Effects of Acute Oral Adminstration of Bispenol A on the Immune Function in Mice

약학회 지 제 45 권 제 1 호 55~63(2001) Yakhak Hoeji Vol. 45, No. 1

Bisphenol A

표 명 윤 # • 변 정 아 숙명여자대학교 약학대학

(Received October 4, 2000; Revised November 7，2000)

Effects of Acute Oral Administration of Bisphenol A on the Immune Function in Mice

Myoung-Yun Pyo and Jung-A Byun

College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, Seoul 140-742’ Korea

Abstracts - In order to investigate the effects of bisphenol A (BPA) on immune system in mice we exam­

ined the various immunological parameters. After single oral administration of BPA to female ICR mice, the weights of bodies and lymphoid organs, splenic cellularity and hematological parameters were examined on day 2 and 7. Among them WBC and splenic cellularity were slightly decreased on day 2. To assess the effects of BPA on humoral immune responses, splenic IgM plaque forming cell (PFC) and serum IgM were assayed.

When BPA was administered after immunization with SRBC, but not before immunization, IgM PFC against SRBC was significantly lowered in a dose dependent manner. Serum IgM level was also decreased on day 4 when high dose (2000 mg/kg) of BPA was administrated after injection of OVA-antigen. The indexes of splenocyte proliferation (SP) to concanavalin A (Con A) and bacterial lipopolysaccharide (LPS) were mea­

sured in vitro by MTT assay. At low concentration BPA slightly increased splenocyte proliferation but at higher concentration it showed significant inhibitory effects on cell proliferation. Mitogen-stimulated SP was also determined with spleen cells from BPA treated mice. Con A-induced SP was slightly decreased and LPS-induced SP was especially inhibited at 1000 mg/kg and 2000 mg/kg of BPA. These results indicate that BPA is able to acutly evoke humoral and cell mediated immune suppression in mice.

Keywords □ Bisphenol A, IgM PFC, serum IgM, splenocyte proliferation

Bisphenol A(4，4’-isopropylidene邮 henol) 는 식료품 의 캔，병마개, 식품포장재, 치과용 수지 등에 주로 사 용되는 epoxy resin과 polycarbonates 생산에 이용되 는 monomer이다. 이와 같은 목적으로 사용되고 있는 epoxy resin 이나 polycarbonate plastic 에서 bisphenol A가 유리된다고 보고1-31되고 있어 인체에 노출되었을 때의 안전성 문제가 대두되고 있다.

Bisphenol A는 햄스터 배아세포에 농도별로 처리시 50 |oM이상의 농도에서 DNA adduct 형성 및 세포의 형질 변환을 일으킨다고 보고4>되어 있으며，고농도에

# 본 논문에 관한 문의는 이 저자에게로 (전화) 02-710-9573 (팩스) 02-710-9573

서 배자독성이 관찰5찍고 MCF-7 암세포주 배양시험 에서는 estrogenic activity가 즉정1벽어 내분비계 장 애물질로 거론되고 있다. 또한, 내분비계 장애물질이 야생동물이나 인류의 생식, 정신기능의 장에와 교란을 유발할 뿐 아니라 면역기능장애도 일으킬 수 있다고 지적되는데, 그 예로서 methoxychlor, kepone, DDT, diethylstilbestrol 등이 estrogenic activity-1 - 나타내고 체액성과 세포성 면역계를 억제하거나 암이나 감염에 대한 저항력을 감소시킨다고 보고6> 되고 있다. Jontell, M. 등7>은 in wYro에서 purified T-lymphocytes와 비 장세포의 mitogen(Con A)으로 유도되는 증식능에 대 하여 실험한 결과 bisphenol A는 저용량에서는 면역 반응을 항진시키고 고용량에서는 면역반응을 억제한다

56 표명윤 • 변정아

고 보고하여 bisphenol A가 면역계에 변화를 유발시 킬 수 있음을 시사해 주고 있다. 그러나 bisphenol A 의 발암성이나 유전독성 및 생식독성 둥에 대한 연구 에 비해 생체내에서의 면역독성에 대한 연구는 많이 보고되지 않고 있다. 그러므로 본 연구에서는 bisphenol A를 일차적으로 급성노출시킨 후，면역병리, IgM 용형반 형성세포수，혈중 IgM 항체, 임파구 중식 능을 측정하여 미우스의 면역기능에 미치는 영향을 연 구하였다.

실험물질의 조제 및투여

BPA를 투여직전에 com oil에 현탁시켰으며,5) 예비 실험에서 관찰한 LD50(5.2g/kg，마우스，po)와 NOAEL (50 mg/kg)을 기준으로 투여용량을 산정하여 500(저용 량), 1000, 2000 mg/kg(고용량)을 1희 경구투여 급성 노출시켰다. 양성대조물질인 cyclophosphamide(CY)도 투여직전 주사용 생리식염수에 용해하여 LD508)의 약 10%에 해당하는 50 mg/kg을 복강내에 1회 주사하였 으며, 대조군에는 corn oil을 1회 경구 투여하였다.

실험방법

시약 및기기

실험물질로는 bisphenol A(BPA, Aldrich) 와 cy- clophosphamide(CY, Alkyloxan(주) 중외제약)을 사용 하였고, 시약으로는 Sigma 제품인 sod. pyruvate, ovalbumin, complete Freund's Adjuvant(CFA), albu- min-bovine(BSA), anti-mouse IgM alkaline phosp­

hatase conjugate(|x chain specific), sodium azide (NaN3), disodium p-nitrophenyl phosphate(NPP), DMSO, concanavalin A(Con A), lipopolysaccharides (LPS), MTT(3-4,5,-Dimethythiazol-2-yl]-2,5-dipheny- ltetrazoliumbromide: Thiazolyl blue), trypan blue, Gibco 제품인 HBSS medium, sod. bicarbonate, guinea pig complement, RPMI medium 1640 powder, fetal bovine serum(FBS), HEPES, MEM- non-essential amino acid, Antibiotic-antimycotic agent, Wako 제품인 2-mercaptoethanol 등을 사용하 였으며, 그외의 시약은 모두 세포배양용 또는 특급을 사용하였다.

기기로는 C02 incubator(NAPCO, precision scien­

tific Inc.), Coulter counter(T-890, Coulter), Micro- titer plate reader(Dynatech MR5000) 등을 사용하

였다.

실험동물

3~4주령인 ICR계 암컷 미우스를 유한 양행 중앙연 구소로부터 분양받아 고형사료와 물을 자유롭게 공급 하면서 실험동물실에 적응시킨 후 , 건강상태가 양호한 6~8주령 (23±2g)의 마우스를 실험에 사용하였다. 실 험동물실의 온도는 21~240C, 습도는 40~60%로 유 지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.

면역병리학적 실험

체중변화 및 면역장기무게 측정 - 체중측정하기 16시 간 전부터 물 I: 자귀롭게 공급하면서 절식시킨 후 체중 을 측정하였으며，체중변회율은 실험일의 체중을 실험 물질 투여시의 체중에 대한 백분율(%)로 나타내었다. 또 한, 장기무게변화는 실험일에 경추탈골로 치사시킨 실 험동물의 간장, 비장, 신장，흉선을 적출하여 각각의 무 게를 실험일의 체중에 대한 백분율(%)로 나타내었다.

혈액학적 측정 -실험군과 대조군의 안정맥총에서 heparinized capillary(Chase instruments Co.) S . 채 혈하여 EDTA(K3)가 들어있는 시험관(Sherwood medical) 에 취하고 roll mixer로 혼화한 후 WBC (white blood cell), RBC(red lood cell), HGB(hemo- globin), HCT(hematocrit), MCV(mean corpuscular volume), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration), PLT(platelet) 를 Coulter counter 로 즉정하였다.

Coulter counter는 시용 전에 4C plus® 액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, PLT값을 표준용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.

비장세포수 측정 - 실험물질 투여 후 실험일에 실험 동물의 비장을 적출하여 빙냉의 HBSS에 넣고 teflon pestle을 이용하여 100 mesh stainless sieve를 통과 시켜 비장세포액을 만들었다. 이 세포액에 RBC lysis buffer를 가한 후 원심분리 (1000 rpm, 10 min, 4°C) 하여 적혈구를 용혈시킨 후 상등액을 제거하고 침전된 비장세포에 일정량의 HBSS용액을 가한 후 Turk’s solution으로 염색하여 Hematocytometer로 비장세포 수를 측정하였다.

비장세포중의 IgM 용혈반 생성 세포수 측정 면역 및 실험물질 투여 - 일차면역에서 비장세포의

Bisphenol A 의 급성노출이 마우스의 면역기능에 미치는 영향 57

IgM항체 생성세포수(plaque forming ce ll: PFC)를 측정하기 위한 항원으로 한국유니온랩에서 구입한 면 양적혈구 (sheep red blood ce ll: SRBC)를 40C에 보 관하며 3주이내에 사용하였다. 사용직전 PBS용액으 로 3회 원심세척 (2500 rpm, 5 min, 4°C)한 早 , SRBC농도가 2 X 109 cells/m/가 되도록 PBS용액으로 조정하였으며, 이 부유액 0.2 m/(4x 108 cells)을 면 역일(day 0)에 모든 실험동물의 복강내에 주사하였고，

BPA와 C m 농도별로 면역 2일 전 또는 2일 후에 투여하였다.

비장세포액의 조제 - 면역일 (day 0)로부터 4일 후에 모든 실험동물군의 비장을 적출하며 빙냉의 HBSS에 넣고 teflon pestle을 이용하여 100 mesh stainless sieve를 통과시켜 비장세포액을 만들었다. 이 세포액 에 RBC lysis buffer를 가한 후 원심분리 (1000 rpm, 10 min, 40C)하여 적혈구를 용혈시킨 후 상등액을 제거하고 침전된 비장세포에 일정량의 HBSS용액을 가하여 viable cell을 trypan blue exclusion method19) 로 측정하여 2 X 106 cells/m/의 비장세포 현탁액을 만들었다.

면양적혈구액의 조제 - 40C에 보관된 SRBC를 사용 직전에 HBSS용액으로 3회 원심세척(2500 ipm, 5 min, 4°C)한 후 5X109 cells/m/의 농도로 부유시켰다.

항체 생성 세포수의 측정 -Cunningham의 방법9;을 약간 변형시킨 방법1011: 이용하여 IgM PFC수를 측정 하였다. SRBC부유액(5X109 cells/m/) 0.5 ml, guinea pig complement 0.3 ml, 10% FBS-HBSS 용액 2.0 m/를 혼합한 액 50 m/와 비장세포 현탁액(2X106 cells/m/) 50 (i/를 혼합하여 microchamber■에 35 씩 주입하고, vaseline과 paraffin(l: 1)혼액으로 밀봉하여 370C에서 1시간 방치한 후 형성되는 용혈반 생성 세 포수를 현미경하에서 측정하였다. 측정된 PFC수를 비 장세포 106개중의 항체생성 세포수로 환산하여 나타내 었다.

혈중 IgM 항체 생성능 측정

면역 및 실험물질 투여 - 항원인 ovalbumin(OVA)을 PBS용액에 용해시키고 동량의 complete Freund's Adjuvant와 혼합한 액 0.1 m/(20 ng/미우스)를 마우 스의 복강내에 주사하였으며 실험물질인 BPA와 CY는 면역 2일전 또는 2일 후에 투여하였다.

항혈청 분리 - 항원주사 후 4일 또는 7일째 실험동

물의 안정맥총에서 heparin 처리되지 않은 모세관으로 채혈하고, 37°C에서 2시간 방치하여 응고시킨 후 원심 분리 (3200 rpm, 15 min, 40C)하여 혈청을 취하며 실 험하기 전까지 -20°C에서 보관하였다.

IgM 항체 측정 - 혈중의 OVA에 대한 IgM항체를 enzyme-linked immunosorbent assay11’12)로 즉정하 였다. 0.02% NaN3를 함유한 PBS용액 (PBS-N)에 용 해시킨 OVA액 100 |ji(100 ^g/well)을 microplate (Greiner)의 각 well에 가하여 4°C에서 하룻밤 방치하 여 도포한 후 액을 제거하고 PBS-N으로 3회 세척하 였다. 모든 세척과정은 이와 동일하게 행하였다. BSA l g 을 PBS-N용액 100m/에 용해시킨 blocking buffer 를 각 well에 150 |i/씩 가하여 37°C에서 30분간 방치 한 후 세척하였다. 각 실험동물의 혈청을 dilution buffer(0.1% BSA와 0.05% Tween 20이 함유된 PBS-N)로 희석하여 각 well당 1001-1/씩 가한 다음 37°C에서 2시간동안 방치한 후 , 혈청을 제거하고 세척 하였다. Dilution buffer로 500배 희석한 anti-mouse IgM alkaline phosphatase conjugate 를 각 well 에 100 야씩 가하여 37°C에서 1시간 방치시킨 후 기질용 액 (p-nitrophenyl phosphate) 100 |j//well를 가하여 37°C 에서 30분 경과 후 microplate reader로 각 well의 optical density(ᄋ.D., 405 nm)를 즉정하고 대 조군의 흡광도와 비교하였다.

Mitogen에 의한 임파구 증식능 측정

In vitro 심험 - 마 ^ 의 비장을 무균적으로 적출하 여 빙냉의 RPMI 배지에 넣고 teflon pestle을 이용 하여 100 mesh stainless sieve를 통과시켜 단일 세 포액을 만들었다. RBC lysis buffer를 가하고 원심분 리 (1000 rpm, 10 min, 4°C)하여 적혈구를 용혈시킨 후 상등액을 제거하였고，8X106 cells/ml이 되도록 RPMI배지로 조정하여 비장세포액을 만들었다. 96 well flat bottomed microplate(Greiner) 의 각 well에 비장세포액 50 |i/(4 x 105 cells/well)와 BPA의 최종농 도가 lx io "* , 5X 10~5, 2.5X10-5, lx 10-5, 5XKT6，

2.5 x KT6 M이 되도록 BPA용액을 100 야씩 가하였으 며，mitogen의 농도를 예비실험으로 정하여 Con A 50 m/(2 |a^m/) 또는 LPS 50 |i/(50 를 가하 여 48시간 동안 배양(37°C, 5% C O J하였다. 배양후 MTT용액 (5 mg/m/)을 well당 50 |a/(250 ng/well))씩 가하고 4시간동안 더 배양한 후 원심분리 (2500 rpm,

58 표명윤 • 변정아

5 min, 40C)하여 상등액을 제거하고 DMSQ원액을 각 well에 50 여씩 가하여 10분이내에 ELISA reader로 흡광도(570 nm)를 측정하였다.

In vivo 십험 - 실험물질인 BPA를 농도별로 투여한 후 2일 또는 7일째에 미우스의 비장을 무균적으로 적 출하여 전항의 in wYro실험과 동일한 방법으로 만든 비장세포액(4X106 cells/m/) 100 |i/와 Con A(2 [ig/

ml) 또는 LPS(50 나g/m/)를 100 \il 가한 후 48시간 동안 배양하여 전항과 동일하게 MTT assay로 mitogen에 대한 임피구 중식능을 즉정하였다.

통계학적 처리

각 실험군의 측정값의 평균과 표준편차를 구하고, 대 조군과의 차이를 Students West를 이용히여 유의성을 검정하였다.

실험결고h 및 고찰

체중 및 면역장기 무게에 미치는영향

Bisphenol A를 500, 1000, 2000 mg/kg 용량으로 1회 경구투여하며 급성 노출시키고, 양성대조물질인 cyclophosphamide을 50 mg/kg용량으로 복강내 주사 한 후 2일과 7일째에 체중과 면역장기무게를 측정하 여 실험물질 투여일의 체중을 기준으로 하여 실험일의 체중증가만을 관찰하고 실험일의 체중에 대한 백분율

로 면역장기무게변화를 나타낸 결과는 Table I과 같다.

양성대조물질인 CY투여로는 2일째 체중, 체중에 대한 흉선과 비장의 중량비가 대조군에 비하여 유의성있게 감소되어 Turk 등13>의 보고와 유사하였다. 그러나 BPA에 의해서는 간장의 중량비가 다소 중가되는 경향 을 보였을 뿐 체중 및 다른 장기 무게에는 큰 변화를 보이지 않았다. 이로써 BPA의 급성투여에서는 고용량 에서도 체중 및 간장이외의 면역장기무게에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보인다.

혈액학적 parametei■에 미치는 영향

BPA를 500, 1000, 2000 mg/kg 용량으로 1회 경 구투여하여 급성 노출시키고，양성대조물질인 C g 50 mg/kg용량으로 복강내에 주사한 후 2일과 7일째에 순 환말초혈관내의 혈액학적 성상을 분석한 결과를 Table II에 나타내었다. 본 실험에서 실험물질을 투여하지 않 은 대조군의 혈액학적 분석결과는 Guest 등 14비 본 실험방법과 동일한 방법으로 분석한 결과와 거의 일치 하였다. CY처리 우스의 WBC수는 투여 후 2일째에 대조군에 비해 23.7%정도 유의성있게 감소되어 Turk 등135이 보고한 바와 비슷하게 독성이 나타났다. 또한, BPA에 의해서도 CY와 마찬가지로 투여 후 2일째에 용량에 무관하게 백혈구 수가 대조군에 비해 16.4%정 도 유의성있게 감소되었다. 그러나 실험물질 투여 후 7일째에는 백혈구 수도 대조군과 유사하게 나타나 투

Table I - Changes of body- and organ-weight in mice administered bisphenol A Exp. group

(mg/kg)

Body (%)

Spleen (%)

Thymus (%)

Kidney (%)

Liver (%) day 2

Control 6.02 ± 1.83 0.44 ± 0.03 0.33 ± 0.03 1.24 ± 0.04 5.04 ± 0.28 CY50 3.00 ± 1.76* 0.30 ± 0.05** 0.21 ± 0.02** 1.31 ± 0.48* 5.3 ± 01.96 BPA500 5.59 ± 2.64 0.42 ± 0.09 0.32 ± 0.02 1.32 ± 0.48* 5.33 ± 2.12*

BPA1000 5.65 ± 2.40 0.42 ± 0.07 0.31 ± 0.02 1.36 ± 0.48* 5.73 ± 2.16*

BPA2000 5.67 ± 1.49 0.40 土 0.13 0.31 ± 0.12 1.30 ± 0.47 5.69 ± 2.01**

day 7

Control 21.05 ± 0.46 0.35 ± 0.04 0.24 ± 0.01 1.26 ± 0.12 4.70 ± 0.27 CY50 19.08 ± 3.06 0.45 ± 0.01* 0.26 ± 0.01 1.25 ± 0.06 4.87 ± 0.09 BPA500 20.14 ± 5.74 0.44 ± 0.01* 0.22 ± 0.01 1.26 ± 0.04 4.99 ± 0.07 BPA1000 19.24 ± 1.70 0.32 ± 0.01 0.25 ± 0.01 1.16 ± 0.10 5.19 ± 0.16*

BPA2000 18.79 ± 3.94 0.46 ± 0.07 0.22 ± 0.02 1.26 ± 0.09 5.55 ± 0.06**

Bisphenol A (BPA) was orally administered with dose 500, 1000, 2000 mg/kg and cyclophosphamide (CY) was i.p. injected with dose 50 mg/kg to ICR mice. Mice were sacrificed on day 2, 7 following administration of BPA. Changes of body weight

= (final weight/initial weight)xl00. Changes of organ weight= (organ weight/body weight)xl00. Each value is the mean 土 S.D. of 6 mice. Significant difference from control (*p<0.05, **p<0.01).

Bisphenol A 의 급성노출이 口1우스의 면역기능게 미치는 영향 59

Table II - The variation in hematological parameters of mice administered bisphenol A Exp. group

(mg/kg) Control CY50 BPA500 BPA1000 BPA2000

day 2

WBC (103/mm3) 5.5 ± 0.6 4.2 ± 1.0** 4.9 ± 1.0* 4.5 ± 0.4** 4.6 ± 0.9**

RBC (103/mm3) 7.1 ± 0.6 7.1 ± 0.4 7.2 0.5 7.2 ± 0.5 7.1 ± 0.8 HGB (g/d/) 12.5 0.9 12.2 ± 0.6 12.6 ± 0.7 12.3 ± 1.6 12.6 ± 1.0

HCT (%) 40.4 5.3 40.2 4.2 40.8 + 2.9 41.0 ± 5.2 40.6 士4.3

MCV (pm3) 56.5 ± 4.3 56.3 ± 4.5 56.6 ± 3.7 56.7 ± 6.4 55.6 ± 4.9 MCH (pg) 17.5 ± 0.8 17.2 土 0.8* 17.3 - 1.0 17.1 ± 1.9 17.4 ± 0.4 MCHC (g/d/)

PLT (103/mm3)

31.2 + 2.8 31.1 ± 2.8 30.8 ± 2.7 30.4 ± 4.4 31.9 ± 2.8 1035 ± 164 918 ± 199* 1012 ±198 1087 ± 236 1148 土223 day 7

WBC (103/mm3) 4.1 ± 1.4 4.1 ± 0.8 4.4 土 1.0 4.3 ± 1.3 4.2 ± 1.4 RBC (103/mm3) 7.7 ± 0.4 7.3 ± 0.3** 7.9 ± 0.1* 7.8 ± 0.2 7.5 ± 0.1 HGB (g/d/) 13.2 0.6 13.0 ±0.4 13.0 ±0.4 13.2 ±0.4 12.9 - 0.3*

HCT (%) 44.7 + 2.6 41.8 ± 3.7* 42.2 ± 3.6* 44.2 + 1.8 44.0± 2.4*

MCV (fim3) 57.0 ± 4.0 56.5 ± 4.3 56.0 ± 5.1 56.9 ± 2.1 56.8 ± 4.2 MCH (pg) 17.2 0.4 17.2± 0.4 16.9^±0.6 17.1 ± 0.6 17.2 ± 0.5 MCHC (g/d/) 30.3 ± 2.4 31.1 ± 2.7 30.9 ± 2.2 30.6 ± 2.1 29.2 ± 1.9 PLT (103/mm3) 1129 ± 222 1066 ± 223 1033 ± 136 1143 ± 133 1198 ± 156 Bisphenol A(BPA) was orally administered with dose 500，1000，2000 mg/kg and cyclophosphamide(CY) was i.p. injected with dose 50 mg/kg to ICR mice. Mice were sacrificed on day 2, 7 following administration of BPA. WBC (white blood cell), RBC (red blood cell), HGB (haemoglobin), HCT (hematocrite)，MCV (mean corpuscular volume), MCH (mean corpuscular haemoglobin), MCHC (mean corpuscular haemoglobin concentration), PLT (platelet), Each value is the mean 土 S.D. of 6 mice. Significant difference from control (*p<0.05, **p<0.01).

o l—

1

1 1

1

1

1

control CY50 BPA500 BPA 1000 BPA2000

Dose(mgZkg)

Fig. 1 - Spleen cellularity in mice on day 2 and day 7 administered bisphenol A.

Bisphenol A(BPA) was orally administered with dose 500, 1000，2000 mg/kg and cyclophosp­

hamide (CY) was i.p. injected with dose 50 mg/kg to ICR mice. Mice were sacrificed on day 2 and.7 following administration of BPA. Each group consists of 4—6 mice. Results are the mean 土 S.D.

of 3 different experiments. Significant difference from control group (*P<0.05, **P<0.01).

여후시일이 경과함에 따라 회복되는 현상인 것으로 보인다.

비장세포수에 미치는 영향

BPA를 500，1000，2000 mg/kg 용량으로 1회 경구 투여하여 급성노출시키고, 양성대조물질인 CY를 50 m^kg용량으로복강내 주사한후 2일과 7일째에 비장 을 적출하여 비장세포수를측정한 결과는 Fig. 1에나 타난 바와같다. CY처리 마우스의 비장세포수는 투여 후 2일째에는대조군에 비해 약 39.7%정도로 현저히 유의성있게 감소되어 독성이 심하게 나타났고 7일째는 거의 대조군과 비슷하여 백혈구 수에 미치는 영향과 같은현상을 보였다.

또한, BPA에의해서도 2일째에는 투여용량에 관계 없이 대조군에 비해 약 25.2% 현저히 유의성있게 감 소되어 CY와 비슷한독성을 보였으며, 7일째에는 대 조군과 별차미가 없었다.

비장세포중 IgM 용혈반 생성 세포수에 미치는 영향 SRBC 항원주사 2일전 또는 2일후에 BPA를 500,

60 표명윤 • 변정아

Fig. 2 - IgM plaque forming cell (PFC) to SRBC in mice administered BPA on the 2nd day after immuni­

zation.

Bisphenol A(BPA) was orally administered with dose 500，1000,2000 mg/kg and cyclophosphamide (CY) was i.p. injected with dose 50 mg/kg to ICR mice. Mice were i.p. immunized with SRBC- antigen (day 0). Each group consists of 4—6 mice. Results are the mean 土 S.D. of 3 different experiments. Significant difference from control group (*p<0.05, **p<0.01).

■ IgM plaque forming cell (PFC) to SRBC in mice administered BPA on the 2nd day before immunization.

Bisphenol A (BPA) was orally administered with dose 500，1000，2000 mg/kg and qrclophosphamide (CY) was i.p. injected with dose 50 mg/kg to ICR mice. Mice were i.p. immunized with SRBC- antigen (day 0). Each group consists of 4—6 mice.

Results are the mean 土 S.D. of 3 different experi­

ments. Significant difference from control group.

1000，2000 mg/kg 용량으로 1 회경구투여하고 양성 대조물질인 CY를 50 mg/kg용량으로복강내에주사하 고，IgM 용혈반 생성 세포수는 SRBC로 일차면역 후 4일째에 최고에 달하므로15) 항원주사후 4일째에 비장 을 적출하여 IgM PFC수를 측정한 결과를 Fig. 2와 Fig. 3에나타내었다. Fig. 2에서 보는바와같이 항원 주사후 2일째실험물질을투여했을때, CY투여의 경 우에는대조군에비해 PFC수가현저히유의성있게 감 소(약 98.3%)되었는데, 이러한 현상은 여러 논문에서 이미 보고된 C M 체액성 면역반응의 저해결과와일 치하고 있다. 실험물질인 BPA에 의해서도 대조군에 비해 500 mg/kg 투여군의 경우 약 29.4%, 1000 kg 투여군의 경우 약 46.9%, 2000 mg/kg 투여군의 경우약 80.0%가감소되어 용량의존적으로 비장세포 중 IgM PFC수가유의성있게감소되는것으로나타나 CY보다는 독성이 낮으나 BPA도 체액성 면역반응을 억제하는 것으로 보인다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 항원주사 2일전 실험물질을 투여했을 경우에는 BPA 1000 mg/kg 투여군만이 대조군에 비해 PFC수가 다

소 낮아지는 경향을 보였으나 유의성이 없어 IgM

PFC수에 별다른 영향을미치지 않는것으로보인다. 이상의 실험 결과，BPA는 SRBC 항원주사전 투여 시에는 SRBC 항원에 대한 일차 체액성 면역반응에 큰영향이없으나 SRBC접촉후투여시에는 PFC수가 현저히 감소되어 항원과의 관계가주요한인자임을알 수 있었다.

혈중 IgM항체 생성능에 미치는 영향

OVA 항원주사 2일전 또는 2일후에 BPA를 500, 1000, 2000 mg^kg 용량으로경구투여하여 급성노출시 키고, 양성대조물질인 CY를 50mg^cg용량으로복강내 에주사한 후 IgM PFC 측정일인 면역 후 4일째와 일차면역 후 혈청 IgM항체가가 최고에 이르는 7일째 16)에혈청중의 IgM 항체를 ELISA법으로측정한결과 를 Table m과 Table IV에 나타내었다. Table III에 서보는바와같이 OVA 항원으로면역후 2일째에 실 험물질을 투여했을 때，CY투여의 경우에는 대조군에 비해 면역 후 4일째와 7일째 모두흡광도치가현저히 유의성있게 낮<아 OVA 항원에 대한혈청중 IgM 항체 생성이 억제되었다. BPA에의해서는면역후 4일째에 고용량에서뚜렷하게 유의성있는감소를보이고 7일째 에는약간낮아지는경향을보여 CY보다는약한독성

Bisphenol A 의 급성노출이 마뉴스의 면역기능에 미치는 영향 61

control 1x10 4 5x10 5 2.5x10-5 lx l O . 5 5 xl0 6 2.5x10 6 B P A C on ce ntra tion(M )

Fig. 4 -In vitro effects of BPA on the Con A or LPS- induced splenocyte proliferation.

Mouse splenocytes (2 x 105 cells/well) were stimu­

lated with Con A (2 |xg/m/) or LPS (50 jig/m/) in the presence of various concentration of bisphenol A (BPA) for 48 hrs. Splenocyte proliferation was assessed by MTT assay. Results are the mean ± S.D. of 3 different experiments and all experiments were done in triplicate. Significant difference from control group (**p<0.01).

0.5 , 0.4

control BPA500 B PA 1000 BPA2000

Dose (m g /k g)

Fig. 5 - Effects of oral administration of BPA on the splenocyte proliferation in mice.

Mice were sacrificed on the 2nd day after administration of bisphenol A (BPA) and spleno­

cytes (2 x 105 cells/well) were cultured with Con A (2 |ig/m/) or LPS (50 \xg/ml) for 48 hrs. Sple­

nocyte proliferation was assessed by MTT assay.

Results are the mean 土 S.D. of 3 different experi­

ments and all experiments were done in triplicate.

Significant difference from control group (*p<

0.05，**p<0.01).

(mg/kg) day 4 day 7

Control 0.300 ± 0.155 1.153 ± 0.242 CY50 0.213 ± 0.025 1.220 ± 0.203 BPA500 0.381 ± 0.117* 1.143 ± 0.451 BPA1000 0.289 ± 0.043 1.112 ± 0.138 BPA2000 0.293 ± 0.067 1.284 ± 0.268 Bisphenol A (BPA) was orally administered with dose 500, 1000，2000 mg/kg and cyclophophamide (CY) was i.p.

injected with dose 50 mg/kg to ICR mice. Mice were i.p.

immunized with OVA-antigen (20 (xg/mouse, day 0). IgM level was determined by using ELISA in mice serum (1:40) obtained on day 4 and day 7 after immunization.

Each value is the mean 土 S.D. of 5—7 mice. Significant difference from control group (*p<0.05).

을보였다. 그러나 OVA 항원주사 2일전에 BPA를투 여시에는 저용량에서 다소 증가하는경향이 보였으나 대조군과큰차이는 없었다.

임파구 증식능에 미치는 영향

본 연구에서는 T세포와 표세포를각각자극하여 임 파구 중식을 야기시키는 Con A와 LPS를 미우스 비 장세포에 가하고실험물질의 영향을 in 실험에서 와 in wW실험에서 평가하였다(Fig. 4, Fig. 5). 비장 세포의증식능을측정하기 위해 예비실험을행하여 비 장세포 2X106 cells/m/에서 Con A와 LPS 농도가 각 각 2 lag/m/, 50 (ig/mZ에서높은마우스의 임파구중식 능을관찰할수 있었으므로 이농도를시용하였다. 또 Table III - IgM level in mice administered BPA on

the 2nd day after immunization Exp. group __________ O.D. (405 nm)

(mg/kg) day 4 day 7

Control 0.595 ± 0.191 1.199 ± 0.131 CY50 0.182 土 0.079** 0.180 ± 0.052**

BPA500 0.538 ± 0.088** 1.144 ± 0.213 BPA1000 0.521 ± 0.417 1.079 ± 0.102**

BPA2000 0.388 ± 0.087&& 1.095 ± 0.268 Bisphenol A (BPA) was orally administered with dose 500，

1000, 2000 mg/kg and cyclophosphamide (CY) was i.p.

injected with dose 50 mg^kg to ICR mice. Mice were i.p.

immunized with OVA-antigen(20 |Xg/mouse, day 0). IgM level was determined by using ELISA in mice serum (1:40) obtained on day 4 and day 7 after immunization.

Each value is the mean 土 S.D. of 5~7 mice. Significant difference from control group (**p<0.01).

Table IV - IgM level in mice administered BPA on th 2nd day before immunization

Exp. group 이 . (405 nm)

543

o. o. o.

EU0Z.S ) -Q.o

62 표명윤 • 변정아

한，생존세포의 효소작용에 의해 MTT시약이 환원되 어생성되는 formazan의양을측정함으로써 세포독성 연구에 자주 사용되며 3H-thymidine uptake assay의 결과와 유사한 것으로 보고된17) MTT assay18)를 이 용하며 임파구증식능의 변화를 측정하였다.

In 서의 영향 -BPA가 in wYro에서미우스의 비장세포 중식능에 미치는 영향을 Fig. 4에나타내었 다. Mitogen을 처리하지 않고 BPA의 최종농도 IX 10"4, 5X 10~5, 2.5><1요5, 1X10_5, 5XKT6，2.5X 10-6 M-g- 비장세포(2 x io 5 cells)에 혼합배양시 BPA를처 리하지 않은 대조군과비교해 보면, IX 1(미 M농도에 서는 O.D•값이약 68% 감소되어세포독성이강한것으 로보인다. 그러므로 이농도에서 Con A와 LPS에대 한임파구중식능이각각 87.3%, 87.1%로현저히감소 한것은 BPA의독성의 일환으로생각될수도있다. T cell mitogen인 Con A에대한중식능은 대조군에비해

BPA의

5><l(r5

는 5_3%로고농도에서는감소하였고, lx io —5 보에서는 8.9%, 5 X 1 0 보에서는 8.6%, 2.5X10-6 보에서는 6.9%로 저농도에서는중가되는 양상을보였다. B cell mitogen인 LPS에대한증식능은 대조군에 비해 5X 10~5 보에서는 46.7%, 2.5X10-5 보에서는 12.6%, I X

10-5 보에서는 0.6%, 5X10-6 M에서는 2.6%, 2.5X 10~® 보에서는 5_2%로 BPA의고농도에서는유의성있게 감소되었으나저농도에서는별영향이 없었다.

In wVo에서의 영향 - 미우스에 BPA를 500, 1000 및 2000 mg/kg을 1희경구투여한후 2일째에 비장세 포를 분리하여 mitogen에대한중식능을실험한결과 는 Fig. 5와같다. Con A와 LPS에 대한중식능은대 조군에 비해 500mg^g 투여군은 각각 9.3%, 5.3%, lOOOmglcg 투여군은 19.3%, 24.4%, 2000 mg/kg 투 여군은 10.0%, 21.3%로 감소하는경향을 나타내었으 며, 1000 mgltg와 2000 mglig에서 LPS에대한중식 능이 유의성있게 현저히감소되었다.

결 론

Bisphenol A(BPA)를 500，1000, 2000 mg/kg 용 량으로 마우스에 1회 경구투여하여 급성노출시킨 후 면역병리(체중, 장기무게，비장세포수, 혈액학적 parameter), IgM PFC수, 혈청중 IgM항체 및 임피구 증식능을 측정한결과는다음과같다.

1. BPA는투여 후 2일째에 백혈구수와비장세포수 가 유의성있게 감소되었으나, 체중，면역장기무게 및 백혈구 수를 제외한 혈액학적 성상에는 거의 영향을 미치지 않았다.

2. BPA는 SRBC 항원주사후 2일째에 투여했을때, 비장중 IgM PFC수를 용량의존적으로현저히 유의성 있게 감소시켰으나，항원주사 2일전에 투여했을 때는 별영향이 없었다.

3. BPA는 OVA 항원 면역 후 2일째 투여했을 때, 혈청중 IgM 항체농도를 고용량에서 유의성있게 현저 히감소시켰으나, 면역 2일전에투여시에는큰영향을 나타내지 않았다.

4. BPA는 in w'fro에서 고농도로 처리시에는 Con A에의한비장세포의 증식능을 현저히 감소시켰고, 저 농도에서는다소중가시켰으며, LPS에대한중식능도 고농도에서는 감소시켰다. BPA를 경구투여한 마우스 의 비장세포는 Con A와 LPS에의한 중식이 감소되 었다.

이상의 결과는 내분비계 장애물질로 알려진 bisphenol A가 생체의 면역계에 영향을 미치는 것을 시사해 주고 있다. 따라서 bisphenol A의 면역독성 기전을 규명하고 그 위해성에 대한 대책을 확립하기 위해서는 bisphenol A를아급성으로노출시켜 면역계 에미치는 영향에 대한체계적인 연구가필요하다.

감사의 말씀

본 연구는 식품의약품안전청의 1999년도 내분비계 장애물질 연구사업의 지원으로 수행되었으며 이에 감 사드립니다.

문 헌

1) Krishnan, A. V，Stathis, O. Permuth, S. E, Tokes, L.，

Feldman, D .: Bisphenol A: An estrogenic substance is released from polycarbonate flasks during autoclaving. Endocrinology, 132(6), 2279 (1993).

2) Brotons, J. A., olea-Serrano, M. E, Villalobos, M., Pedraza, V and Olea, N .: Xenoestrogens Released from lacquer Coating in Food Cans. Environ health Perspect，103(6)，608, (1995).

3) Mountfort, K. A., Kelly, J., Jickells, S. M. and Castle, L .: Investigations into the potential degradation of

Bisphenol A 의 급성노출이 마우스의 면역기능에 미치는 영향 63

polycarbonate baby bottle during sterilization with consequent release of bisphenol A. Food Additives and Contaminants, 14(6-7)，717 (1997).

4) Tsutsui, T, Tamura, Y., Yagi, E.，Hasegawa, K.，

Takahashi, M., Maizumi, N.，Yamaguchi, E and Barrett, J. C .: Bisphenol-A induces cellular tansforma- tion, aneuploidy and DNA adduct formation in cultured Syrian hamster embryo cells. Int. J. Cancer, 75，290 (1998).

5) Morrissey, R. E.，George, J. D.，Price, C. J., Tyl, R.

W., Marr, M. C. and Kimmel, C. A .: The develop­

mental toxicity of bisphenol A in rats and mice.

Fundamental and Appled Toxicology, 8, 571 (1987).

6) Dayan, A. D., Hertel, R. E, Heseltine, E.，Kazantzis, G., Smith, E. M. and Van der Venne, M. T.: Immuno- toxicity of metals and immunotoxicology. Plenum Publishing Corporation, 3 (1990).

7) Jontell, M., Hanks, C. T, Bratel, J., Bergenholtz, G .:

Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor pulp. J. Dent Res., 74(5)，1162 (1995).

8) Pyo, M. Y.: A study on the modulation of cell- mediated immunity by cyclophosphamide. Theses collection of Sookmyoung Women's University, 27，541 (1986).

9) Mishell, B. and Shiigi, S : Selected methods in cellular immunology. W. H. Freman and company, 14, (1980).

10) Cunningham, A. and Szenberg, A. : Further improve­

ments in the plaque technique for detecting single

antibody-forming cells. /. Immunol.，14，599 (1968).

11) Loren, D. K .: Decreased antibody formation in mice exposed to lead. Nature, 250, 148 (1974).

12) Coligan, J. E., Kruisbeek, A. M., Margulies, D. H., Shevach, E. M. and Strober, W. : Current protocols in immunology-National institute of health, John Wiley

& Son 1，2.1.3-2.1.5 (1991).

13) Engvall, E. and Perlmann, R : Enzyme-linked immu­

nosorbent assay, ELISA. J. Immunol., 109(1)，129 (1972).

14) Turk, T. L., Poulter, L. W. : Selective depletion of lymphoid tissue by cyclophosphamide. Exp. Immunol.，

10, 285 (1972).

15) Guest, I. C., Paik, N. W, Ryu, J. C.，Park, J. S. and Chang, I. M .: Hematological values in normal laboratory mice(ICR and ddY strains). Korean J.

Toxicol. 7，47, (1991).

16) Robert, I. and Richard, W. : Immunization of normal mouse spleen cell suspensions in vitro. Science, 153, 1004 (1966).

17) Roitt, I., Brostoff, J., Male, D. : Immunology, Gower Medical Publishing. London • New York (1985).

18) Roh, J. K., Chung, H. C., Koh, E. H., Lee, W Y, Hahn, J. S. and Kim, B. S. : In vitro cytotoxicity of various anticancer drugs to short-term cultured gastric adenocarcinoma cell lines. J. of Korean Cancer Association 23，3 (1991).

19) Dolye A., Griffiths J. B. and Newell D. G .: Cell &

Tissue Culture; Laboratory procedures, John Willy

& Sons Ltd., U.K., 1993.