PBST로 조직을 씻 어내고, 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 Fluorescein-goat anti-mouse 항체(Molecular probes, Eugene, OR, USA)를 1:100으로 혼합하여 암실에 서 1시간 30분 동안 처리하였다. 마지막으로 fluorescent mounting medium(Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA) 을 이용하여 마운팅하였다. 모든 조직 sample은 형 광현미경(Nikon Eclipse 50i, Nikon Inc., Melville, NY, USA)을 통해 관찰하였다.

6) Western blot analysis

좌골신경의 COX-2, iNOS, TNF-α 발현은 western

blotting 방법을 사용하여 분석하였다. 좌골신경 조직은 손상 부위의 원위부(distal) 쪽으로 1 cm 절제하였다. 절제된 좌골신경은 절제 즉시 -70 ℃ 에 보관하고, 냉동 보관되어 있던 좌골신경 조직 은 얼음위에서 균질화(homogenize)하여 50 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1%

Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EGTA, 1.5 mM MgCl

·6H

O, 1 mM sodium orthovanadate, 100 mM sodium flouride 함유한 lysis buffer에서 lysis하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad colorimetric protein assay kit(Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하였다. 30 μg의 단백질은 SDS-polyacrylamide gel의 전기영동에 사용되며, nitrocellulose membrane (Whatman GmbH, Dassel, Germany)으로 transfer 하였다. 항체와의 비특이적 결합을 막기 위해 5%

skim milk를 Tween-20이 포함된 tris-buffered saline(TBST) buffer에서 membrane을 1시간 동안 상온 반응 시키고 이 반응을 끝낸 membrane을 washing한 후 각각 COX-2(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), iNOS(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 TNF-α(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)에 대한 항체로 membrane을 washing하고 horseradish peroxidase 이 부착된 2차 항체(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 washing 하였다. Band detection은 enhanced chemiluminescence(ECL) detection kit(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 이용하여 측정하였 고, 단백질 발현은 Image-Pro Plus 7.0(Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA)의 프로그램을 사용하여 계산하였다.

3. 통계 처리

본 실험에서 얻은 자료는 SPSS(version 20.0)

통계프로그램을 이용하여 처리하였다. 측정치는 평균±표준편차로 표시하고 그룹 간 비교를 위하 여 one-way ANOVA분석과 Duncan's post hoc test를 실시하였다. 통계적 유의수준은 p<0.05로 설정하였다.

Ⅲ. 연구 결과

1. 좌골신경 기능지수(Sciatic functional index, SFI)의 변화

정상군과 비교해 좌골신경손상군은 SFI의 값 이 유의하게 감소되었다. 좌골신경 손상 4일 째 까지 좌골신경손상군과 모든 숙지양근탕 투여군 간에는 유의한 차이는 없었다. 6일 째부터 숙지 양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 좌골신경손 상군에 비해 SFI의 값이 유의하게 증가되었다 (Table Ⅱ, Fig. 3, 4).

Before 2days 4days 6days 8days Sham -11.14

±9.76

-13.55

±2.89

-10.62

±1.73 -9.28

±2.13

-10.15

±4.83 SNI -10.28

±2.88

-74.30

±2.81*

-71.01

±3.90*

-66.38

±3.80*

-63.46

±4.43*

SNI+100 -10.47

±2.67

-70.16

±1.72*

-67.40

±2.77*

-58.15

±3.72*

-49.75

±4.14*

SNI+200 -12.11

±4.31

-68.02

±3.92*

-64.96

±4.19*

-50.13

±5.93^† -38.61

±8.24*^† SNI+400 -10.41

±2.88

-67.42

±3.94*

-65.71

±4.79*

-48.07

±4.43^† -23.84

±5.64^† Before means before operation.

Values are represented as mean±SEM.

* p<0.05 compared to the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group(SNI).

Table Ⅱ. Effect of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

Fig. 3. Footprints of walking track on 8th day after causing sciatic crushed nerve injury.

Fig. 4. Effect of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

(○) Sham group

(●) sciatic nerve injury group

(□) sciatic nerve injury + ST 100 mg/kg treated group (■) sciatic nerve injury + ST 200 mg/kg treated group (▲) sciatic nerve injury + ST 400 mg/kg treated group Values are represented as mean±SEM.

* p<0.05 compared to the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group (SNI).

2. 열 통증 역치의 변화

열 자극에 대한 통증 역치는 정상군에서 24.41

±1.23 sec, 좌골신경손상군에서 11.98±1.68 sec, 좌골신경 손상+숙지양근탕 100, 200, 400 mg/kg 투여군에서 각각 16.65±1.04, 18.37±1.55, 18.22±1.20 sec로 나타났다. 정상군과 비교해 좌골신경손상 군은 열 통증 역치가 감소되었다. 숙지양근탕 100, 200, 400 mg/kg 투여군 모두에서는 좌골신경 손상 에 의해 감소된 열통증 역치가 증가되었다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

(A) Sham group

(B) Sciatic nerve injury group

(C) Sciatic nerve injury + ST 100 mg/kg treated group (D) Sciatic nerve injury + ST 200 mg/kg treated group (E) Sciatic nerve injury + ST 400 mg/kg treated group Values are represented as the mean±SEM.

* p<0.05 compared with the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group (SNI).

3. Neurofilament 밀도

좌골신경에서의 neurofilamnet 밀도는 정상군에 서 30.34±1.41 μm, 좌골신경손상군에서 17.48±0.56 μm, 좌골신경 손상+숙지양근탕 100, 200, 400 mg/kg 투여군에서 각각 17.95±0.32, 23.00±0.52, 27.88±0.86 μm로 나타났다.

정상군과 비교해 좌골신경손상군은 neurofilament 밀도가 유의하게 감소되었고, 숙지양근탕 200 mg/kg과 400 mg/kg 투여군에서 좌골신경 손상

에 의해 감소된 neurofilament 밀도가 유의하게 증가되었다(Fig. 6).

Fig. 6. Effect of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

Upper : Photomicrograph showing immunostaining for neurofilament in each group. The scale bar represents 50

μ

Lower : Optical density of neurofilament in the sciatic nerve

(A) Sham group

(B) Sciatic nerve injury group

(C) Sciatic nerve injury + ST 100 mg/kg treated group (D) Sciatic nerve injury + ST 200 mg/kg treated group (E) Sciatic nerve injury + ST 400 mg/kg treated group Values are represented as the mean±SEM.

* p<0.05 compared with the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group (SNI).

4. COX-2의 발현

본 연구에서 COX-2 발현량은 정상군의 COX-2

단백질 발현량을 1로 하여 계산되었다. 손상된

좌골신경에서에서의 COX-2 발현량은 좌골신경

손상군에서 3.03±0.48, 좌골신경 손상+숙지양근탕

100, 200, 400 mg/kg 투여군에서 각각 2.78±0.28, 2.13±0.15, 1.65±0.20로 나타났다. 정상군과 비교 해 좌골신경손상군은 COX-2 발현이 유의하게 증 가되었으며, 숙지양근탕 200 mg/kg과 400 mg/kg 투여군에서 좌골신경 손상에 의해 유도된 COX-2 발현이 유의하게 감소되었다(Fig. 7).

Fig. 7. Effect of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

(A) Sham group

(B) Sciatic nerve injury group

(C) Sciatic nerve injury + ST 100 mg/kg treated group (D) Sciatic nerve injury + ST 200 mg/kg treated group (E) Sciatic nerve injury + ST 400 mg/kg treated group Values are represented as the mean±SEM.

* p<0.05 compared with the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group (SNI).

5. iNOS의 발현

본 연구에서 iNOS 발현량은 정상군의 iNOS 단백질 발현량을 1로 하여 계산되었다. 손상된 좌골신경에서에서의 iNOS 발현량은 좌골신경손 상군에서 5.55±0.51, 좌골신경 손상+숙지양근탕 100, 200, 400 mg/kg 투여군에서 각각 4.25±0.42, 3.03±0.49, 3.06±0.48로 나타났다. 정상군과 비교

해 좌골신경손상군은 iNOS 발현이 유의하게 증 가되었으며, 숙지양근탕 투여군 모두에서 좌골신 경 손상에 의해 유도된 iNOS 발현이 유의하게 감소되었다(Fig. 8).

Fig. 8. Effect of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

(A) Sham group

(B) Sciatic nerve injury group

(C) Sciatic nerve injury + ST 100 mg/kg treated group (D) Sciatic nerve injury + ST 200 mg/kg treated group (E) Sciatic nerve injury + ST 400 mg/kg treated group Values are represented as the mean±SEM.

* p<0.05 compared with the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group (SNI).

6. TNF-α의 발현

본 연구에서 TNF-α 발현량은 정상군의 TNF-α

단백질 발현량을 1로 하여 계산되었다. 손상된

좌골신경에서에서의 TNF-α 발현량은 좌골신경손

상군에서 3.71±0.35, 좌골신경 손상+숙지양근탕

100, 200, 400 mg/kg 투여군에서 각각 3.40±0.32,

2.34±0.12, 2.26±0.09로 나타났다. 정상군과 비교

해 좌골신경손상군은 TNF-α 발현이 유의하게 증

가되었으며, 숙지양근탕 200 mg/kg과 400 mg/kg

투여군에서 좌골신경 손상에 의해 유도된 TNF-α 발현이 유의하게 감소되었다(Fig. 9).

Fig. 9. Effect of Sukjiyanggeun-Tang(shu

́ _d ˋ

ya ̌ _{ngj l} ̄ n-ta ̄ _ng)

(A) Sham group

(B) Sciatic nerve injury group

(C) Sciatic nerve injury + ST 100 mg/kg treated group (D) Sciatic nerve injury + ST 200 mg/kg treated group (E) Sciatic nerve injury + ST 400 mg/kg treated group Values are represented as the mean±SEM.

* p<0.05 compared with the sham group.

†p<0.05 compared to the sciatic nerve injury group (SNI).

Ⅳ. 고 찰

좌골신경은 하지의 운동 신경 중 두 번째로 잘 침범되는 신경이며, 쇄석위

및 좌위

에서 손 상이 잘 발생한다.

좌골신경 손상은 말초신경 손상의 범주에 속 하는 것으로 한의학적으로 痺症에 속한다. 대개 좌골신경의 기계적 압박으로 인해 발생하며 신경 의 분포에 따라 동통, 이상감각을 일으키고, 심하 며 근력저하, 근위축 등이 일어난다

.

말초신경은 재생이 거의 불가능한 것으로 알

려진 중추신경과는 달리 재생이 어느 정도 가능 하다

. 하지만 손상된 신경은 회복속도가 느리 고 말초 신경을 이루고 있는 축삭, 수초, 신경 내 외의 미세 혈관 및 결합조직 등 다양한 병태 생 리에 의해 후유증이 남기게 된다

.

좌골 신경 손상에 관한 한의학적 연구는 침과 같은 술기적인 것 뿐만 아니라 한약재, 처방 연 구 등과 같이 다양하게 이루어지고 있다

. 하 지만, 임상적으로 효과있는 경험 처방에 대한 연 구는 아직 보고가 없는 실정이다.

숙지양근탕(熟地養筋湯)은 아침기상시 통증을 호소하고 장요근 단축을 가진 추간판 탈출증이나 협착증으로 인한 신경병증을 호소하는 환자에게 효과가 좋았던 임상 경험 처방으로, 숙지황, 산 약, 산수유, 목단피, 백복령, 택사, 당귀, 우슬, 육 계, 부자, 위령선, 구기자, 백지, 강활, 두충, 목과, 백작약, 감초로 구성되어 있다. 약물 구성상 육미 지황탕에 가미한 처방으로 신허로 인해 근골격계 가 허약해지고 힘이 없는 것을 튼튼하게 하는 효 과가 있다고 알려져 있다. 숙지양근탕의 근간을 이루는 육미지황탕은 통용되는 처방으로, 여러 가지 효과에 대한 많은 보고가 있으나, 신경 손 상과 관련한 연구를 중심으로 살펴보면 근육 피 로회복 효과

, 사이토카인의 분비 저하 효과

, 손상된 좌골신경의 기능회복 효과

가 있다. 아 울러 가미된 약물들을 신경 손상과 관련한 신경 재생 및 소염, 진통 효과 등을 중심으로 고찰해 보면, 당귀와 우슬은 신경재생효과

가 있으며, 육계, 부자, 위령선, 구기자, 백지, 강활은 소염효 과 및 진통효과

가 있으며, 두충은 근위축억제 효과

가 있으며, 목과, 백작약, 감초는 면역증강 효과

가 있다.

이와 같이 숙지양근탕의 근간이 되는 처방과

가미된 약물들의 효과를 근거로 볼 때, 숙지양근

탕은 신경병증에 대해 소염 및 진통효과, 신경재

생 효과, 근위축억제효과, 면역증강효과가 있을 것으로 판단되며, 이에 숙지양근탕 추출물을 좌 골신경을 압박 손상시킨 흰쥐에 투여하여, 좌골 신경 기능의 회복, 신경 재생과 항염증 효과를 검증하고자 하였다.

본 연구에서 기능적 회복 평가를 위하여 좌골 신경 기능지수를 측정하였다. 흔히 좌골신경 기 능지수는 정상보행을 0%로 보았을 때 부족한 기 능의 비율을 나타낸 것이다

. 따라서 좌골신경 기능지수를 산출하는 것은 운동기능 효과를 평가 할 수 있는 객관적인 지표가 될 수 있을 뿐만 아 니라, 좌골신경지수의 평균값과 그 차이로 나타 나는 결과는 각 집단의 운동기능의 회복효과를 비교하는데 필요한 정보를 제공해준다. 좌골신경 손상 후 좌골신경손상군은 정상군과 비교해 유의 하게 낮은 SFI 값을 나타내었으며, 좌골신경 손 상 후 6일 째부터 8일 째까지 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 SFI 값의 유의한 증가가 나타났다. 이는 좌골신경 손상 후 숙지양근탕 추 출물 투여가 농도 의존적으로 좌골신경 손상에 의해 감소된 운동 기능을 증진시킨다는 것을 의 미한다.

말초신경이 손상된 경우 자발성 통증을 포함 하여 여러 형태의 기계적 혹은 열적 유해자극을 가했을 때 정상에 비해 통증을 강하게 느끼는 통 각과민과, 비유해자극인 낮은 강도의 기계적 혹은 열적 자극에 대해서도 통각으로 인식되는 이질통 증과 같은 통각과민 현상을 흔히 볼 수 있다

. 정상적인 염증반응은 손상된 신경을 제거하고 성 장인자들로 하여금 말초신경의 재생을 촉진하게 하지만, 한편으로 여러 가지 화학물질(chemokine) 이 축삭 이동(axonal transport)을 통해 신경세포 체로 전달되어 신경세포체를 흥분시킨다. 이들 염증성 화학물질들은 주변의 통각 수용체를 흥분 시켜 조직손상 없이 통증을 유발시키게 된다

.

Plantar test를 통한 열 자극에 대한 통증 역치 측정 실험에서 좌골신경 손상 후 좌골신경손상군 은 정상군과 비해 paw withdrawal latency가 유 의하게 감소되었으나, 숙지양근탕 100, 200, 그리 고 400 mg/kg 투여군 모두에서 좌골신경손상군 에 비해 paw withdrawal latency가 향상되었다.

이는 숙지양근탕 추출물이 좌골신경손상에 의해 서 발생되는 통증 역치 감소를 증진시킨다는 것 을 의미한다.

말초신경 세포의 손상 시 슈반세포(Schwann cell)은 축삭의 성장에 도움이 되는 신경 성장 인 자를 분비하며, 축삭돌기의 분화에 도움이 되는 물질이 합성하여, 손상된 신경의 자발적인 재생 에 상당한 역할을 한다

. 축삭 재생 단계는 가장 먼저 손상부위에서 슈반세포의 증식이 일어나고 슈반세포가 원위부로 이동하며 그 후 손상 부위 에서 축삭의 접촉이 발생하고 접촉 후 재생이 이 루어진다. 재생이 일어나는 원위부부터 미엘린 (myeline)을 형성하기 위해 슈반세포의 분화가 발생한다

. Neurofilament는 말초신경의 미엘린 초(myelin sheath)의 세포골격을 이루는 중요한 성분이며, 축삭재생에 지대한 영향을 미친다

. 본 연구에서 좌골신경 압박 손상 후 좌골신경의 조직학적인 변화를 관찰하기 위해 수행한 면역조 직형광법 결과, neurofilament 밀도는 좌골신경 손상군에서 유의하게 감소되었으며, 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 좌골신경손상군에 비해 neurofilament 밀도가 유의하게 증가되었다.

이는 숙지양근탕 추출물이 손상된 말초신경의 축 삭재생의 효과가 있는 것을 의미한다.

말초 신경 손상 후의 염증반응이 신경병성 통증

의 중요한 병태기전으로 밝혀지고 있으며, TNF-α

과 같은 사이토카인을 억제하는 약물을 발견하기

위한 연구가 시도되고 있다

. 특히 염증매개 물

질인 TNF-α, iNOS 및 COX-2 등은 급성 및 만성

염증 질환 발병에 중요한 역할을 담당하고 있다

55,56)

. 이에 본 연구는 좌골신경손상에서 신경의

염증관련인자인 COX-2, iNOS, TNF-α에 어떠한 영향을 주는지를 알아보았다.

COX는 arachidonic acid를 PGs로 전환하는 효 소로 COX-1과 COX-2로 분류되는데

, COX-1은 거 의 모든 조직에 발현되어 prostagrandin을 생산하 여 혈소판형성, 신장의 혈액 흐름을 조절하거나 위 장의 세포를 보호하는 등의 정상적인 생체기능을 조절한다

. COX-2는 prostaglandin-endoperoxide synthase 2(PTGS2) 유전자에 의해 인코딩되는 효소 로서

prostanoids인 prostaglandins, prostacyclin, thromboxanes 등을 생합성하여 염증기전에 핵심 적으로 관여한다. COX-2 발현은 통증과 밀접한 상관관계를 가지고 있으며, 특히 COX-2는 신경 병증 통증과 관련이 있다

. 또한 COX-2는 다 양한 말초신경손상 후에 슈반세포와 대식세포에 서 증가된다

. 본 연구에서 좌골신경 손상 후 좌 골신경손상군은 정상군에 비해 COX-2의 발현을 증가되었으나, 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여 군에서 COX-2의 발현이 유의하게 감소되었다.

염증반응의 지표물질인 NO는 L-arginine에서 NO synthase(NOS)에 의해 합성된다. NOS에는 endothelial NOS(eNOS), neuronal NOS(nNOS), inducible NOS(iNOS)의 세 가지 형태가 있으며, 이들 중 iNOS에 의한 NO 생성이 병리학적인 염 증 반응을 주로 담당한다

. 말초신경손상은 통 증에 주요하게 관여하는 대식세포와 슈반세포의 iNOS 발현을 증가시킨다

. 또한 iNOS는 왈러리 안 변성과 신경 재생에 있어서도 중요한 역할을 한다. 좌골신경 손상 후 좌골신경손상군은 정상 군에 비해 iNOS의 발현이 증가되었으나, 숙지양 근탕 100, 200, 그리고 400 mg/kg 투여군 모두에 서 iNOS의 발현이 유의하게 감소되었다.

염증의 주요 매개물질로써 잘 알려진 TNF-α는

in vivo 및 in vitro에서 염증반응을 조절한다.

TNF-α는 면역반응과 염증반응을 유도하는 염증 유도매개 사이토카인으로 단핵세포와 대식세포 에서 생산된다

TNF-α는 NF-κB의 활성을 유도 하며, 염증세포에서 염증 유발 주요인자인 사이 토카인의 생성을 증가시킨다

. 또한 TNF-α는 신경 병증 통증의 유발에 중요한 역할을 하는 사이토카 인으로 통증과 밀접한 상관관계가 있다

. 신경병 증에 관여된 염증반응은 TNF-α, interleukin-1(IL-1) 과 같은 염증 유발 주요인자 사이토카인의 생성 및 프로스타그란딘 생합성에 관여하는 COX-2의 발현이 증가함으로써 발생한다

. 본 연구에서 좌골신경 손상 후 좌골신경손상군은 정상군에 비 해 TNF-α의 발현이 증가되었으나, 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 TNF-α의 발현이 유 의하게 감소되었다

숙지양근탕 추출물은 좌골신경 손상에 의해 유도된 COX-2, iNOS 및 TNF-α의 발현을 억제시 켜, 만성적 통증의 발생과 좌골신경의 기능적 회 복에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주고 있다.

종합하자면, 숙지양근탕 추출물은 COX-2, iNOS, TNF-α의 발현을 억제시키고, neurofilament 밀도 를 증가시켰으며, 좌골신경지수의 개선과 열 자 극에 대한 통증 역치의 증가를 나타내었다. 이는 숙지양근탕이 좌골신경 손상 후에 좌골신경 손상 의 회복을 촉진시키고 통증을 감소시켜며 운동기 능을 회복시킨다는 것을 알 수 있었다.

Ⅴ. 결 론

숙지양근탕이 좌골신경 손상후 흰쥐의 기능

회복과 염증 억제에 미치는 영향을 관찰하기 위

해, 흰쥐의 좌골신경을 압박시킨 후 숙지양근탕

추출물을 투여한 결과는 다음과 같다.

1. 좌골신경 압박 손상으로 인해 저하된 SFI는 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 유 의하게 증가되었다.

2. 좌골신경 압박 손상으로 인해 감소된 통증 역치는 숙지양근탕 100, 200, 그리고 400 mg/kg 투여군 모두에서 유의하게 증가되 었다.

3. 좌골신경 압박 손상으로 인해 감소된 neurofilament의 밀도는 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 유의하게 증가되 었다.

4. 좌골신경 압박 손상으로 인해 증가된 COX-2, TNF-α의 발현은 숙지양근탕 200, 400 mg/kg 투여군에서 유의하게 감소되었다.

5. 좌골신경 압박 손상으로 인해 증가된 iNOS 의 발현은 숙지양근탕 100, 200, 그리고 400 mg/kg 투여군 모두에서 유의하게 감소되었 다.

숙지양근탕 추출물은 손상된 좌골신경의 축삭 재생을 촉진시키며, 염증 발현 매개인자를 억제 하여 통증 역치를 증가시켰으며, 좌골신경의 운 동 기능 회복을 촉진시키는 것을 알 수 있었다.

감사의 글

이 논문은 2012년도 가천대학교 교내연구비 지원에 의한 결과임.

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