□ 종 설 □ 대한소화기학회지 2002;39:243 - 247
서 론l
1)게놈 프로젝트(genome project)의 결과 사람을 포함한 여 러 생명체의 전체 유전자가 밝혀졌다. 현재는 이를 이어 게 놈을 이루는 여러 유전자의 기능 및 조절기전을 규명하는 것에 주안점을 둔 연구가 많이 진행되고 있어 소위 게놈 후 시기(postgenomic period)로도 불리고 있다. 따라서 최근에 는 이를 위한 많은 새로운 접근 방법과 연구 방법들이 개발 되었으며, 기존의 방법들도 새로운 개념에서 적용되고 있 다. 세포의 표현형 및 기능은 게놈 DNA에 의하여 직접 결 정된다고 보기는 어렵다. 그 이유는 게놈 DNA에 포함된 유전 정보는 중간의 RNA를 거쳐서 기능을 수행하는 단백 질의 형태로 변화되어야만 비로소 기능을 발현하기 때문이 다. 이러한 의미에서 유전자의 최종 산물인 단백질을 연구 하는 것은 유전자의 기능을 규명하기 위한 매우 매력적인
접수: 2002년 3월 8일
연락처: 엄창섭, 136-705, 서울특별시 성북구 안암동 5가 126-1 고려대학교 의과대학 유전병연구소
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접근 방법이다. 더욱이 최근에 이루어진 단백질 분리, 질량 분석, 생물정보학 분야의 급속한 발전으로 프로테오믹스 (proteomics)는 단백질의 연구 기법으로 매우 주목받고 있다.
프로테오믹스란 Marc Wilkins 등이 명명한 세포, 조직, 생명체 단위의 게놈에 의하여 생성되는 단백질 전체를 의 미하는 프로테옴(proteome, set of PROTEins encoded by the genOME)을 이해하고자 하는 새로운 학문 분야로 넓은 의미에서 보면 유전자의 최종 발현산물에 대한 대량 동정 및 기능 분석과 이를 위한 프로테옴 연구 방법을 그 주된 대상으로 하고 있다.1 즉 프로테오믹스에는 단백질의 분리 에 필요한 이차원 전기영동, 단백질의 확인 동정에 필요한 질량분석, 단백질의 상호작용을 이해하기 위한 효모 이중 하이브리드계(yeast two-hybrid system), 단백질의 구조 이 해에 필요한 구조 유전체학, 그리고 단백질 자체의 구조를 연구하는 구조 프로테오믹스 등이 포함된다. 그러나 유전 자나 mRNA에 대한 연구와 생물정보학 등은 프로테오믹스 의 연구를 위하여 활용되고는 있으나 별도의 분야로 간주 되는 경향이다.2
단백질의 대량 동정을 위하여 프로테오믹스에서 주로 이 용하는 연구 방법은 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 첫 번
Helicobacter pylori 연구에서 프로테오믹스의 응용
고려대학교 의과대학 내과학교실, 소화기연구소, 유전병연구소*
전훈재·엄창섭*·이상우·현진해
Proteomics Approach in Helicobacter pylori Researches
Hoon Jai Chun, M.D., Chang-Sub Uhm, M.D.*, Sang Woo Lee, M.D., and Jin Hai Hyun, M.D.
Department of Internal Medicine, Institute of Digestive Disease and Nutrition, Institute of Human Genetics*, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea
Proteomics is a study of the proteome that is the whole set of proteins expressed by cell, tissue, or organism. Main techniques of proteomics are proteome separation by two-dimensional electrophoresis, interpretation of separated proteome by staining, image acquisition and analysis, protein excision, and protein identification by mass spectrometry. Results obtained by proteome analysis are used in researches related to the strain fingerprinting, the protein composition, the gene regulation, and the protein-protein interaction. In this review, we introduce how proteomics can be used for Helicobacter pylori researches. (Korean J Gastroenterol 2002;39:243-247)
Key Words: Helicobacter pylori, Proteome, Proteomics
대한소화기학회지: 제39권 제4호, 2002
째 방법은 고전적 프로테옴 연구 방법으로 이차원 전기영 동, MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)-TOF (time of flight)-MS (mass spectrometry), 자동 스폿절제(robot spot excision), FPLC 및 HPLC, 화상 스캐닝 및 자료 관리 등이 포함된다. 이러한 방법은 조직이나 균주로부터 발현 되는 단백질을 분리, 정제 및 확인하는 데 주로 응용되고 있으며, 최근 발달된 컴퓨터와 생물정보학의 도움으로 단 백질의 대량 분석이 가능하게 되었다. 두 번째 방법은 소위 기능적 프로테옴 연구 방법으로 분류할 수 있으며 이는 고 전적 프로테옴 연구 방법에 의하여 확인된 단백질의 기능 을 분석하는 것을 말한다. 여기에는 세포의 기능에 관한 연 구 방법, 대사 및 신호경로에 관한 생화학적 연구 방법 등 이 포괄적으로 포함된다. 이러한 기능적 프로테오믹스는 앞 으로 그 중요도 및 활용도가 더욱 증가될 것으로 생각된다.
본고에서는 현재까지 보고된 문헌을 중심으로 Helicobacter pylori (H. pylori) 연구에서 프로테오믹스의 응용을 살펴보 고 추후의 전망을 고찰하고자 한다.
H. pylori 균주간 변이 연구
프로테오믹스를 적용하여 현재 연구가 가장 많이 진행되 어 있는 분야는 분리된 다양한 H. pylori 균주의 차이를 확 인하려는 시도이다. 이 분야의 연구가 가장 진전된 이유는 프로테오믹스에서 사용되는 기법들을 이용하면 실제로 발 현되는 단백질에 대한 대량의 정보를 얻을 수 있기 때문이 다. 즉 이를 이용하면 역으로 해석이 일어나는 유전자를 확 인할 수 있을 뿐만 아니라, 해독 후 변형(post-translational modification)에 관한 정보도 알 수 있으므로 여러 균주의 H.
pylori 사이에 존재하는 다양성 및 변이를 확인할 수 있다.
이러한 프로테옴 프로필을 얻기 위하여 가장 일반적으로 사용되는 방법들은 이미 기존에 이용되어 오던 방법들을 개선하여 응용하고 있으므로 고전적 프로테옴 연구 방법으 로 분류되고 있다.
이들 방법이 실제 연구에 적용되는 과정을 간략히 설명 하면 다음과 같다. 우선, 배양된 H. pylori로부터 단백질을 추출한 후, 이차원 전기영동을 이용하여 단백질을 분자량 (molecular weight)과 등전점(isoelectric point, pI)에 따라 분 리한다. 분리된 단백질은 자기방사법(autoradiography), 여러 종류의 염색, 면역흡입(immunoblotting) 등의 방법을 사용 하여 이차원 전기영동상을 얻고,3 화상 분석(image analysis) 을 시행함으로써 분리된 단백질의 양, 스폿의 위치를 확인 한다. 나아가 이들 이차원 전기영동상을 데이터 베이스로 구축하고, 기준이 되는 전기영동상과 비교함으로써 종간 의 프로테옴의 패턴 등을 분석하여 의미 있는 단백질 스 폿을 확인한다. 목표하는 단백질 스폿을 선택한 후 절취하
여 MALDI-TOF-MS, tandem mass spectrometry 등의 mass spectrometry를 이용하여 분리된 단백질의 질량, 펩티드 조 각의 확인(peptide fragment fingerprint), 서열 분석(peptide sequencing), 해독 후 변형 위치 등을 결정한다. 또한, 얻어 진 아미노산 서열을 알려진 단백질 데이터 베이스와 비교 하여 단백질의 종류를 확인한다.4
H. pylori 26695와 J99의 경우에는 현재 게놈의 서열 분 석이 완료되어 있다. 따라서 이들 유전자로부터 생성될 수 있는 모든 가상 단백질을 예측할 수 있으므로 분석된 펩티 드 서열과 비교하면 이론적으로 분석된 단백질이 어떠한 유전자로부터 생성된 것인지를 확인할 수 있다.5 이러한 분 석 기법의 가장 중요한 요건은 게놈의 완벽한 서열에 대한 자료가 데이터 베이스로 구축되어 있어야 한다는 것이다.
그러나 게놈의 서열 분석이 완성되지 못한 H. pylori 균주 에서 이차원 전기영동을 시행하여 얻어진 자료도 이미 알 려져 있는 균주의 정보와 비교하면 상당한 수준의 부분 동 정이 가능하다.
Jungblut 등6은 게놈의 서열이 밝혀진 두 종류의 H. pylori 와 생쥐에 적응시킨 실험용 균주인 Sydney strain (SS1)을 배양하여 이차원 전기영동으로 분석한 결과 26695균주에서 1863개, J99균주에서 1622개, 그리고 SS1균주에서 1448개 의 단백질 스폿을 각각 확인하였다. 그리고 26695균주로부 터 얻어진 152개 단백질에 대하여 MALDI-MS 분석을 시 행하고 이들이 126개의 ORF (open reading frame)에서 생 성된 것임을 보고하였다.
이러한 접근 방법을 활용하면 여러 환자에게서 분리된 H. pylori나 실험실에서 배양하고 있는 균주 사이에서 프로 테옴에 어떠한 차이가 있는지를 확인할 수 있으며, 이를 통 하여 균주를 동정하거나 이들에게서 발생된 변이를 확인할 수 있다. 특히 H. pylori는 균주 간의 차이가 심하고, 이들에 의하여 유발되는 질환도 인종 및 개체에 따라 다양하게 나 타나므로 환경인자, 숙주인자 및 세균인자가 H. pylori의 병 태생리에 어떻게 작용하는지에 대한 정확한 기전이 설명되 지 못하고 있다. 그러므로 게놈과 프로테옴의 대량 분석은 특정 질환과 관련된 H. pylori의 공통적인 독성인자의 확인 및 질환 발생 과정의 이해에 많은 도움이 될 것으로 평가되 고 있다.7
H. pylori 의 단백질 상호작용 지도 작성
세포 내에서 한 종류의 단백질이 독자적으로 작용하는 경우는 거의 없으며 대부분은 일과성 복합체 또는 안정적 인 복합체를 구성하여 일정한 경로 속에서, 혹은 서로 기능 적으로 연결된 망 속에서 작용하게 된다. 따라서 단백질 간 의 상호작용은 세포의 정상적인 기능 수행을 위하여 가장 244
전훈재 외 3인. Helicobacter pylori 연구에서 프로테오믹스의 응용
기본적인 요건이라 할 수 있으며, 이들 상호작용을 이해하 는 것이 단백질 자체의 기능 이해에 필수적이다. 대량의 단 백질을 대상으로 한 단백질 상호작용에 관한 연구가 가능 해진 것은 파스퇴르연구소의 Fromont-Racine 등8의 연구 결 과에 힘입은 바 크다. 이들은 효모의 전체 게놈을 대상으로 high-throughput 연구를 수행할 수 있도록 개선한 효모 이중 하이브리드계를 개발하고, 이를 이용하여 세포 전체의 단 백질 상호작용 지도(protein interaction map, PIMs)를 제작 하였는데, 현재까지는 전체 게놈을 대상으로 한 프로테옴 지도의 작성에 가장 좋은 방법으로 평가받고 있다.
이를 이용한 단백질 상호작용에 관한 최초의 구체적 연 구 결과는 Rain 등9이 H. pylori 26695의 게놈 서열에서 얻 어진 정보를 사용하여 작성한 단백질 상호작용 지도이다.
이러한 결과는 원핵생물(prokaryotes)에서 가장 먼저 얻어 진 방대한 단백질 상호작용에 대한 분석으로 그 의미가 매 우 크다. 또한 이들의 접근 방법은 다른 종류의 세균에서 단백질 상호작용을 연구하는 데에도 참고할 만한 기준을 제시하였다는 평가를 받고 있다. 이 논문에서 연구자들은 261개의 미끼(bait) 단백질과 H. pylori 26695의 게놈에서 얻어진 단백질과의 상호작용을 검증하여 H. pylori 단백질 사이에서 이루어지는 1,200종 이상의 상호작용을 확인하였 다. 그 결과 현재까지 알려져 있는 약 1,600종의 H. pylori 단백질의 약 반인 46.6%의 단백질을 연결하는 단백질 상호 작용 지도를 작성하였다. 이들은 상호작용이 일어나는 단 백질에서 공통적으로 작용하는 부분을 찾아 선별 상호작용 도메인(selected interacting domain, SID)이라 이름하고, 이 들 간에 일어나는 특이적인 상호작용의 정도에 따라 단백 질 상호작용 지도 생물학적 점수(protein interaction map biological scores, PBS)를 부여하였다. PBS는 프로테옴을 이루는 단백질을 생물학적 기능별로 분류하는 데 사용된다.
프랑스의 Hybrigenics사는 이 연구 결과를 활용할 수 있는 PIM Rider라는 web-based software tool을 개발하였는데, 이 를 이용하면 PIM과 SID에 대한 내용을 검색할 수 있다 (http://pim.hybrigenics.com/). PIM Rider는 사용권을 취득 한 후 이용이 가능하며, 교육기관에 근무하는 사람에게는 Hybrigenics사 홈페이지에서 무료로 제공하고 있다.
현재까지는 한국에서 이와 유사한 시도가 보이지 않고 있으나, 국내에서 분리한 H. pylori 균주에 대한 게놈 정보 가 마련되고, 생물정보학적 기법을 적용하여 한국에서도 이와 유사한 데이터 베이스의 구축이 가까운 장래에 이루 어지기를 기대한다.
H. pylori 의 병인 연구
최근 H. pylori의 독성인자로 알려진 여러 가지 인자들
의 세포내 동정에 관한 연구에 프로테오믹스를 응용한 시 도가 많은 주목을 받고 있다. 탐식세포에 H. pylori를 감염 시킨 후 30, 38, 40 kDa의 티로신 인산화 단백질(tyrosine- phosphorylated protein)이 새로 출현됨을 확인한 보고가 있으며,10 MALDI-MS와 이차원 전기영동 및 면역흡입 (immunoblotting)을 시행하여 탐식세포 내에 존재하는 CagA 단백질은 온길이(full length), 카르복실 말단 조각(C-terminal fragment) 및 아미노 말단 조각(N-terminal fragment) 등의 3 가지 형태로 존재한다고 하였다. 여러 종류의 H. pylori 감 염 후 위상피세포 내에 존재하는 티로신 인산화 CagA를 이 차원 전기영동과 면역흡입을 통하여 확인한 결과, P12, P227, G27 및 26695에서는 3곳의 가상 티로신 인산화 모티 프(motif) 중 1곳 혹은 2곳에서 티로신 인산화가 일어나지 만 J99의 경우에는 어느 곳에서도 티로신 인산화가 일어나 지 않음도 보고되었다.11 이 논문에서 연구자들은 아미노 말단 조각을 가지고 있지 않는 균주도 있음을 관찰하여 균 주에 따라 cagA 단백질의 전좌(translocation), 티로신 인산 화, 크기의 변화 등에 차이가 있고 이러한 차이가 위장관질 환의 발생과 연관될 가능성이 있다고 주장하였다.
Metronidazole에 저항성을 지닌 H. pylori 26695 변종 (HP0954, rdxA 돌연변이 균주)을 대상으로 이차원 전기 영동과 MALDI-MS 분석을 실시한 결과, 여러 세포에서 산소 독성에 대한 저항성과 연관이 있는 것으로 알려진 alkylhydroperoxide reductase의 동형(isoform)이 증가함을 발견하여 이를 metronidazole에 대한 저항성의 원인으로 제 시한 보고도 있다.12 이 연구는 프로테옴의 분석을 통하여 H. pylori가 치료 약물이나 숙주의 반응에 어떻게 대응하는 지를 보다 정확하게 밝혀 낼 수 있는 가능성을 제시한 논문 으로 평가되고 있다.
또한 고전적인 프로테옴 연구 방법과 기능적인 프로테옴 연구 방법을 병용하여 활용함으로써 분리가 용이하지 않은 극미량의 H. pylori 단백질을 동정하여 각종 연구에 응용하려 는 노력도 시도되고 있다. Larsson 등13은 Leb-glycoconjugate 를 사용하여 BabA adhesin을 표지한 후 bead를 사용하여 농축하고 SDS-PAGE를 실시하여 단백질을 분리하였다. 분 리된 단백질을 MALDI-TOF-MS 분석을 하여 펩티드 서열 을 알아내고 MS 데이터 베이스(http://prospector.ucsf.edu) 검색을 실시하여 분리된 단백질의 종류를 확인하였다. 이 연구에서는 이러한 기법을 이용하여 300 fmol의 adhesin도 분리할 수 있었다고 하였다.
현재 국내 여건에서도 고전적 프로테옴 연구 방법을 활 용한 이상과 같은 시도는 비교적 적용이 용이할 것으로 생 각되며, 서양인에서 분리된 균주와 다른 특성을 지니고 있 을 가능성이 있는 국내 H. pylori의 분리 균주에 대한 연구 에 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
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The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 39, No. 4, 2002
H. pylori 의 백신 및 신약 개발
프로테오믹스가 도입되면서 특히 많은 발전이 기대되는 분야는 신약 및 백신의 개발을 위한 새로운 표적을 탐색하 는 분야이다.
현재까지 시도되어 보고된 방법은 크게 두 가지로 대별 할 수 있다. 첫째는 H. pylori 균주에 대하여 이차원 전기영 동을 시행하고 환자의 혈청을 사용하여 이와 반응하는 면 역원(immunogen)을 발굴한 후 MS로 확인하는 방법이다.
H. pylori Z-170균주에 대한 이차원 전기영동과 환자의 혈 청을 이용한 Western blotting 및 확인된 단백질에 대한 MALDI-TOF-MS 분석을 통하여 20개의 면역원이 보고되 었다.14 또한 H. pylori CCUG 17874균주에 대하여 이차원 전기영동과 환자의 혈청을 이용한 면역흡입, ESI-MS/MS 서열 분석으로 아직 보고된 바 없는 새로운 면역원이 밝혀 지기도 하였다.15
두 번째의 접근 방법은 이차원 전기영동, trypsin 분해 (digestion), 펩티드의 질량 분석을 통하여 H. pylori의 막단 백질(membranous protein)을 찾는 방법이다. 이차원 전기 영동, 질량분석기 분석을 시행한 후 데이터 베이스 탐색을 통하여 약 40종의 단백질을 찾아내고, 이중 Leb-binding adhesin을 포함한 15종이 막단백질임이 확인되었으며,16 게 노믹스와 프로테오믹스의 방법을 사용하여 막단백질을 찾 아내는 방법으로 그 결과가 보고되기도 하였다.17 게노믹 스나 프로테오믹스를 활용한 H. pylori 백신 개발에 관한 자세한 현재의 연구 진행 상태에 관한 내용은 Ferrero와 Labigne18의 논문을 참고하기 바란다.
그리고 H. pylori의 감염 및 각종 질환의 진단을 위하여 도 프로테오믹스는 응용될 수 있다. 예를 들어 H. pylori의 균주간 변이를 대표하는 단백질이나 H. pylori에 의하여 발 생되는 질환의 특징적 단백질을 프로테오믹스를 이용하여 발굴한 후 단백질 칩으로 제작한다면 H. pylori의 진단 및 연구 분야에 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.
H. pylori 의 프로테옴 데이터 베이스
현재 H. pylori로부터 얻어진 프로테옴 데이터를 다양한 형태의 데이터 베이스로 구축하고 검색할 수 있도록 하려 는 노력이 활발하게 진행되고 있다. 대표적으로는 H. pylori 26695와 26695 CSN에 대한 이차원 전기영동 데이터 베이 스가 Max-Planck 연구소에서 구축되어 웹(http://www.mpiib- berlin.mp.q.de/2D-PAGE)상에서 검색이 가능하며 여기에서 는 약 1,800종의 단백질 중 약 200종을 확인할 수 있다.19 또한 해독 후 변형 등을 포함한 단백질에 관한 정보를 인터 넷상에서 검색할 수 있도록 하는 algorithm의 개발도 시도
되고 있다.20 그리고 이미 프로테옴 연구 기법에 의하여 구 축된 특정 박테리아의 단백질 상호작용 지도를 활용하여 다른 종류 유기체의 단백질 상호작용을 밝히기 위한 노력 도 진행되고 있다. 이러한 예로는 H. pylori의 단백질 상호 작용 지도를 활용하여 E. coli의 단백질 상호작용을 예측하 는 algorithm의 개발을 들 수 있다.21
이상과 같은 접근 방법은 생물정보학을 전공하는 연구자 와의 협력에 의하여 국내에서 분리된 균주에 대하여도 시 도할 만한 것으로 생각한다. 관심있는 유관 학회 등을 주축 으로 여러 연구자들의 프로테옴 자료를 모아 web상에서 서 로 공유할 수 있도록 하는 데이터 베이스를 구축하면 상호 연구의 촉진과 협동 연구를 위하여 매우 도움이 될 것이다.
결 론
단백질은 생체 내에서 이루어지는 여러 생명현상에 있어 서 실제적으로 중심적인 역할을 수행하고 있을 뿐 아니라, 진단용 표지자, 치료 약제의 표적으로 활용되고 있어 이 분 야의 연구는 특히 의약학 분야에서 매우 중요한 의미를 지 닌다.
현재까지 개개의 단백질에 관하여는 생화학 분야에서 많 은 연구가 진행되어 왔다. 그러나 프로테옴 연구 기법을 사 용하면 개개의 단백질보다는 한 세포나 조직의 단백질 전 체 집단이 갖는 의미를 분석할 수 있다. 따라서 프로테오믹 스는 여러 조건에서 서로 다르게 발현되는 수천 가지의 다 른 단백질의 발현 상태나 변화 등을 분석함으로써 H.
pylori의 성상 및 이에 의한 다양한 질환의 병태생리를 이 해하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한 이들 질환 의 진단, 치료 경과 및 예후를 예측하는 표지자와 치료 약 제의 개발에도 중요한 역할을 할 것으로 평가되므로 이에 대한 국내의 많은 연구와 관심이 요망된다.
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