Study of Optimized Extraction Conditions for Simultaneous Anti-inflammatory and Antioxidant Activity of Artemisia iwayomogi using Response Surface Methodology

† 주 저자 (e-mail: [email protected] call: 043-211-6144 J. Soc. Cosmet. Sci. Korea

Vol. 45, No. 3, September 2019, 319-331

eISSN 2288-9507 http://dx.doi.org/10.15230/SCSK.2019.45.3.319

반응표면분석을 이용한 한인진의 항염 및 항산화 복합 활성 최적 추출 조건에 관한 연구

박 다 원⋅최 우 석⋅이 창 현^†

한국화학융합시험연구원

(2019년 9월 4일 접수, 2019년 9월 23일 수정, 2019년 9월 27일 채택)

6)

Study of Optimized Extraction Conditions for Simultaneous Anti-inflammatory and Antioxidant Activity of Artemisia iwayomogi using Response Surface Methodology

Dawon Park, Woo Seok Choi, and Chang Hyeon Lee^†

Korea Testing and Research Institute, 5 Osongsaengmyeong-ro, Osong-eup, Heungdeok-gu, Cheongju 28161, Korea (Received September 4, 2019; Revised September 23, 2019; Accepted September 27, 2019)

요 약: 본 연구에서는 한인진으로부터 항염 및 항산화 활성이 뛰어난 추출물을 추출하기 위한 용매 및 추출법을 개발하여 최적의 추출 조건을 확인하였다. 증류수, 에탄올, 메탄올, 헥산 및 EA를 추출 용매로 한 초음파, 초고압 추출법과 초임계 추출법으로 추출을 한 후 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거 활성을 비교 확인하였다. 그 결과 항염, 항산화 활성, 수율 및 안전성을 모두 고려하여 볼 때 에탄올 용매의 초음파 추출법이 가장 좋은 결과를 보였다. 이를 바탕으로 초음파 최적 추출 조건을 설정하기 위해 반응표면분석법 (RSM)을 사용하여 연구한 결과, 수율의 최적 추출 조건은 에탄올 함량(45.71%), 추출 시간(63.33 min), 초음파 출력량(308.84 W)일 때, 15.85%의 가장 높은 수율을 보이는 것으로 예측되었고 실제 수율은 16.40 ± 0.28%였 다. 항염과 항산화 복합 활성의 최적 추출 조건은 에탄올 함량(94.54%), 추출 시간(90.00 min), 초음파 출력량 (400.00 W)일 때, 각각 94.54%, 58.03%로 가장 높은 값을 보이는 것으로 예측되었고 실측검증에서 각각 89.77 ± 1.37%, 60.12 ± 0.39%으로 예측 값과 유사한 결과를 보였다.

Abstract: This study was conducted to find a solvent, a extraction method and optimized conditions for Artemisia iwayomogi extract. which is effective to anti-inflammatory and antioxidant activity. A. iwayomogi extract by distilled water, ethanol, methanol, hexane and ethyl acetate using ultrasonic, high-pressure and supercritical extraction was investigated for NO inhibitory and DPPH radical scavenging activity. Extract obtained by ethanol and ultrasonic extraction method showed high NO production inhibitory activity, DPPH free radical scavenging activity and yield. Response surface methodology (RSM) was applied to find a optimized ultrasonic extraction conditions. Results showed that the optimum conditions for the higher yield were ethanol solvent of 45.71% concentration with extraction time and ultrasonic power of 63.33min and 308.84 W, respectively. This condition predicted 15.85% yield, but real yield was 16.40 ± 0.28%.

The optimum conditions for simultaneous anti-inflammatory and antioxidant activity were established as ethanol concentration (80.81%), extraction time (90.00 min) and ultrasonic power (400.00 W). NO production inhibitory and antioxidant activity were 89.77 ± 1.37% and 60.12 ± 0.39%, respectively. These results showed similar to the predicted values of 94.54%, 58.03% respectively.

Keywords: Artemisia iwayomogi, extraction, response surface methodology (RSM), anti-inflammation, antioxidant

1. 서 론

천연물이 화장품에 활용된 역사는 오래되었으며 현재도 다양한 피부 타입에 적합하며 , 부작용과 알러지 반응이 적 어 우리나라와 중국을 포함한 아시아뿐만 아니라 세계적으 로 다양하게 활용되고 있다 [1,2]. 한인진(Artemisia iwayomogi) 은 우리나라에 널리 서식하는 국화과 (Compositae) 식물로 더 위지기라고도 불린다 . 한인진(A. iwayomogi)은 오랜 시간 동안 약용으로 쓰여 왔으며 다양한 질병에 사용되어 왔다 . 한인진의 에탄올 추출물은 혈중 지질 및 간지질 개선 효과 와 간 보호 효과 , 항균 효과, 혈당 강하와 고혈당에 의한 조직 손상을 감소시켜 주는 것으로 보고되었다 [3-6]. 그뿐 만 아니라 지상부에서 분리한 sesquiterpene이 RAW 264.7 세포에서 inducible NOS (iNOS)의 발현을 저해하여 nitric Oxide (NO) 생성 억제에 효과가 있고 ethyl acetate (EA) 분획 물과 분리한 chlorogenic acid, genkwanin, scopoletin이 ONOO

을 억제함으로 항염 효과가 보고 되어왔다 [7-10]. 또한, 한 인진 물 추출물 , EA 분획물과 분리한 sesquiterpene의 항산 화 효과가 보고되었다 [3,4,11]. 이러한 한인진은 의약품 연 구는 활발히 진행되고 있으나 화장품 소재로서의 연구는 많이 되어 있지 않아 본 연구에서 항염과 항산화가 뛰어난 추출법을 확인하여 화장품 소재로 활용하는데 용이하도록 하였다 .

NO는 생리학적, 병리학적으로 중요한 인자로 혈중에 낮 은 농도로 존재하는 경우에 혈압 조절과 세포 보호 효과가 있으나 , iNOS에 의해 과발현될 경우 NF-κB, MAPK와 같 은 전사 인자와 cyclooxygenase-2 (COX-2), prostaglandins 2 (PGE2)와 같은 염증성 매개 물질을 생성시켜 다양한 염증 을 유발시키고 세포를 손상시킨다 . Free radical에 의해서 생성되는 reactive oxygen species (ROS)는 자연적으로 생성 되며 여러 세포 반응을 조절하나 , 과발현될 경우에는 암, 노화 , 알츠하이머, 파킨슨 병과 같은 다양한 질병을 유발 시키는 것으로 알려져있다 [12-16]. 이에 따라 NO와 ROS를 저해시키는 물질에 대한 연구가 다양한 방면에서 이루어 지고 있다 .

전통적인 추출 방법인 열수 추출법은 긴 추출 시간과 , 열에 의한 성분의 파괴 및 변이가 발생되는 단점이 있다 . 이러한 단점을 극복하고자 최근에는 초음파 , 초고압, 초임 계 등의 추출방법을 사용하는 경우가 많다 [17-19]. 초음파 추출법을 사용하면 열에 의한 손실이 줄어들며 초음파 진 동에 의하여 높은 압력에 의하여 높은 수율의 추출물을 보

다 빠른 시간에 얻을 수 있다 [20,21]. 초고압 추출법은 열처 리가 없어 열에 의한 유용성분의 손실이 없으며 , 단시간 내 에 중요 구성 성분을 높은 순도로 추출이 가능하다 . 고압을 이용하는 추출법이기 때문에 , 수소결합 이온결합, 반데르발 스 결합과 같은 약한 결합들은 끊어질 수 있다 [22]. 초임계 추출법은 저온에서 조작할 수 있어 열에 약한 물질을 추출 하는데 용이하며 용매를 사용하지 않고 정유 성분을 추출 할 수 있다는 장점이 있다 [23]. 이와 같은 다양한 추출법이 효율적이고 경제적인 소재 개발 연구에 활용되고 있다 .

본 연구에서는 한인진의 다양한 용매와 초음파 , 초고압, 초임계 추출법 중 항염과 항산화가 뛰어난 추출 조건을 확 인하고 독립변수들이 복합적인 작용으로 종속변수에 영향 을 줄 때 이를 통계적으로 분석하여 반응 값을 2차원 또는 3차원의 표면에 형성하여 나타내는 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하여 한인진의 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능으로 항염과 항산화 의 복합적인 활성과 수율이 뛰어난 최적 추출 조건을 확립 하고자 하였다 [24-26].

2. 재료 및 실험

2.1. 한인진 추출물 제조

본 실험에 사용된 한인진 (A. iwayomogi)은 전라북도 진안 군 진안읍 소재의 진안당영농조합법인 (Korea)에서 구입하여 사용하였다 . 용매별 추출에 사용된 용매는 100% 에탄올(OCI Company Ltd., Korea), 메탄올(OCI Company Ltd., Korea), 헥 산 (OCI Company Ltd., Korea), EA (OCI Company Ltd., Korea), 증류수가 사용되었다 . 초음파 추출에는 초음파 추출기 (SD-D400H, Sungdong Ultrasonic Co., Ltd., Korea)를 사용하였 으며 최대 출력량은 400 W이다. 분쇄된 한인진 5 g에 추출 용매 50 mL을 넣고 90 min 동안 출력량 400 W로 온도는 50

℃ 이하를 유지하여 3회 반복하였다. 초고압 추출에는 초고압 추출기 (CIP-L2-100-300, Ilshinautoclave Co., Ltd., Korea)를 이 용하여 , 분쇄된 한인진 5 g에 추출 용매 50 mL을 넣고 1,000 bar 에서 30 min 동안 처리하여 추출물을 얻었다. 초임계 추 출은 초임계 추출기 (SC-CO

EXTRACTION SYSTEM, Ilshinautoclave Co., Ltd., Korea)를 이용하여 분쇄된 한인진 200 g을 넣고 300 bar, 50 ℃에서 2 h 동안 추출하였다.

반응표면분석을 위한 추출에는 25, 50, 100% 에탄올과

초음파 추출기를 사용하였으며 , 분쇄된 한인진 5 g에 추출

용매 50 mL을 넣고 출력량 200, 300, 400 W에서 30, 60,

90 min 동안 50 ℃ 이하를 유지하며 3회 반복하여 추출물 을 얻었다 .

2.2. RAW 264.7 세포 배양

RAW 264.7 세포주는 고려대학교(Korea)에서 분양 받아, 10% FBS (Gibco Inc., USA)와 penicillin streptomycin (Gibco Inc., USA)을 포함하는 DMEM (Hyclone Inc., USA)을 배양 액으로 하여 37

C의 온도와 80%의 습기 조건인 배양기에 서 공기 95%와 CO

5%의 혼합기체를 지속적으로 공급하 며 배양하였다 .

2.3. 한인진 추출물의 NO 생성 저해 활성 실험과 독성 확인 시험

NO 생성 저해 활성과 세포 독성을 확인하기 위해 96 well plate에 2 ✕ 10

cells/mL로 190 μL씩 분주하였다. 4 h 후 시료를 5 μL 처리하고 1 h 뒤 LPS (Sigma Aldrich, USA)를 5 μL씩 처리하였다. 24 h 후, 각 well의 상층액 100 μL와 griess 시약(Sigma Aldrich, USA) 100 μL와 혼합 하여 10 min 동안 반응시킨 뒤 550 nm에서 흡광도를 확인 하여 NO 생성 저해 활성을 확인하였다. 96 well plate에 100 μL의 상층액을 제외하고 남은 세포와 배양액에 EZ-cytox (Daeil Lab service Co., Korea) 시약을 10 μL씩 처 리한 후 2 h 동안 배양기에서 반응시킨 후 450 nm에서 흡 광도를 확인하여 세포 독성을 확인하였다 .

NO 생성 저해 활성과 독성 확인 식은 다음과 같다.

NO 생성 저해 활성 (%) = {(LPS 처리군의 흡광도 – LPS와 시료 혼합 처리군의 흡광도)/(LPS 처리군의 흡광도 – LPS와 시료 무처리군의 흡광도)} ✕ 100

세포 보호 활성 (%) = (LPS 처리군 또는 LPS와 시료 혼합 처리군의 흡광도 )/(LPS와 시료 무처리군의 흡광도) ✕ 100

2.4. DPPH Free Radical 소거능 평가 시험

기존의 Thaipong 등의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 시험법을 개량하여 사용하였다 [27]. Free radical 소거능을 평가하기 위해 96 well plate에 시료 10 μL와 0.15 mM의 DPPH 시약 (Sigma Aldrich, USA) 190 μL를 암소에서 30 min 동안 반응시켰다. 이 후 517 nm에서 흡광도를 측정하 여 free radical 소거능을 확인하였다.

DPPH free radical 소거능 식은 다음과 같다.

DPPH free radical 소거능 (%) = {1-(시료와 DPPH 처리 군의 흡광도 - 시료와 에탄올 처리군의 흡광도)/(DPPH 처

리군의 흡광도 - 에탄올 처리군의 흡광도)} ✕ 100

2.5. 총 플라보노이드 함량 평가 시험

Dewanto 등의 총 플라보노이드 함량 시험을 개량하여 진행하였다 [28]. 총 플라보노이드 함량 평가를 위해 96 well plate에 1 mg/mL의 시료 30 μL와 5% NaNO

(JUNSEI Chemical Co., Ltd., Japan) 15 μL를 취하여 5 min 반응시켰 다 . 이 후 10% AlCl

⋅ 6H

O(JUNSEI Chemical Co., Ltd., Japan) 150 μL 추가하고 6 min 동안 반응시켰다. 1M NaOH (OCI Company Ltd., Korea)를 100 μL 추가하여 11 min 간 반응시키고 510 nm에서 흡광도를 측정하여 총 플 라보노이드 함량을 평가하였다 . 총 플라보노이드 함량은 건조 추출물 무게(mg)에 대한 (+)-catechin hydrate (Sigma Aldrich, USA)의 무게(μg)로 표현하였다.

2.6. High Performance Liquid Chromatography 조건 HPLC (Prominence, SHIMADZU, Japan)를 분석에 사용하 였다 . 적용한 컬럼은 Agilent Eclipse plus C

(4.6 mm I.D.

× 250 mm, 5 μm, Agilent, USA)이고 검출기는 PDA를 사 용하였다 . 용매는 A (Water)와 B(Acetonitrile)를 gradient 조 건 B 5% (0 - 5 min), B 5 - 95% (5 - 30 min)로 진행하였다.

컬럼 온도는 40 ℃를 유지하고 flow rate는 B 0.6 mL/min으 로 injection volume은 20 μL로 진행하였다.

2.7. 반응표면분석법

반응표면분석법(RSM) 중 3 개의 변수에 대해 3 개의 범 위를 정해 최적 조건을 확인 할 수 있는 Box-Behnken design을 사용하였으며, 예비 실험을 통하여 수율(Y

)이 높 고 NO 생성 저해 활성(Y

)과 DPPH free radical 소거능(Y

) 이 복합적으로 뛰어난 최적 추출 조건을 찾았다 . 변수로는 에탄올의 농도 (X

, 25, 50, 100%), 추출 시간 (X

, 30, 60, 90 min), 출력량 (X

, 200, 300, 400 W)를 설정하였다. 각 변수의 최소값을 –1, 중간값을 0, 최대값을 1로 나타내었다 (Table 1). 각 반응에 대해 다음의 이차다항식으로 표현할 수 있다 .

Yn=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β12X1X2+β23X2X3+β13X1X3

+β11X12+β22X22+β33X32

β

, β

, β

는 각각의 변수에 대한 선형 계수이고 β

, β

, β

은 각 변수간의 상관관계에 대한 계수이며 β

, β

, β

은 각 변수의 이차 계수를 나타낸다 .

2.8. 통계처리

반응표면분석법은 MINITAB Release 19.1.1 Statistical Software (Minitab Inc., USA)를 사용하여 설계 및 분석되었 다 . 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. Student’s t-tests를 이용하여 대조군으로부터 변동을 판정하였다. 각 실험은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 3번 이상 수행되 었다 . P < 0.05 일 때, 유의성이 있다고 판단하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 한인진의 용매별, 추출법별 추출물의 수율

한인진 (A. iwayomogi)의 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능이 뛰어난 추출 조건을 찾기 위해 초음 파 , 초고압 추출법으로 100% 증류수, 에탄올, 메탄올, 헥 산 , EA 용매를 사용하여 추출을 진행하였고, 비용매 추출 법인 초임계 추출은 CO

만을 사용하여 진행하였다 . 수율 은 건물 무게 대비 각 추출물의 무게를 계산하여 구했다 .

초음파 추출법을 90 min 동안 사용하였을 때, 헥산 추출 물의 수율은 1.9%로 가장 낮았으며, 증류수와 메탄올을 추 출물은 각각 10.1%, 9.3%로 추출물 중에서 높은 수율을 보 였다 . 에탄올과 EA 추출물은 각각 6.5%, 6.4%의 수율을 보 였다 . 1,000 bar, 30 min 동안 초고압 추출기로 처리하였을

때 , 7.8%의 수율을 보인 증류수 추출물을 제외한 다른 용 매의 추출물은 모두 5% 미만의 수율을 보였다. 300 bar, 50

℃에서 2 h 동안 초임계 추출을 하였을 때의 수율은 0.1%

미만으로 나타났다 . 그 결과, 가장 수율이 높은 추출법은 초음파 추출법이고 초고압 추출법 , 초임계 추출법 순으로 낮은 수율을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (Table 2).

Run EtOH Concentration (%) Time (min) Power (W) NO production inhibitory activity (%)^a

DPPH free radical

scavenging activity (%)^b Yield (%)

1 25 (-1) 30 (-1) 300 (0) 24.2 30.4 10.6

2 100 (1) 30 300 94.4 44.2 6.8

3 25 90 (1) 300 29.8 30 12.7

4 100 90 300 74.2 48.5 9.7

5 25 60 (0) 200 (-1) 5.4 7.0 11.1

6 100 60 200 87.2 42.2 6.6

7 25 60 400 (1) 44.4 34.8 9.7

8 100 60 400 94.6 35.1 9.8

9 50 (0) 30 200 62.6 47.1 12.5

10 50 90 200 54.8 47.3 8.9

11 50 30 400 43.2 37.8 10.3

12 50 90 400 82.3 61.6 12.2

13 50 60 300 36.8 38.5 15.7

14 50 60 300 36.8 38.5 15.7

15 50 60 300 36.8 38.5 15.7

a) Concentration of sample for NO production inhibitory activity : 10 µg/mL b) Concentration of sample for DPPH free radical scavenging activity : 50 µg/mL Table 1. Responses for Box-Behnken Design

Extracts Yield (%)

Ultrasonic extraction

D.W 10.1

EtOH 6.5

MeOH 9.3

Hexane 1.9

EA 6.4

High-pressure extraction

D.W 7.8

EtOH 2.8

MeOH 1.6

Hexane 0.7

EA 1.6

Supercritical extraction < 0.1

Table 2. Yield of Extraction using Ultrasonic, High-pressure and Supercritical Extraction Method

3.2. 한인진의 용매별, 추출법별 추출물의 항염 활성 초음파 , 초고압, 초임계 추출법을 사용하여 100% 증류 수 , 에탄올, 메탄올, 헥산, EA 추출물을 TNF-α, IL-1β, IL-6 같은 염증성 매개 물질을 발현시키는 macrophage인 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 저해를 활성으로 항염 활 성을 확인하였다 [29,30]. 한인진의 70% 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO와 iNOS의 생성을 저해하여 항염 활성이 있 는 것으로 보고되었다 [31].

초음파 추출법으로 추출하였을 때, EA 추출물은 10 μg/mL에서 97.3 ± 1.7%, 에탄올, 메탄올 추출물은 25 μg/mL에서 각각 97.3 ± 2.0%, 87.4 ± 2.6%의 NO 생성 저 해 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다 . 반면에 증류수 추출물은 고농도인 25 μg/mL에서도 5% 이하의 NO 생성 저해 활성을 보이는 것을 관찰하였다 . EA 추출물은 고농 도인 25 μg/mL에서 세포 생장률이 90% 미만으로 나타나 세포 독성을 보였고 그 이하 농도인 10 μg/mL, 5 μg/mL에 서는 세포 독성을 보이지 않았다 . EA를 제외한 증류수, 에 탄올 , 메탄올, 헥산 추출물에서는 모든 농도에서 세포 독 성이 없는 것으로 나타났다 (Figure 1).

초고압 추출법을 이용한 추출물에서는 증류수 추출물을 제외한 유기 용매 추출물에서 높은 NO 생성 저해 활성을 확인 할 수 있었다 . 에탄올과 메탄올 추출물은 저농도인 5 μg/mL에서 각각 82.7 ± 1.3%, 80.8 ± 2.6%의 저해율을 보 였다 . 특히 EA 추출물은 모든 농도에서 90%가 넘는 NO 생성 저해 활성을 보여 가장 뛰어난 항염 활성을 보였다 . 모든 용매의 한인진 초고압 추출물에서는 세포 독성을 보 이지 않았다 (Figure 1).

한인진 초임계 추출물의 세포 독성 시험을 진행하였을 때 , 0.25 μg/mL에서 80.5±5.2%의 세포 생장률을 보여 그 이하의 농도에서 NO 생성 저해 활성 시험을 진행하였다.

0.01, 0.05, 0.1 μg/mL의 농도에서 각각 23.2 ± 1.9%, 70.5 ± 4.2%, 91.8 ± 1.4%의 NO 생성 저해 활성 활성을 보였고 세포 독성은 나타나지 않았다 (Figure 1).

3.3. 한인진의 용매별, 추출법별 추출물의 항산화 활성 빠르고 간단하게 안정적인 free radical을 이용해서 항산 화 활성을 확인할 수 있는 DPPH 실험으로 한인진의 각 용 매별 , 추출법별 추출물의 항산화 활성을 확인하였다[31,32].

한인진의 물 , 메탄올, 에탄올 추출물의 DPPH free radical 소거 활성을 비교하였을 때 메탄올 , 에탄올, 물 추출물 순 으로 활성이 좋았다고 보고되어 있다 [3].

초음파 추출법을 이용하였을 때 , 헥산 추출물은 모든 농 도에서 항산화 활성이 없는 것으로 나타났고 EA 추출물도 고농도인 100 μg/mL에서 11.2 ± 2.4%의 활성을 보여 DPPH free radical 소거 활성이 낮은 것을 확인하였다. 에탄올과 메탄올 추출물은 50 μg/mL에서 각각 20.0 ± 2.6%, 24.0 ± 0.9%의 소거능을 보였고 100 μg/mL에서 53.9 ± 1.1%, 55.0

± 6.0%의 소거능을 보여 다른 용매 추출물보다 좋은 항산

iwayomogi ultrasonic extracts (1), high-pressure extracts (2) and supercritical extracts (3) in LPS-induced RAW 264.7 cells.

Extraction solvents were used distilled water (A), ethanol (B), methanol (C), hexane (D) and ethyl acetate (E). Negative control was only 100 ng/mL LPS treated cells and positive control was treated by 10 μg/mL dexamethasone. The data represent the mean ± SD of triplicate experiments; ^*p < 0.05,

**p < 0.01.

화 활성을 보였다 (Figure 2).

초고압 추출물 중에서는 에탄올과 메탄올 추출물이 가 장 좋은 항산화 활성을 보였고 EA 추출물은 모든 농도에 서 1% 미만의 활성을 보였으며 헥산 추출물은 100 μg/mL 에서 14.4 ± 0.1%의 활성을 보여 항산화 활성이 낮은 것을 관찰하였다 (Figure 2).

한인진의 초임계 추출물로 항산화 활성을 확인하였을 때 , 고농도인 100 μg/mL에서 4.4 ± 0.3%의 DPPH free radical 소거 활성을 보임으로 항산화 활성이 낮은 것을 확 인하였다 (Figure 2).

3.4. 반응표면분석법을 이용한 수율과 항염, 항산화 복합 활성의 최적 추출 조건 분석

한인진을 증류수 , 에탄올, 메탄올, 헥산, EA 용매별로 초음파 , 초고압 추출을 진행하였을 때와 CO

를 이용한 초 임계 추출법을 사용하여 추출하였을 때의 수율과 NO 생성 저해 활성 , DPPH free radical 소거능 활성을 확인하였다 (Figure 1,2). 추출법을 비교하면 전체적인 활성은 초고압 추출법이 초음파 추출법보다 우수하지만 수율을 고려하였 을 때 , 최대 5배까지도 차이가 나는 것으로 보아 초음파 추출법을 이용하는 것이 가장 효율적일 것으로 사료된다 (Table 2). 용매를 비교해보면 NO 생성 저해 활성은 EA 추 출물이 가장 뛰어나나 항산화 활성은 낮은 것을 확인하였 다 . 에탄올과 메탄올 추출물이 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능 활성을 보였으나 안전성을 고려 하였을 때 에탄올이 가장 적합하다고 판단하여 이후 실험 은 에탄올과 초음파 추출법을 이용하여 진행하였다 .

최적 추출 조건을 분석에 변수는 에탄올의 농도 (X

), 추 출 시간(X

,), 출력량(X

)으로 설정하고 각 조건에 맞는 수 율 (Y

)

NO 생성 저해 활성(Y

)과 DPPH free radical 소거 활성 (Y

)에 대한 결과 값을 얻었다(Table 1). 이를 바탕으 로 , 수율(Y

)과 NO 생성 저해 활성(Y

)과 DPPH free radical 소거능 (Y

)가 복합적으로 뛰어난 최적 추출 조건을 반응표 면분석법을 이용하여 확립하고자 하였다 .

3.4.1. 수율 최적 추출 조건

수율 (Y

)이 높은 최적 추출 조건에 대하여 반응표면분석 법으로 확인한 결과 아래와 같은 회귀 다항식을 얻었다 .

Y1=15.690-1.409X1+0.397X2+0.369X3+0.205X1X2+1.380X2X3+ 1.153X1X3-3.721X12-2.014X22-2.696X32

R

값은 0.9467이며, adj-R

값은 0.8508로 나타났다. 가 장 영향을 많이 미치는 요인으로는 에탄올의 농도와 출력 량의 이차항(X

, X

)이며, 선형의 에탄올의 농도와 추출 시간의 이차항(X

, X

)이 그 다음으로 영향을 미치는 것 으로 나타났다. 90%의 유의성을 고려하였을 때, 다항식은 아래와 같다 (Table 3).

Y1=15.690-1.409X1+1.380X2X3+1.153X1X3-3.721X12- 2.014X22-2.696X32

ANOVA를 수행하였을 때, 전체 모형의 F-value는 9.87로 높고 p-value는 0.011로 낮은 결과 값을 보여 유의성이 있

iwayomogi ultrasonic extracts (1), high-pressure extracts (2) and supercritical extracts (3). Extraction solvents were used distilled water (A), ethanol (B), methanol (C), hexane (D) and ethyl acetate (E). Positive control was treated by 10 ㎍/mL Ascorbic acid. The data represent the mean ± SD of triplicate experiments; ^*p < 0.05, ^**p < 0.01.

다고 판단하였다 . 에탄올의 농도와 출력량(X

X

)

추출 시 간과 출력량 (X

X

)의 F-value가 각각 4.17, 5.99의 값을 보 이므로 상호작용한다고 판단하였다 (Table 4).

최대치의 수율을 얻으려면 45.71%의 에탄올과 63.33 min의 추출 시간, 308.84 W 출력량의 최적 조건을 만족해 야 한다는 통계치를 얻어냈고 수율 예측 값은 15.85%였다.

위와 같은 조건으로 직접 실험을 진행한 결과 , 16.40 ± 0.28%

의 수율을 얻을 수 있었고 95% 이상의 높은 유의성을 확 인하였다 (Table 9).

3.4.2. NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능 복합 활성 최적 추출 조건

NO 생성 저해 활성(Y

)과 DPPH free radical 소거능(Y

) 가 복합적으로 뛰어난 추출 조건의 최적화를 진행하였고 아래와 같은 회귀 다항식을 얻었다.

Y2=36.80+30.83X1+2.09X2+6.81X3+6.45X1X2+11.72X2X3-7.90X1X3

+8.01X12+10.84X22+13.09X32

Y3=38.50+8.48X1+3.49X2+3.21X3+1.17X1X2+5.90X2X3-8.73X1X3

-9.45X12+9.23X22+0.72X32

NO 생성 저해 활성(Y

)의 회귀 다항식 R

값은 0.9543 이며 , adj-R

값은 0.8720으로 나타났다. 특히, NO 생성 저 해 활성은 추출 시간과 출력량에 비해 에탄올 농도와 매우 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났고 에탄올의 농도가 높 으면 높을수록 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다 . DPPH free radical 소거능(Y

)의 회귀 다항식의 R

값은 0.9584이며, adj-R

값은 0.8836으로 나타났다. DPPH free radical 소거능에 선형의 에탄올 농도(X

)가 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며 에탄올 농도 , 추출 시간의 이차 항 (X

, X

)과 에탄올의 농도와 출력량의 상관관계(X

X

) 가 밀접한 관련이 있음을 p-value로 확인하였다. 90%의 유 의성을 고려하였을 때 , 다항식은 아래와 같다(Table 5,7).

Y2=36.80+30.83X1-7.90X1X3+10.84X22+13.09X32

Coefficient SE Coefficient T-value p-value Constant 15.690 0.651 24.09 0.000 X1 (EtOH conc.) -1.409 0.399 -3.53 0.017 X2 (Time) 0.397 0.399 1.00 0.365 X3 (Power) 0.369 0.399 0.92 0.398

X12 -3.721 0.587 -6.34 0.001

X22 -2.014 0.587 -3.43 0.019

X32 -2.696 0.587 -4.59 0.006

X1X2 0.205 0.564 0.36 0.731

X1X3 1.153 0.564 2.04 0.096

X2X3 1.380 0.564 2.45 0.058

Table 3. Regression Coefficients for Yield

Source DF Adj SS Adj MS F-value p-value Model 9 113.062 12.5624 9.87 0.011 Linear 3 18.228 6.0762 4.77 0.063 X1 (EtOH conc.) 1 15.877 15.8766 12.48 0.017 X2 (Time) 1 1.264 1.2641 0.99 0.365 X3 (Power) 1 1.088 1.0878 0.85 0.398 Square 3 81.734 27.2448 21.41 0.003 X12 1 51.130 51.1300 40.18 0.001 X22 1 14.973 14.9730 11.77 0.019 X32 1 26.842 26.8422 21.09 0.006 2-Way Interaction 3 13.099 4.3662 3.43 0.109 X1X2 1 0.168 0.1681 0.13 0.731 X1X3 1 5.313 5.3130 4.17 0.096 X2X3 1 7.618 7.6176 5.99 0.058 Error 5 6.363 1.2726

Lack of Fit 3 6.363 2.1210 Pure Error 2 0.000 0.0000

Total 14

Table 4. Analysis of Variance for Yield

Coefficient SE Coefficient T- value p-value

Constant 36.80 5.68 6.47 0.001

X1 (EtOH conc.) 30.83 3.48 8.86 0.000 X2 (Time) 2.09 3.48 0.60 0.575 X3 (Power) 6.81 3.48 1.96 0.108

X12 8.01 5.12 1.56 0.179

X22 10.84 5.12 2.12 0.088

X32 13.09 5.12 2.55 0.051

X1X2 -6.45 4.92 -1.31 0.247

X1X3 -7.90 4.92 -1.60 0.169

X2X3 11.72 4.92 2.38 0.063

Table 5. Regression Coefficients for NO Production Inhibitory Activity

Y3=38.50+8.48X1+3.49X2+3.21X3+5.90X2X3-8.73X1X3-9.45X12

+9.23X22

ANOVA를 수행하였을 때, NO 생성 저해 활성의 전체 모형의 F-value는 11.60, p-value는 0.007 이였으며, DPPH free radical 소거능의 전체 모형의 F-value는 12.80, p-value

는 0.006으로 F-value는 높고 p-value는 낮은 결과 값을 보 여 유의성이 있다고 판단하였다 . NO 생성 저해 활성의 경 우 , 추출 시간과 출력량(X

X

)의 F-value가 각각 5.67의 값 을 보이므로 상호작용한다고 판단하였고 에탄올의 농도 (X

)의 F-value가 78.44로 NO 생성 저해 활성에 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다 (Table 6). DPPH free radical 소거 능을 보면 , 에탄올의 농도와 출력량(X

X

), 추출 시간과 출 력량 (X

X

)의 F-value가 각각 18.43, 8.43으로 서로 상호작 용 하는 것을 확인하였고 에탄올의 농도(X

), 추출 시간 (X

), 출력량(X

)이 모두 DPPH free radical을 소거하는 데 큰 영향을 미치는 것으로 보인다 (Table 8).

NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능이 복합 적으로 뛰어난 추출 조건은 80.81% 에탄올, 90.00 min의 추출 시간 , 400.00 W 출력량임을 얻었고 NO 생성 저해 활 성과 DPPH free radical 소거능의 예측 값은 각각 94.54%, 58.03%로 나타났다. 위의 조건으로 실험한 결과, NO 생성 저해 활성은 89.77 ± 1.37%, DPPH free radical 소거 활성은 60.12 ± 0.39%로 나타났고 예측 값과 유사한 결과를 얻을 수 있었다 (Table 5,6).

최적 추출 조건의 한인진 추출물 10 μg/mL의 NO 생성 저 해 활성은 positive control로 사용한 10 μg/mL의 dexamethasone 의 NO 생성 저해 활성 대비 90%의 효과를 보였고 10 μg/mL

Model 9 10113.3 1123.70 11.60 0.007 Linear 3 8007.6 2669.20 27.54 0.002 X1 (EtOH conc.) 1 7601.4 7601.45 78.44 0.000 X2 (Time) 1 34.9 34.86 0.36 0.575 X3 (Power) 1 371.3 371.28 3.83 0.108 Square 3 1139.7 379.91 3.92 0.088 X12 1 237.0 237.05 2.45 0.176 X22 1 433.7 433.67 4.47 0.088 X32 1 632.4 632.43 6.53 0.051 2-Way Interaction 3 966.0 321.98 3.32 0.115 X1X2 1 166.4 166.41 1.72 0.247 X1X3 1 249.6 249.64 2.58 0.169 X2X3 1 549.9 549.90 5.67 0.063 Error 5 484.6 96.91

Lack of Fit 3 484.6 161.52 Pure Error 2 0.0 0.00

Total 14 10597.8

Table 6. Analysis of Variance for NO Production Inhibitory Activity

Coefficient SE Coefficient T-value p-value

Constant 38.50 2.35 16.41 0.000

X1 (EtOH conc.) 8.48 1.44 5.90 0.002 X2 (Time) 3.49 1.44 2.43 0.060 X3 (Power) 3.21 1.44 2.24 0.076

X12 -9.45 2.12 -4.47 0.007

X22 9.23 2.12 4.36 0.007

X32 0.72 2.12 0.34 0.746

X1X2 1.17 2.03 0.58 0.588

X1X3 -8.73 2.03 -4.29 0.008

X2X3 5.90 2.03 2.90 0.034

Table 7. Regression Coefficients for DPPH Free Radical Scavenging Activity

Source DF Adj SS Adj MS F-value p-value Model 9 1903.38 211.487 12.80 0.006 Linear 3 754.47 251.489 15.22 0.006 X1 (EtOH conc.) 1 574.61 574.605 34.79 0.002 X2 (Time) 1 97.30 97.301 5.89 0.060 X3 (Power) 1 82.56 82.561 5.00 0.076 Square 3 699.65 233.216 14.12 0.007 X12 1 329.73 329.732 19.96 0.007 X22 1 314.22 314.218 19.02 0.007

X32 1 1.94 1.941 0.12 0.746

2-Way Interaction 3 449.27 149.755 9.07 0.018

X1X2 1 5.52 5.522 0.33 0.588

X1X3 1 304.50 304.502 18.43 0.008 X2X3 1 139.24 139.240 8.43 0.034

Error 5 82.59 16.519

Lack of Fit 3 82.59 27.531 Pure Error 2 0.00 0.000

Total 14 1985.97

Table 8. Analysis of Variance for DPPH Free Radical Scavenging Activity

Figure 4. Contour plot and surface plot of responses of yield (1), NO production inhibitory activity (2) and DPPH radical scavenging activity (3).

에서 5.9 ± 3.2%의 NO 생성 저해 활성을 보인 aspirin에 비해서 는 15배 이상 좋은 활성을 보이는 것으로 나타났다(Figure 3).

3.5. 한인진 초음파 추출물의 유효 성분의 구성 한인진의 sesquiterpene과 flavonoid 계열의 화합물이 항 염과 항산화 효과가 있는 것으로 보고되어왔다 [8,9,10]. 한 인진 초음파 추출물의 유효 성분을 예측하기 위해 총 플라 보노이드 함량 평가를 진행하였다 . NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능이 모두 뛰어난 에탄올과 메탄올 추출 물에서 각각 138.77 ± 9.22, 125.74 ± 3.33 catechin hydrate μg/mg로 높은 함량을 보였다(Table 10). 항염과 항산화 활성 이 뛰어난 최적 추출물을 HPLC로 분석한 결과, retention time 24.102 min의 major peak를 확인할 수 있었고 217, 326 nm의 UV λ

보임으로 플라보노이드 계열로 예측하였다

(Figure 5)[33,34]. 이를 바탕으로 에탄올 추출물의 유효 성분 을 플라보노이드로 예측하였다. 그러나 항염 활성이 뛰어 났던 EA 추출물의 총 플라보노이드 함량이 19.85 ± 3.89 catechin hydrate μg/mg으로 상대적으로 낮은 플라보노이드

Optimized condition Composite desirability

(D)

Actual Values

Predicted values

Predictive capacity EtOH (%) Time (min) Power (W) (%)

Yield (%) 45.71 63.33 300.84 1.00 16.40 ± 0.28 15.85 103.5

NO production inhibitory

activity (%) 80.81 90.00 400.00 0.99 89.77 ± 1.37 ^a 94.54 95.0

DPPH free radical

scavenging activity (%) 80.81 90.00 400.00 0.93 60.12 ± 0.39 ^b 58.03 103.6 a) Concentration of sample for NO production inhibitory activity : 10 µg/mL

b) Concentration of sample for DPPH free radical scavenging activity : 50 µg/mL Table 9. Predicted and Observed Values of Responses under Optimized Condition

Extracts Total flavonoid content (catechin hydrate μg/mg)

DW 26.91 ± 2.56

EtOH 138.77 ± 9.22

MeOH 125.74 ± 3.33

Hexane N.D.

EA 19.85 ± 3.89

N.D. is not dectection. N.D. < 0.1 catechin hydrate µg/mL Table 10. Total Flavonoid Content of Ultrasonic Extracts

Figure 3. The NO production inhibitory activity of optimized extraction condition in LPS-induced RAW 264.7 cells. Negative control was only 100 ng/mL LPS treated cells. Dexamethasone and aspirin were treated 10 μg/mL to each well. The data represents the mean ± SD of triplicate experiments; ; ^*p < 0.05, ^**p < 0.01.

Figure 5. HPLC chromatogram of optimized extraction condition for NO production inhibitory activity and DPPH radical scavenging activity (1) and UV spectrum of peak a (2). Peak a for 24.102 min was shown major peak. λmax of peak a was detected 217 and 326 nm.

함량을 보인 것을 고려하였을 때 , EA 추출물의 NO 생성 저해 활성에 영향을 주는 화합물은 플라보노이드가 아닌 다른 계 열의 화합물들일 것으로 예상하였다 (Table 11). 이러한 한인진 의 유효 성분을 분리 , 분석에 관한 후속 연구가 필요하다.

4. 결 론

본 연구에서는 한인진 (A. iwayomogi)의 수율과 NO 생성 저해 활성으로 항염 활성과 DPPH free radical 소거능 활성 으로 항산화 활성이 뛰어난 추출 용매와 추출법을 확인하 고 더 나아가 반응표면분석법 (RSM)을 활용해 수율이 높고 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능이 복합적 으로 뛰어난 최적 추출 조건을 확인하였다 .

최적 추출 용매와 추출 공정을 선정하기 위해 증류수 , 에탄올 , 메탄올, 헥산, EA를 추출 용매로 하여 초음파, 초 고압 추출법과 CO

를 이용한 초임계 추출법을 비교하였다 . 최적 추출 용매를 선정하는 데 있어서 수율이 가장 뛰어난 용매는 증류수였으나 , 각 활성이 좋지 않았으며 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능이 모두 좋은 용매는 에탄올과 메탄올이었다 . 최적 추출 용매는 활성과 수율, 안전성을 고려하여 메탄올보다 에탄올이 적합하다고 판단 하여 에탄올을 추출 용매로 선정하였다 . 최적 추출 공정을 선정하는 데 있어 항산화 , 항염 활성을 보면 전체적으로 초고압 , 초음파, 초임계 추출법 순으로 활성이 좋았다. 초 임계 추출법은 수율이 0.1% 미만으로 나타났고 초고압 추 출법이 초음파 추출법보다 약간 높은 활성을 보였으나 수 율이 초음파 추출법이 최대 5배 정도 높게 나타났으므로 초음파 추출법으로 이후 최적화를 진행하였다 .

반응표면분석법으로 최적화를 진행한 결과 , 수율은 45.71%의 에탄올과 63.33 min의 추출 시간, 308.84 W의 출 력량에서 15.85%의 수율을 예측하였고 이 조건에서 실제 수율은 16.40 ± 0.28%임을 확인하였다. NO 생성 저해 활 성과 DPPH free radical 소거능이 복합적으로 뛰어난 최 적 추출 조건은 80.81% 에탄올, 90.00 min의 추출 시간, 400.00 W의 출력량을 얻었고 NO 생성 저해 활성과 DPPH free radical 소거능의 예측 값은 각각 94.54%, 58.03%이였 으며 실제 값은 89.77 ± 1.37%, 60.12 ± 0.39%였다. 반응표 면분석법을 이용한 한인진 (A. iwayomogi)의 최적 추출 조 건의 예측치와 실측치가 비슷하다는 결과를 얻었으므로 최적 추출 조건이 실제 활용 될 수 있음을 확인하였고 수 율과 NO 생성 저해 활성 및 DPPH free radical 소거능의 초음파 최적 추출 조건을 확립하였다. 다른 용매에 비해

에탄올을 이용한 초음파 추출물에서의 총 플라보노이드 함량이 가장 높았고 , 최적 추출물의 HPLC chromatogram으 로 major peak가 플라보노이드 특징을 보여 유효 성분을 플라보노이드 계열의 화합물로 예측 되지만 , 이에 관한 유 효 성분 분리, 분석에 관한 후속 연구가 필요하다.

Acknowledgement

본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원이 지 원하는 광역협력권산업 육성사업(P0002186)으로 수행된 연 구결과입니다

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