1)
2008년 감염과 화학요법 40권 5호에 생화학적 방법으로 동정이 까다로운 균을 염기서열분석법으로 동정한 증례 보 고가 3편 게재되었다(1-3). 이전에는 드물게 인체 감염을 일 으키는 균에 의한 감염 증례를 보고할 때 균 동정을 확인할 수 있는 표현형 검사를 실시하는 것이 필수적이었다. 최근에 는 분자생물학적 진단 기법이 발전함에 따라 염기서열분석 법을 이용한 균 동정법이 gold standard로 등장하였지만, 신 뢰도를 확보하기 위해서는 그 제한점을 정확히 알고 사용해 야 할 것이다.
염기서열분석으로 균종 동정을 실시할 때 가장 중요한 점은 변별력을 높일 수 있는 조건들이다. 염기서열분석은 어떤 표적 유전자를 사용하느냐, 어느 정도 길이의 염기서 열을 분석하느냐에 따라 변별력이 다르다. 세균 동정에는 16S rRNA 유전자를, 진균 동정에는 internal transcribed spacer (ITS) 또는 28S rRNA 유전자의 D1/D2 부위를 이용 한 염기서열분석법이 가장 많이 이용되지만 일부 균종에서 는 이 부위의 균종간 유전자 일치도가 높아 변별력이 떨어 지기 때문에 전통적인 표현형 검사를 시행하거나 추가적인 유전자 분석이 필요하다. 예를 들어 Nocardia spp.를 포함 한 호기성 actinomycetes, mycobacteria, Streptococcus spp., Brucella spp. 등의 세균 동정에는 16S rRNA 유전자 의 염기서열분석으로는 종 수준 동정이 힘들며, Fusarium spp., Phaeoacremonium spp. 등의 진균 동정에는 각각 elongation factor-1α와 β-tubulin 유전자 부위를 사용하 는 것이 권장된다(4). 또한 상품화되어 있는 MicroSeq 500
Submitted : 22 November 2008, Accepted : 16 December 2008 Correspondence : Mi-Na Kim, M.D.
Department of Laboratory Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, 388-1 Pungnap-2dong, Songpa-gu, Seoul 138-736, Korea
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16S rRNA 유전자 염기서열분석 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)처럼 16S rRNA 유전자의 5' 말단 500 bp만을 염기서열분석할 경우 일부 균종에서는 전체 16S rRNA 유전자를 염기서열분석한 동정 결과와 다를 수 있다(5). 이와 같이 균종별, 표적 유전자별 차이 때문에 Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)에서는 MM18-A를 통해 배양된 세균과 진균을 염기서열분석법으 로 동정할 때 균종 별로 표적 유전자를 제시하고 있다(4).
염기서열 결과는 가능하면 표준균주(type strain)의 염기서 열과 비교해야 하고, 학술지에 게재된 표준균주의 염기서열 이 가장 믿을 만하다. 염기서열분석에 사용한 유전자 길이 가 변별력에 영향을 주므로 최소한 균종간 염기서열 변이가 있는 부위를 포함하는 300 bp 이상의 염기서열을 분석해야 한다. 일반적으로 표준균주의 염기서열과 99.0% 일치하고, 다음으로 일치도가 높은 종의 염기서열과는 >0.8%의 차이 를 보이면 속(genus)과 종(species) 수준 동정을 할 수 있다 (4). 하지만, 균종간 염기서열 일치도가 높은 호기성 actino- mycetes의 경우에는 각각 ≥99.6%, >0.4%를 기준으로 한 다(4). Mycobacterium spp.의 경우 16S rRNA 유전자 부위 가 100% 일치해야만 균종 동정이 가능하며, 100% 일치하 지 않더라도, 16S rRNA 유전자 중 5'말단의 129-267번째 부위, 430-500번째 부위는 반드시 100% 일치해야 종 수준 의 동정을 할 수 있다(4). 따라서 1, 2순위로 일치하는 균종 간 염기서열 차이가 기준 이하이면 두 균종을 감별하기 위해 서 표현형 검사가 필요하다. 염기서열분석으로 균종을 동정 한 증례를 보고할 때는 이런 조건을 충족하는지 판단할 수 있도록 검사 방법과 결과를 제시해 주어야 한다. 이 등(2)의 에이즈 환자에서 발생한 파종성 조류형 결핵균 감염 1예 에 서는 골수에서 추출한 DNA의 16S rRNA 염기서열분석을 통해 균종을 동정하였다고 기술하였으나, 16S rRNA의 어느
DOI : 10.3947/ic.2008.40.6.355 LETTER TO THE EDITOR
염기서열분석을 이용한 미생물 동정의 신뢰도
울산의대 서울아산병원 진단검사의학과 성흥섭·김미나
Reliability of Sequence-Based Identification of Microorganism
Heungsup Sung, M.D. and Mi-Na Kim, M.D.
Department of Laboratory Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul, Korea
Reliability of Sequence-Based Identification of Microorganism Vol.40, No.6, 2008 355
부위를 염기서열분석했는지 어떤 균주와 몇 %의 상동성을 보였는지가 제시되어 있지 않았으며, Park 등(1)의 정상면 역 환자에서 외상 후 발생한 Mycobacterium fortuitum에 의한 무릎아래주머니염 1예의 경우는 표적 유전자로 사용 한 rpoB 유전자 중 360 bp의 특정 부위가 Mycobacterium 종 동정에 우수한 변별력을 보인 부위라는 근거가 제시되어 야 하는데 표적 유전자와 PCR-RFLP의 알고리즘을 인용한 참고문헌이 방법이나 고찰에 제시되지 않았으며 비교한 염 기서열과 몇 %의 상동성을 보였는지 제시되어 있지 않아서 균종 동정의 신뢰도를 떨어뜨린다.
위와 같은 조건을 다 만족하더라도 그 균종을 정의하는 데 가장 기본적이고 필수적인 표현형 검사가 이를 지지하지 않는다면 동정 결과를 재고하여야 한다. 이와 같은 불일치 의 원인으로 표현형 검사의 오류, 기존에 보고되지 않은 새 로운 균종, 오염된 균 또는 핵산이 증폭된 경우 등을 생각해 볼 수 있다. Sim 등(3)의 “스테로이드를 투여 받는 환자에 서 발생한 Nocardia farcinica 뇌 농양 1예”에서는 modified AFB 염색이 음성이라고 기술하고, Saubolle 등(6)의 논문 을 인용하여 Nocardia 속이 modified AFB 음성일 수 있다 고 고찰하였다. 하지만 근거가 되는 Saubolle 등(6)의 논문 에서는 직접도말에서 Nocardia의 검출능이 떨어진다는 것 이며 Nocardia라면 당연히 약 항산성이 있어야 한다. 중요 한 표현형 검사에서 기대한 결과를 얻지 못했을 때는 원인 을 규명해 볼 필요가 있고, 다른 확인검사를 실시해야 한다.
Nocardia의 경우 다른 호기성 actinomycetes와의 감별을 위해 lysozyme 내성, 기중균사 관찰 등이 꼭 필요한 검사라 고 할 수 있다(7). 이처럼 염기서열분석에 의한 동정결과는 반드시 표현형적인 검사가 뒷받침되어야만 신뢰성을 확보 할 수 있다.
결론적으로 염기서열분석으로 균종 동정을 시행해서 증 례 보고할 때에는 동정을 위해 사용한 표적 유전자와 유전 자 부위, 사용한 시발체(primer), 염기서열분석에서 얻은 염 기의 길이, 비교를 위해 사용한 데이터베이스와 표준균주, 표준균주의 염기서열과의 일치도, 다음으로 일치도가 높은
균종간의 염기서열 일치도 등에 관한 기술이 필요하며, 기 본적이고 필수적인 표현형 검사를 시행해서 동정 결과를 뒷 받침해야만 동정의 신뢰도를 확보할 수 있고 논문으로 발표 할 수 있을 것이다.
REFERENCES
1) Park DW, Kim JE, Back SY, Park HS, Son CN, Ahn SE, Park HJ, Jang SH, Paik SS, Choi CH, Choi TY, Pai H. Post-traumatic infrapatellar bursitis due to Mycobacterium fortuitum in an immunocompetent patient. Infect Chemother 40:292-6, 2008
2) Yi SH, Choi JH, Choi MH, Shin DW, Choi JH, Kim TY, Jeon MH, Koh ES, Choo EJ. Disseminated Mycobacterium avium complex infection in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. Infect Chemother 40:297-300, 2008
3) Sim SH, Park HC, Kim CJ, Jeon JH, Kim EC, Oh MD, Kim NJ, Choe KW. A case of Nocardia farcinica brain abscess in the patient receiving steroid treatment.
Infect Chemother 40:301-4, 2008
4) Clinical and Laboratory Standard Institute. Interpre- tative criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved guideline.
MM18-A. p1-71, Pennsylvania, Clinical and Labora- tory Standard Institute, 2008.
5) Woo PC, Ng KH, Lau SK, Yip KT, Fung AM, Leung KW, Tam DM, Que TL, Yuen KY. Usefulness of the MicroSeq 500 16S ribosomal DNA-based bacterial identification system for identification of clinically significant bacterial isolates with ambiguous bio- chemical profiles. J Clin Microbiol 2003;41:1996-2001.
6) Saubolle MA, Sussland D. Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J Clin Microbiol 41:
4497-501, 2003
7) Conville PS, Witebsky FG. Nocardia, Rhodococcus, Gordonia, Actinomadura, Streptomyces, and other aerobic actinomycetes. In: Murray PR, Baron EJ, eds.
Manual of clinical microbiology. 9th ed. p515, Washington DC, ASM Press, 2007
356 Infection and Chemotherapy : Vol.40, No.6, 2008
