<p>호박잎의 항산화 효과 연구</p><p>Experimental Study on Effects of Cucurbita moschata Duch. on Antioxidation</p>

Experimental Study on Effects of Cucurbita moschata Duch. on Antioxidation

Yun-Yeop Cha, O.M.D., Ph.D.

Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Sangji University

In recent year, We are concerned about anti-aging, disease-protection, long-life, many methods are used in solving this problem. And Those are re- lated with antioxidative ability.

Recently, We heard that Cucurbita moschata Duch. has anti-hypertensive effect and good for health.

So I let made a experiment for this result of the anti-oxidant effect of Cucurbita moschata Duch. used for 3 methods, those are DPPH radical scav- enging activity, Nitric oxide(NO) radical scavenging activity and Bovine serum albumin(BSA).

The results of this study were as follows:

We measured level of DPPH radical scavenging activity. And we obtained results that the ability of DPPH radical's elimination was increased when concentration of Cucurbita moschata Duch. was to 20 ㎎/㎖.

We measured level of Nitric oxide(NO) radical scavenging activity. And we founded that the ability of NO radical's elimination was increased when concentration of Cucurbita moschata Duch. was to 10 ㎎/㎖.

When we inspected antioxidation with Bovine serum albumin(BSA). And we obtained that antioxidative ability was increased after 2.5 ㎎/㎖ of Cucurbita moschata Duch..

So I guess that Cucurbita moschata Duch. has effect of antioxidative ability. Hereafter we need differential experimental methods for evidence of an- tioxidative effect on Cucurbita moschata Duch..

Key Words : Cucurbita moschata Duch., Antioxidation

원 저

호박잎의 항산화 효과 연구

차 윤 엽

상지대학교 한의과대학 한방재활의학교실

￭ 교신저자 : 차윤엽, 강원도 원주시 우산동 283번지 상지대학교 부속한방병원 한방재활의학과 (033) 741-9260(1), [email protected]

￭ 접수: 09년 11월 3일 수정: 09년 11월 10일 채택: 09년 11월 19일

Ⅰ. ^{서 론}

호박은 남과(南瓜), 번과(番果), 금과(金果), 북과 (北瓜), 금동과(金冬果), 번포(番蒲)라 하며, 甘, 溫, 無毒으로 脾胃經으로 들어가며, 補中益氣, 消炎止 痛, 利小便 등의 효능을 가지고 있다. 민간에서는 늑 간신경통, 화상, 당뇨병, 야맹증, 각막건조증, 요충, 회충 감염증 등에 많이 사용한다고 알려져 있다

.

최근 생활수준의 향상으로 노화방지, 장수 등에 관 심을 많이 가지고 있으며, 이를 해결하기 위한 다양한 방법들이 개발되고 있다. 노화에 관련된 학설은 여러 가지가 있으나, 최근에는 Harman에 의해 체창된 free radical에 의한 연쇄적인 유해반응의 결과로 노화과정 이 진행된다는 학설이 유력한 것으로 보고되고 있다

. 이러한 건강 및 노화에 대한 관심 속에 호박잎은 특 유의 맛과 조직감으로 쌈 싸먹는 한국인의 독특한 식 생활 문화와 어우러져 예부터 친숙한 식품으로 이용 되어져 왔으며, 건강식품으로 많이 알려져 있고 임상 에서 비만환자 치료에 음식으로 많이 활용한다고 알 려져 있어 그 효능에 대한 사전 실험으로서 진행을 해 보았다. DPPH radical scavenging activity, Nitric oxide(NO) radical scavenging activity 등을 통하여 먼저 각각의 항산화효과를 알아보았으며, Bovine se- rum albumin(BSA)을 이용하여 CU

/H

O

에 대한 방어능을 알아보아 다음의 결과를 얻었다.

Ⅱ. ^{실 험}

1. 재료

본 실험에 사용한 호박잎은 시중에서 구입하였으며, 50 g을 세척하여, 5000 ㎖ 둥근 프라스크에 증류수 를 1000 ㎖와 함께 넣어 3시간 동안 전탕하였다. 전탕

액을 16겹의 거즈로 거르고, 동결건조하여 실험에 사용하였다. 건조엑기스의 수율은 16.64%였다.

호박잎의 농도는 40 ㎎/㎖를 최초의 농도로 하여 20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖, 1.25 ㎎/㎖, 0.625 ㎎/㎖, 0.3125 ㎎/㎖, 0 ㎎/㎖의 농도가 되게 PBS 에 희석하였다. 실험에 사용한 시료는 0.2㎛ membrane filter (Whatman, U.S.A)로 filtration 하였다.

2. 방법

1) DPPH radical scavenging activity⁸⁾

보라색의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 이 항산화물질과 반응하여 무색으로 탈색되는 특징을 이용하여 항산화능을 측정하는 방법이다.

1.5 ㎖ tube에 DPPH 400 ㎕와 시료를 농도별로 40 ㎕씩 넣고 최종용량이 800 ㎕가 되도록 PBS로 조정 하였다. 그 후 실온에서 빛을 차단시키며 30분간 방치 하였다.

그 후 바닥이 편평한 96 well plate에 200 ㎕씩 3set 로 분주하여 ELISA reader(Molecular Device, U.S.A) 로 540 ㎚의 파장으로 2회 측정하였다. 측정된 값을 아 래의 공식에 따라 DPPH radical scavenging activity 로 표시하였다.

％ DPPH radical Scavenging = [1-(ABS

/ ABS

]×100

2) Nitric oxide(NO) radical scavenging activity^9-10)

Nitric oxide(NO)를 포함한 여러 가지 free radical

은 질병과 연관되어 있는데, NO는 O

와 반응하여 안

정된 nitrite와 nitrate를 생성하며, O

와 경쟁하는 NO

유리기는 nitrite의 생성을 감소한다. nitrite의 농도를

Greiss reagent를 사용해 흡광도를 측정함으로서 NO

억제능을 측정한다.

Cucurbita moschata Duch.(㎎/㎖) 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40 DPPH Radical Scavenging Activity(%) 7.2 7.67 11.86 20.93 37.20 43.72 44.65 43.02 Table Ⅰ. DPPH Radical Scavenging Activity(%)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40

co ncentratio n o f C ucurb ita m o s cha ta D uch. (mg/ml)

DPPH Radical Scavanging Activity(%)

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity(%)

실험 시작 전에 Sodium nitroprusside(SNP, Sig- ma, U.S.A)를 PBS buffer에 10 mM이 되도록 녹였다.

1.5 ㎖ tube에 다양한 농도의 시료 500 ㎕와 10 mM SNP 500 ㎕를 섞어주고 25℃에서 2시간동안 반응시 켰다. 반응이 끝난 후 96 well plate에 반응한 mixture (桑白皮+SNP) 100 ㎕를 넣고 Greiss reagent 100 ㎕ 를 첨가하고 ELISA reader(Molecular Device, U.S.A) 로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 control (시료 0 ㎕)과 비교한 nitrite 생성 %를 계산한다.

％ Scavenging effect= [1-(nitrite concentration of sample / nitrite concentration of control]×100

3) Bovine serum albumin(BSA)를 이용한 항산화 효과 검증¹¹⁾

1.5 ㎖ tube에 각 농도별 시료 10 ㎕, H

O

5 ㎕, CU

5 ㎕, PBS 42.5 ㎕를 섞은 후 37℃ water bath에서 2시

간동안 반응하였다. 그 후 Bovine serum albumin(BSA, Sigma, U.S.A) 12.5 ㎕씩 첨가하고 37℃ water bath 에서 2시간동안 반응하였다. 그 후 5X Loading dye 12 ㎕ 첨가한 뒤, 12.5% SDS-PAGE를 실시하고 Coo- massie Blue 시약으로 Gel 염색과 탈염색을 실시 후 Gel을 scanning(HUMAX, Korea) 하였다.

Ⅲ. ^{실험 결과}

1. DPPH radical scavenging activity을 통한 전자공여능 확인

호박잎 추출물의 농도를 40 ㎎/㎖를 최초의 농도로

하여 20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖, 1.25 ㎎

/㎖, 0.625 ㎎/㎖, 0.3125 ㎎/㎖, 0 ㎎/㎖ 까지 사용

하였으며, 0 ㎎/㎖를 0%로 하여 농도별 DPPH rad-

Cucurbita moschata Duch.(㎎/㎖) 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40 NO Radical Scavenging Activity(%) 34.26 40.07 50.31 55.75 61.31 62.32 54.86 41.46 Table Ⅱ. NO Radical Scavenging Activity(%)

0 10 20 30 40 50 60 70

0 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40

C o n c e n tr a tio n o f C u c u r b it a m o s c h a t a D u c h .( mg / ml ) NO Radical Scavanging Activity(%)

Fig. 2. NO radical scavenging activity(%)

0 0 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40 H2O2 5㎕(2.5mM)

Concentration of Mori Cortex(mg/ml)

Fig. 3. Antioxidative effect using BSA

ical 소거 활성 영향을 측정하였다. 농도가 증가함에 따라 소거능이 증가하는 경향을 보였고 20 ㎎/㎖에 서 최고의 효과를 나타내었다(Table Ⅰ, Fig. 1).

2. Nitric oxide(NO) radical scavenging acti- vity를 통한 저해활성 측정

Nitric oxide(NO) radical scavenging activity

를 측정하기 위하여 호박잎 추출물의 농도를 40 ㎎/

㎖를 최초의 농도로 하여 20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/

㎖, 2.5 ㎎/㎖, 1.25 ㎎/㎖, 0.625 ㎎/㎖, 0.3125 ㎎/

㎖, 0 ㎎/㎖ 까지 사용하였다. 0 ㎎/㎖를 0%로 하여

농도별 제거능을 측정하였으며, 농도가 증가함에 따

라 소거능이 증가하는 경향을 보이다가 10 ㎎/㎖에

서 최고의 효과를 나타내다가 그 후로는 감소되는

경향을 보였다(Table Ⅱ, Fig. 2).

3. BSA를 이용한 항산화 효과 검증

Bovine Serum albumin(BSA)를 이용하여 항산 화 효과를 검증하였다. 호박잎의 농도를 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0 ㎎/㎖까지 사용하였으 며 0 ㎎/㎖를 0%로 하여 H

O

에 의한 방어능을 확 인하였다. 2.5 ㎎/㎖의 농도에서부터 방어능이 증가 하는 경향을 보이고 있으며, 이후로 점점 높은 항산 화능을 보였다(Fig. 3).

Ⅳ. ^{고 찰}

산화 스트레스에 관해서는 최근에는 Harman에 의해 제창된 free radical에 관한 학설이 가장 유력 하게 보고되고 있으며, 이로 인해 노화과정도 진행 된다고 보고 있다

.

Free radical은 인체의 radiation에 의한 노출이나 내부효소반응에 의하여 생성되는데, 단백질의 -SH기 와 반응하여 효소의 활성을 잃게 되거나 가교결합의 촉진, DNA, RNA, 효소 및 membrane에 손상을 일 으켜 세포괴사를 유발한다

. 즉, free radical theo- ry는 대사과정에서 발생하는 superoxide anion(O

), hydrogen peroxide(H

O

) 및 hydroxy radical (OH

) 등의 free radical이 세포나 결체조직에 작용 하여 해로운 물질을 생성하게 되고 이것이 축적된 결 과가 로화와 만성 퇴행성 질병의 근본적인 원인이라고 보며 또한 비만의 원인으로까지도 생각을 할 수 있는 것으로, free radical이 축적되는 것을 방지하기 위하 여 정상세포는 O

를 분해하는 superoxide dismu- tase(SOD)와 H

O

를 분해하는 catalase 와 같은 효소 들을 가지게 된다

. 이러한 산화작용에 효과가 있 다고 알려져 있는 연구는 많이 있으며, 그 중 호박잎은 특유의 맛과 조직감으로 쌈 싸먹는 한국인의 독특한 식생활 문화와 어우러져 예부터 친숙한 식품으로 이용

되어져 왔으며, 건강식품으로 알려져 있는 음식 중 하나이다.

호박의 열매는 남과(南瓜), 번과(番果), 금과(金果), 북과(北瓜), 금동과(金冬果), 번포(番蒲)라 하며, 그 성 분은 과실에는 trigonelline, carotenoid, fatty acid, 자당, 포도당, 비타민 A, B1, B2, 니코틴산, 비타민, 칼 륨, 인, 칼슘, 나트륨 등이 함유되어 있다

. 그러나, 호 박잎의 성분 및 효능에 대해서는 많이 알려지지 않았 다. 따라서, 본 실험에서 일단 호박잎의 항산화 작용이 어떠한 지에 대한 내용을 알아보았으며 그 내용은 다음과 같다.

먼저 DPPH radical scavenging activity을 통한 전자공여능을 확인하였으며, 생체막 구성성분을 파괴 하며 각종 산화작용을 나타내는 활성산소를 소거하 여 줄 수 있는 활성을 알아보기 위하여 측정에 사용된 DPPH는 안정한 freeradical로서 시료가 항산화활성 을 갖고 있다면, DPPH가 갖고 있는 지질산화에 관여 하는 free radical의 비공유결합을 소거하여 DPPH의 환원성을 높일 것이고, 보라색의 DPPH가 환원이 많 이 될수록 보라색을 잃게 되어 UV 측정 시 그 수치도 낮아진다

. 시료가 free radical을 환원시키거나 상쇄 시키는 능력이 크면 높은 항산화활성 및 활성산소를 비롯한 다른 radical에 대한 소거활성을 기대할 수 있 고 인체 내의 활성 산소량의 척도로 이용될 수 있다.

호박잎 추출물의 농도를 40 ㎎/㎖를 최초의 농도로 하여 20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖, 1.25 ㎎ /㎖, 0.625 ㎎/㎖, 0.3125 ㎎/㎖, 0 ㎎/㎖ 까지 사용 하였으며, 0 ㎎/㎖를 0%로 하여 농도별 DPPH rad- ical 소거 활성 영향을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 소거능이 증가하는 경향을 보였고 20 ㎎/㎖에서 최고의 효과를 나타내었으며, 40 ㎎/㎖에서는 약간 감소한 결과를 보였다(Table Ⅰ, Fig. 1). 이는 20 ㎎ /㎖이상의 농도에서는 항산화작용에 큰 의미가 없는 농도로 생각이 된다.

다음으로 Nitric oxide(NO) radical scavenging

activity를 통한 저해활성을 측정하였다. Nitric ox- ide는 무기 저분자 radical로서 과거에는 대기오염에 관계하는 오염 물질정도로 인식되었으나

현재는 EDRF(endotherium-derived relaxing factor)로서 혈관 평활근의 이완작용 뿐 아니라 중추․말초 신경 계에도 신경정보를 전달하는 물질로 밝혀짐으로써 그 기능이 다각도로 연구되어지고 있다

. 최근에는 혈액응고 및 혈압조절기능, 암세포에 대항하는 면역 기능, 세포사에 영향 등이 밝혀졌다

.

Nitric oxide(NO) radical scavenging activity 를 측정하기 위하여 호박잎 추출물의 농도를 40 ㎎/

㎖를 최초의 농도로 하여 20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/

㎖, 2.5 ㎎/㎖, 1.25 ㎎/㎖, 0.625 ㎎/㎖, 0.3125 ㎎/

㎖, 0 ㎎/㎖ 까지 사용하였다. 0 ㎎/㎖를 0%로 하여 농도별 제거능을 측정하였으며, 농도가 증가함에 따라 소거능이 증가하는 경향을 보이다가 10 ㎎/㎖에서 최고의 효과를 나타내다가 그 후로는 감소되는 경향을 보였다(Table Ⅱ, Fig. 2). 역시 10 ㎎/㎖ 이상의 농도 에서는 항산화효과를 증가시키는 요인이 되지는 못 하였다.

마지막으로 Bovine Serum albumin(BSA)를 이용 하여 항산화 효과를 검증하였다. 호박잎의 농도를 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0 ㎎/㎖까지 사용 하였으며 0 ㎎/㎖를 0%로 하여 H

O

에 의한 방어능을 확인하였다. 2.5 ㎎/㎖의 농도에서부터 방어능이 증가 하는 경향을 보이고 있으며, 이후로 점점 높은 항산화 능을 보였으나 뚜렷한 차이는 보이지 않았다(Fig. 3).

이상에서 볼 때 호박잎 추출물의 농도가 20 ㎎/㎖

일 때가 가장 항산화작용이 뛰어난 것으로 생각되 며, 그 보다 높은 농도는 항산화효능과는 비례하지 못한 결과를 얻었다. 향후 다른 방식으로의 항산화 효과 검증이 더 필요하며, 나아가 호박잎의 항비만 에 대한 직접적인 효과에 대해서도 연구해 볼만할 것으로 생각된다.

Ⅴ. ^{결 론}

호박잎의 항산화효과를 알아보기 위해 추출물의 농도를 40 ㎎/㎖를 최초의 농도로 하여 20 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖, 1.25 ㎎/㎖, 0.625 ㎎ /㎖, 0.3125 ㎎/㎖, 0 ㎎/㎖ 까지 사용하여 다음의 3 가지 방법으로 검증한 결과 다음과 같다.

1. 호박잎 추출물의 DPPH radical scavenging ac- tivity을 통한 전자공여능 확인 결과 농도가 증가 함에 따라 소거능이 증가하는 경향을 보였고 20

㎎/㎖에서 최고의 효과를 나타내었으며, 그 후로 는 감소하는 경향을 보였다.

2. 호박잎 추출물의 Nitric oxide(NO) radical sca- venging activity를 통한 저해활성 측정 결과 농도 가 증가함에 따라 소거능이 증가하는 경향을 보이 다가 10 ㎎/㎖에서 최고의 효과를 나타냈으며 그 후로는 감소되는 경향을 보였다.

3. Bovine Serum albumin(BSA)를 이용하여 항산 화 효과를 검증 결과 2.5 ㎎/㎖의 농도에서부터 방어능이 증가하는 경향을 보이고 있으며, 이후 로 계속 높은 항산화능을 보였다.

이상의 결과로 호박잎 추출물의 농도에 따른 실험적 항산화 효과가 있음을 알았으며, 이를 이용한 여러 질병에의 효과 연구가 더 필요할 것으로 생각 된다.

Ⅵ. ^{감사의 글}

이 논문은 2009년도 상지대학교 교내연구비 지원에

의한 것입니다.

Ⅶ. ^참고문헌

1. 육창주. 원색한국약용식물도감. 아카데미서적. 서울.

1990:584.

2. 황도연. 증맥․방약합편. 남산당. 서울. 2000:260, 296, 300.

3. 이시진. 본초강목. 인민위생출판사. 북경. 1975:1700, 2451.

4. 김숙희, 김화영. 노화. 서울. 민음사. 77-85, 94. 1991.

5. 李獻平 外. 四大懷藥延綬衰老作用的硏究. 서울.

中西醫結合雜誌. 11(8). 486-7. 1991.

6. Cutler, R. G. Antioxidant, aging and longevity.

Free Radicals in Biology(ed. Pryor, W.). Acedi- mic Press. (6). 371-424. 1984.

7. 장석태. 피부과학. 서울. 여문각. 23-5. 1994.

8. Kai-Jin Wang, Ying-Jun Zhang, Chong-Ren Yang.

Antioxidant phenolic constituents from Fago- pyrum dibortrys. Journal of Ethnopharmacol- ogy 99. 2005:259-64.

9. Manjeshwar Shrinath Baliga, Ganesh Chan- dra Janetia, Shaival Kamalakasha Rao and Kiran Babu S. Evaluation of nitric oxide scavenging activity of certain spices in vitro :A prelimi- nary study. Nahrung/Food. 2003:47(4);261-4.

10. Jung-Yi Bor, Hui-Yin Chen, Gow-chin Yen.

Evalution of antioxidant and Inhibitory ef- fects on Nitric Oxide Production of Some Com- mon Vegetables. J. Agric. Doof Chem. 54. 2006:

1680-6.

11. Park, YH. Effect of polyamine on modifica- tion of biommodics by aldehyde. PhD in Medi- cine Thesis. Seoul National University. 2000.

12. 김숙희, 김화영. 老化. 서울.민음사. 1991:77-85, 94.

13. 李獻平 外. 四大懷藥延綬衰老作用的硏究. 서울.

中西醫結合雜誌. 1991;11(8):486-7.

14. Cutler, R. G. Antioxidant, aging and longe- vity. Free Radicals in Biology(ed. Pryor, W.).

Acedimic Press. (6). 1984:371-424.

15. 장석태. 피부과학. 서울. 여문각. 1994:23-5.

16. Feher, J., Cosmos, G and Vereckei, A. The free radical theory of aging Free Radicals Reac- tions in Medicine. Springer-Verlag. Berlin.

1987:57-9.

17. 리정복. 장수학. 과학백과사전출판사. 1987:11-99.

492-576.

18. 김영곤, 김영균. 프리radical. 서울. 여문각. 1997:

31-5, 98-101, 259-60, 278-86, 396-400, 425-6, 564-8.

19. Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature. 26. 1958:

1198-120.

20. Dimmeler S, Zeiher AM. Nitric oxide and apoptosis. Another paradigm for the double edged role of nitric oxide. Nitric oxide. 1997;

1(41):275-81.

21. Chung HT, Pae HO, Choi BM, Billiar T R, Kim YM. Nitric oxide as a bioregulator of apo- ptosis. Biochem biophys rescommum. 2001;

282:1075-9.

22. Monocada S, Higgs A. L-arginine nitric ox- ide pathway. NEng. J. Med. 1993;329:2002-12.

23. Kim YM, Bombeck CA. Nitric oxide as a bi- functional regulator of apoptosis. Circ. res.

1999;1(4):253-6.

24. Kim HY. Statistical study of acne vulgaris in korean adolescence. Kor. J. Dermatol. 1978;16:

471-6.