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책임저자 : 최재영, 부산시 서구 암남동 34번지
602-702, 고신대학교 복음병원 외과 Tel: 051-990-6462, Fax: 051-246-6093 E-mail: okok001@daum.net
접수일：2010년 3월 18일, 게재승인일：2010년 7월 1일 본 논문은 2010년 고신대학교 의학부 연구비 일부를 지원 받았음.
유두상 갑상선암에서의 BRAF 변이와 임상병리학적 인자와의 관계
고신대학교 의과대학 외과학교실 김 정 훈ㆍ최 재 영
Relationship between BRAF Mutations in Papil- lary Thyroid Carcinomas and Clinicopathologic Factors
Jeong-Hoon Kim, M.D. and Jae-young Choi, M.D.
Purpose: Papillary thyroid carcinomas (PTCs) account for
about 80% of all thyroid cancers. B-Raf proto-oncogene serine/threonine-protein kinase (BRAF) transversion muta- tion T1796A is present in 29∼69% of PTCs, and is a po- tential prognostic marker for PTC as it may be associated with aggressive tumors. This study investigated the preva- lence of BRAF exon 15 T1796A in thyroid tissues obtained by a thyroidectomy, and correlation of the mutation with clinicopathological factors.Methods: One hundred nine PTC patients as determined
histologically by thyroidectomy between January 2007 and June 2009 were evaluated to detect T1796A in intra- operative fresh tissue. The mutation was sought in all specimens using DNA sequencing.Results: The mean patient age at surgery was 45.1 years
and tumors had a median tumor diameter of 11.4 mm. At the time of diagnosis, 28 of the 109 patients presented with some kind of extrathyroideal invasion of the tumor, and 48 had lymph node metastases. Sixty two patients were stages 1 or 2. There was no distant metastasis, A missense muta- tion was found at T1796A in exon 15 in 35 of the 109 (32%) PTCs. In patients with conventional papillary thyroid cancer, the BRAFV600E mutation was significantly associated with lymph node metastasis (P=0.024), high TNM stage (1 and 2 vs. 3 and 4, P=0.022), tumor size (P=0.01) and cap- sular invasion (P=0.033).Conclusion: The BRAF
V600E mutation is a poor prognostic factor independent from other clinicopathological features.(Korean J Endocrine Surg 2010;10:147-151)
Key Words: Papillary thyroid carcinoma, BRAF
V600E 중심 단어:유두상 갑상선암, BRAFV600EDepartment of Surgery, Kosin University College of Medicine, Busan, Korea
서 론
유두상 갑상선암은 갑상선암의 80% 이상을 차지하는 가 장 흔한 갑상선 암이며, 경부림프절 전이는 15%에서 60%
까지 보고되고 있다.(1) 5%에서만 원격전이가 있어서 천천 히 자라며 전이가 없는 유두상 갑상선암을 원격전이가 있 는 예후가 좋지 않는 경우와 구분하여 적극적인 치료를 할 수 있다면 과잉치료를 피할 수 있을 것이다.(2) 현재로는 영 상의학적 방법으로 수술 전에 림프절전이와 피막외 침범과 원격전이유무 등을 판단하여 절제범위를 결정하지만 수술 전에 예후를 판단하여 수술의 범위를 정하기에는 부족하 다.
최근 갑상선암의 발생과 관련된 종양유전자와 유전자 재 배열들이 밝혀졌다. Ras 암유전자 돌연변이는 갑상선종양 발생 초기에 관여하며, 악성종양과 양성종양 모두 비슷한 빈도로 발생하는 것으로 보고되고 있다.(3) RET/PTC 재배 열은 갑상선 유두암의 11∼40%에서 관찰되며,(4) p53 종양 억제유전자의 돌연변이는 미분화암인 역형성암의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.(5) Raf kinase는 세포의 성장 과 분화 그리고 증식에 관여하는 Ras, Raf, MAPK kinase, ERK/MAPK 신호경로의 중요 인자이다.(6) Raf kinase의 여 러 동종형 중 B type RAF (BRAF)는 MAPK 신호경로의 가 장 강력한 활성화체이며 이 유전자는 염색체 7번에 위치하 며, BRAF 돌연변이 중 가장 흔한 BRAFV600E은 BRAF 돌연 변이의 90%를 차지하며, gene의 exon 15의 1799 nucleotide가 thymine에서 adenine으로의 치환이 밝혀졌다.(7) BRAFV600E 변 이는 성인 유두상 갑상선암에서 특히 흔하며, 보고자에 따 라 30∼70% 정도 발현된다.(7-10) 또한 BRAFV600E 변이는 악성흑색종에서 60% 정도 발현되나, 그외의 종양에서는 발 현이 낮다.(11)
이에 저자는 본원에서 유두상 갑상선암으로 수술을 시행
Fig. 1. T1799A in papillary thyroid carcinoma.
한 환자의 갑상선조직에서 추출한 유전자에서 BRAFV600E 변이 빈도를 알아보고, BRAFV600E 변이 여부가 나이, 성별, 하시모토 갑상선염동반, 크기, 피막외 침범, 림프절전이, 병 기, 술후 조직검사에서의 림프혈관침범 등의 인자와 연관 성이 있는지를 알아보기 위해 본 연구를 시행하였다.
방 법
2007년 1월부터 2009년 4월까지 고신대학교 복음병원 외 과에서 유두상갑상선암으로 갑상선절제술을 받은 환자 109예를 대상으로 연구를 시행하였다.
1) DNA 추출
갑상선절제술로 검체가 보관된 환자의 조직으로부터 DNA는 10μm 두께로 자른 파라핀 포매된 종양조직에서 QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였다.
2) 증폭
2 X concentrated HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Hilden, Germany) 10μl, MgCl2 3 mM, each primer pairs 0.3μM, de- oxynucleotide triphosphate 400μM 혼합물에 DNA 50 ng을 첨가하여 증폭반응을 시행하였다. Braf exon 15를 증폭시키 기 위한 PCR primer는 다음과 같다. Exon 15, F: 5'-atgcttgctctga- taggaaaatga, R: 5'-agcagcatctcagggcca. PCR 반응은 94°C에서 30초, 58°C 30초, 72°C 45초간 35회 반복 수행하였고, 72°C 에서 10분간 마지막으로 extension을 하였다. 증폭된 검체는 QIAgen gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하 였다.
3) Direct sequencing
2% agarogel에 전기영동하여 그 절편을 QIAgen gel ex- traction kit (Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 정제된 산물은 형광 표지된 ddNTP (BigDye3.1, applied biosystems,Foster City, CA)를 사용하여 증폭하였으며 증폭 후 ethanol을 이용
하여 정제하였다. 정제 산물을 HiDi-Formamide 10μl에 용 해 후 ABI PRISM 3100 automated capillary DNA sequencer로 분석하였다.
4) 임상 예후인자 조사
환자의 임상조직학적 인자는 후향적으로 의무기록을 검 토하였으며, 병기는 AJCC (American Joint Committee on Cancer Recommendations) 기준에 따랐다.
5) 통계처리
자료의 분석은 SPSS (version 16.0)를 이용하여, 교차분석 을 하였으며, P＜0.05일 때 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
갑상선 암에서 BRAFV600E 변이의 확인은 DNA sequencing 을 통하여 exon 15의 1799번 염기에서 thymine이 adenine으 로의 치환을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
본연구 대상의 평균연령은 45.1세였다. 남자가 22예, 여 자가 87예였으며, 하시모토갑상선염과 동반된 경우가 13예 (11.9%)였다. 림프절전이는 48예(44%)였으며, 피막외 침범 은 28예(25.7%)였다. 종양의 평균 크기는 11.4 mm였고, 곽 청된 림프절의 평균개수는 13.6개였다. BRAFV600E 변이 양 성군은 35예(32.1%)였다.
BRAFV600E 변이와 나이에 따른 분석에서 45세 미만은 53 예, 45세 이상은 56예였으며, 각각 BRAFV600E 변이율이 20예 (37.7%), 15예(26.8%)로 통계학적인 유의성이 없었고, 성별 에 따른 BRAFV600E 변이율 역시 남자가 22예 중에 8예 (36.4%), 여자는 87예 중에 27예(31%)로 통계학적으로 유의 성이 없었다(Table 1). 하시모토갑상선염과 동반된 유두상 암의 BRAFV600E 변이율은 1예(7.7%)이고, 동반되지 않은 경 우는 34예(35.4%)로 하시모토갑상선염이 동반된 경우에 변 이율이 낮았으나 통계학적인 유의성은 없었고(P=0.058) (Table 1), 수술 후의 조직검사에서 림프혈관침범이 있는 예 에서 BRAFV600E 변이율이 8예(38.1%)고, 림프혈관침범이 없
Mutation of BRAFV600E
P value Positive Negative
N % N % Age
＜45 yr 20 37.7 33 62.3 0.305
≥45 yr 15 26.8 41 73.2
Gender
Male 8 36.4 14 63.6 0.620
Female 27 31 60 69
Tumor size
＜1 cm 12 18.2 54 81.8 ＜0.001
≥1 cm 23 53.5 20 46.5
Perithyroidal extension
No 21 25.9 60 74.1 0.033
Yes 14 50 14 50
Nodal metastasis
No 14 23 47 77 0.024
Yes 21 43.8 27 56.3
Stage
Stage I & II 14 22.6 48 77.4 0.022 Stage III & IV 21 44.7 26 55.3
Hahimoto’s thyroiditis
Not combined 1 7.7 12 92.3 0.058
Combined 34 35.4 62 64.5
Table 1. BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinomas and various clinicopathological factors
는 예에서는 26예(32.1%)로 통계학적인 유의성이 없었다 (Table 1). 크기, 피막외 침범과 림프절전이는 모두
BRAFV600E 변이율과 상관관계가 있었는데, 종양의 크기에
따른 분류에서 10 mm 이하는 66예, 그보다 큰 경우는 43예 였으며, 각각 BRAFV600E 변이율은 12예(18.2%), 23예(53.5%) 이였고(P＜0.01), 피막외 침범이 없는 81예 중에서 21예 (25.9%)에서 BRAFV600E 변이가 있었으며, 피막외 침범이 있 는 28예에서는 14예(50%)의 변이가 있었고(P=0.033), 경부 에 림프절 전이가 있는 48예 중에서 21예(43.8%)가 BRAFV600E 변이가 있었으며, 림프절전이가 없는 61예 중에서 14예 (23%)에서 변이가 있었다(P=0.024) (Table 1). AJCC 에 따른 병기에 따른 BRAFV600E 변이율은 각각 1기와 2기 중에서 14 예(22.6%), 3기와 4기 중에서 21예(44.7%)로 통계적으로 유 의하였다(P=0.022) (Table 1).
유두상 갑상선 미세암인 66예의 BRAFV600E 변이는 모든 임상병리학적 특징 및 예후인자와 상관관계가 없었다.
고 찰
유두상갑상선암은 사망률이 낮은 매우 양호한 예후를 보 이며 발생 빈도가 드물고 임상적으로도 비교적 양성의 경 과를 보이기 때문에 치료적인 방법의 선택에 있어서 외과
의사에 따른 이견이 많다. 그러나 소수의 환자에서 국소재 발과 원격 전이로 인해 치명적인 결과를 초래할 수 있어 잠재적인 완치를 목표로 적절한 치료범위를 결정하여야 한 다. 재발이나 생존율에서 고위험군이나 저위험군과 관련된 위험도 단계별 체계로써 AGES (age, tumor grade, extent of disease, size), AMES (age, distant metastasis, extent of primary tumor, size), MACIS (metastasis, age, completeness of re- section, invasion, size)등을 이용하여 최선의 치료방법을 찾 으려는 시도는 계속되고 있다.(12-14) 하지만 이런 노력들 은 후향적인 통계의 결과로써 유전적인 변이를 발견함으로 써 예후를 판단하는 연구는 흔하지 않으나 최근 BRAFV600E 변이가 유두상 갑상선암에 흔하다는 것이 알려졌다.
BRAFV600E 변이가 있는 유두상 갑상선암은 임상적으로 더
공격적인 것으로 알려져, BRAFV600E 변이와 갑상선암의 예 후인자에 관한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
갑상선암에서 다수의 유전적 변이가 증명되어있는데, 초 기 발견된 발암성 변화 가운데 RET/PTC 재배열이 그 중 하 나이다. RET/PTC 재배열은 소아와 전리방사선 유도 유두 상갑상선암에서 높은 빈도로 나타난다.(4) Ras 종양유전자 의 점돌연변이는 성인에서 산발형 유두암에서 10∼20%의 빈도로 발현이 된다.(3)
본 연구에서 BRAFV600E 변이를 유두상갑상선암의 경우에 서만 조사하였으나, 다른 연구에서 갑상선 여포암이나 양 성 갑상선 선종에서 BRAFV600E 변이가 관찰되지 않는 것을 보고하였다.(15-18) 이처럼 BRAFV600E 변이는 산발형 갑상 선 유두암에서 가장 흔히 발견되는 유전적 이상소견이며 갑상선 유두암에서 29∼69% 정도의 빈도로 보고되고 있 다.(7,8) 갑상선 유두암은 갑상선암의 약 80%를 차지하는 갑상선암 중에 가장 흔한 종양이므로, 갑상선종양 중 유두 암이 의심될 경우 BRAFV600E 변이가 감별진단에 도움이 될 것으로 생각된다. 본 연구에서는 유두암 109예 중 35예 (32.1%)에서 양성을 보였다. 국내에서 시행한 나 등(19)의 연구에서는 갑상선 유두암 30예 중 21예(70%)에서 양성을 보여 본 연구보다는 높은 빈도의 BRAFV600E 변이를 보고하 였다. 본 연구에서 유두암 중 5예는 여포성변종(papllary car- cinoma with follicular variant)였고 이들 중 3예에서 BRAFV600E 변이가 양성이었는데 유두암의 아형에서도 BRAFV600E 변이 가 발현됨을 알 수 있었다.
유두상갑상선암과 BRAFV600E 변이 사이에서 관련이 있는 인자는 Frasca 등(7)의 연구에서는 갑상선외 침윤, 크기 그 리고 림프절 전이였고, Kevevew 등(8)의 연구에서는 BRAFV600E 변이와 관련이 있는 인자는 나이, 병기, 림프절전이, 국소재 발, 원격전이였다. 본 연구에서 BRAFV600E 변이와 갑상선 유 두암에서 관련이 있는 인자는 종양의 크기(10 mm 기준), 림 프절 전이, 갑상선외 침윤과 병기였으며, 예후인자와 연관 이 있는 상기 보고와 비교하여 갑상선외침윤과 림프절전이 가 일치한다. 그러나 Puxeddu 등(20)의 연구에서는 갑상선
유두암에서 나이, 성별, 암종의 크기, 갑상선외 침윤, 림프 절 전이 그리고 병기와 BRAFV600E 변이 사이에는 관련이 없 는 것으로 나타났으나 예후인자와 연관이 있다는 보고가 더 많다. 국내 연구인 나 등(19)의 연구에서도 나이, 성별, 암종의 크기, 갑상선외 침윤, 림프절 전이 그리고 병기와
BRAFV600E 변이 사이에 차이를 발견할 수 없다고 보고하였
다. 이런 상반된 결과에 대한 원인은 아직 밝혀져 있지 않 다. BRAFV600E 변이는 종양의 공격성 뿐만 아니라 높은 재 발율과도 관련이 높다고 한다. Xing 등(21)과 Lee 등(22)은
BRAFV600E 변이가 있는 군에서 없는 군보다 수술 후 재발율
이 유의하게 차이가 나는 것을 보고하였다.
본 연구에서는 유두상 갑상선 미세암과 예후인자와의 통 계학적 유의성이 없는 것으로 나왔으나, Xing(23)의 유두상 갑상선 미세암의 BRAF 변이에 대한 보고에서 유두상 갑상 선 미세암의 경우에 30%정도의 변이를 보이며, 갑상선외 침윤, 림프절전이, TNM병기와 연관이 있으므로 BRAF 변 이가 있는 유두상 갑상선 미세암의 경우에 적극적으로 치 료할것을 권하고 있다.
본 연구와 마찬가지로 장기간 추적하여 BRAF변이와 재 발및 사망률과의 관계를 보고한 연구는 없으며, 향후 BRAF 변이와 재발 및 사망률을 장기간의 추적해야 할 것으로 생 각된다.
결론적으로 본 연구에서 BRAFV600E 변이와 갑상선 유두 암에서 관련이 있는 인자로는 종양의 크기(1 cm 기준)가 큰 경우, 림프절 전이나 갑상선외 침윤이 있는 경우와 병기가 III과 IV일 경우였다. 이와 같이 BRAFV600E 변이와 예후인자 의 관계를 볼 때 향후 세침흡인검사 검체의 유전자변이 연 구 등의 적극적인 연구를 통하여 수술 전에 예후를 판단하 고 수술범위를 결정하는데 도움이 될 수 있을 것으로 생각 된다.
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