Effect of Dietary Supplementation of Diatom Melosira nummuloides and Lactic Acid Bacteria Lactobacillus plantarum on the Growth and Immune Stimulation Responses of Olive Flounder Paralichthys olivaceus

(1)

한수지 53(4), 597-605, 2020

597 Copyright © 2020 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

Korean J Fish Aquat Sci 53(4),597-605,2020

Original Article

서 론

현재국내에서는양식어류의빠른성장을위한과다한사료 공급으로환경악화가초래되고

,

^밀식으로^인한^{질병발생도}^증 가하고있는추세이다

(MIFAFF, 2003).

이에따라양식어류의 내병성저하와병원체의감염이증가됨에따라항생제의사용 빈도수가늘어나고있다

(Smith et al., 1994; Kim et al., 2014).

최근에는이러한문제를해결하기위하여항생제를대체할수 있는친환경적인천연물질을이용한사료첨가제개발을통하 여양식어류의성장및자가면역증진을위한연구가진행되고 있다

(Adel et al., 2016; Yu et al., 2018; Hoseinifar et al., 2019)

한편

,

규조류

(Bacillariophyceae)

는미세조류

(microalgae)

그

룹의식물플랑크톤중황갈조식물문

(Chrysophyta)

에속하며

,

바다및호수에서생활

,

번식한다

(Li et al., 2014).

규조류는세 계적으로탄소고정에기여하는주요종이며

,

광합성을통해해 양에서생산되는일차생산량의약

40%

^를^차지한다

(Nelson et al., 1995).

규조는이매패류및갑각류의종자생산시먹이생 물로많이이용되고있어산업적으로매우중요한가치를가지 고있다

(Gordon et al., 2006; Onitsuka et al., 2007).

그중해양 규조인

Melosira nummuloides

^는^폴리^불포화^지방산

(polyun- saturated fatty acids, PUFA),

^단가^{불포화지방산}

(monounsatu- rated fatty acids, MUFA),

오메가

-3 (ω-3), eicosapentaenoic acid (EPA)

및 폴리페놀

(polyphenol)

을 함유하고 있어 동물 및어류영양에이용가능한자원으로보고되어있다

(Li et al.,

규조류 및 유산균 첨가 사료 공급에 따른 넙치(Paralichthys olivaceus)의 성장 및 비특이적 면역 촉진 반응에 미치는 영향

노윤혜·김기혁·문혜나·고경민

¹

·여인규*

제주대학교 해양생명과학과, ¹어업회사법인㈜ 제이앤씨(JNC bio)

Effect of Dietary Supplementation of Diatom Melosira nummuloides and Lactic Acid Bacteria Lactobacillus plantarum on the Growth and Immune Stimulation Responses of Olive Flounder Paralichthys olivaceus

Yun-Hye Noh, Ki-Hyuk Kim, Hye-Na Moon, Gyung-Min Go¹ and In-Kyu Yeo*

Department of Marine life Science, Jeju National University, Jeju 63243, Korea

1JNC Bio, Bio Convergence Center II, Jeju 63243, Korea

The diatom Melosira nummuloides is a microalga that is widely distributed in freshwater and seawater is used is used in the production of silicon and fucoxanthin. The objective of this experimental study was to determine the effects of diatom powder on the physiology of olive flounder Paralichthys olivaceus . In four feeding groups consuming 0%, 1%, 2% and 3% diatom powder. After 8 weeks of feeding, we investigated P. olivaceus growth rate, feed efficiency rate, survival rate, anti-oxidant enzyme rate, non-specific immune activity and immune gene expression. The rates of growth rate, feed efficiency rate and survival were significantly higher for olive flounder in all diatom groups than in the control. The results for anti-oxidant enzyme, superoxide dismutase and catalase showed no significance, but glu- tathione was significant, depending on the concentration of diatom addition. The galectin and lysozymes of immune genes were increased in the control group. Galectin and lysozymes were thought to have increased due to infections by from pathogens during the experiment period. These results suggest that the addition of diatoms to olive flounder diets is effective in enhancing growth rate and innate immunity.

Keywords: Diatom, Melosira nummuloides , Olive flounder, Growth, Immune genes

*Corresponding author: Tel: +82. 64. 754. 3474 Fax: +82. 64. 756. 3493 E-mail address: [email protected]

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Received 28 January 2020; Revised 10 March 2020; Accepted 8 July 2020

저자 직위: 노윤혜(대학원생), 김기혁(대학원생), 문혜나(대학원생), 고경민(

대표), 여인규(교수)

https://doi.org/10.5657/KFAS.2020.0597

Korean J Fish Aquat Sci 53(4), 597-605, August 2020

(2)

노윤혜

ㆍ

김기혁

ㆍ

문혜나

ㆍ

고경민

ㆍ

여인규

598 2016).

^특히^사료^내^규조류의^첨가에^의해

pacific red snapper Lutjanus peru

^및

gilthead seabream Sparus aurata L.

^의^성장^및 면역능개선효과가있는것으로보고되고있으며

(Cerezuela et al., 2012; Martha et al., 2014),

해양미세규조

(Navicula sp.)

의 경우

,

단독첨가보다유산균을혼합하여첨가하였을때어류의 성장및면역반응이증진되는것으로보고되어졌다

(Martha et

al., 2014).

이처럼기존의패류의사료로만사용되어졌던해양

규조류를이용한양식어류의사료첨가제로써의가능성이점차 높아지고있는실정이다

.

또한규조류는규각을구성하고있는규소

(silicon)

및

fuco- xanthin

^의 ^{생산원료로도} ^주목받고 ^있다

(Woesz et al., 2006;

Guo et al., 2016).

특히규조류의주요구성성분인규소는지구 의지각

(

암석권

)

에산소다음으로가장풍부한원소일뿐만이 아니라

(Carlisle, 1972, 1982; Epstein, 1994),

동식물의골격형 성에있어중요한성분으로뼈

,

관절

,

혈관

,

피부

,

모발및치아 등모든세포에분포하여세포막을튼튼하게만들고

,

^세포간^결 합을강력하게유지시키는기능을가지는것으로알려져있다

(Carlisle, 1972; Schwarz et al., 1972; Rico et al., 2000; Reffitt et al., 2003).

최근에는이러한규소를함유하고있는다양한기 능성제품들이출시되는등규소의기능에대한관심도가높아 지고있는실정이다

.

특히

Melosira nummuloides

^는^{제주용암해수에서}^분리되어 대량생산이가능하며

,

제주용암해수에용해되어있는규소

Si (OH)

₄와마그네슘

(Mg

²⁺

)

을주로이용하여세포벽

(

골격

)

을구 성하는규조류

(Diatoms)

의규소함량은

200,000 ppm/tissue

로 모든동식물에서가장높은것으로알려져있다

(JNC, 2020).

^이 에따라기존의다른규조류에비하여규소등에의한생리활성 기능이높을것으로추측된다

.

따라서본연구에서는다양한성분을함유하고있는규조류의 양식넙치사료첨가제로서의효능을평가하기위하여

,

제주용 암해수에서분리배양한

M. nummuloides

^및^유산균

(Latoba- cillus plantarum)

^을^사료에^첨가하여^넙치

(Paralichthys oliva- ceus)

^치어의^성장률

,

사료효율

,

폐사율

,

항산화활성

,

비특이적 면역분석및면역관련유전자분석을실시하였다

.

재료 및 방법

실험어 및 실험조건

본실험은제주도함덕에위치한제주대학교해양과학연구소 내사육수조에서실시하였으며

,

넙치는약욕및

2

주일간의순화 기간을가진후개시평균무게

, 29.79±4.60 g

^의^개체를^그룹 당

320

마리씩무작위로배치되어실험에사용하였다

.

사육수 조는

1.5×1.5×0.7 m

³

, 1,100 L

용량의일체형수조를이용하 여

3

반복실험을실시하였다

.

모든실험구는

8

주간의사료공급실험후무작위로각실험 구에서

65

^마리를^선별하여^혈액

,

^간^및^신장을^{채취하였으며}

,

이중각그룹의평균무게와근사한값을가지는어체에서샘 플링한시료

10

개로분석이진행되었다

.

또한

,

실험기간동안 모든수조는자연수온

23.81±2.70°C,

염분

32.37±0.45 psu

로조절되었다

.

실험사료 및 공급

실험에사용된규조

(M. nummuloides)

^는^{어업회사법인}

㈜

^제 이앤씨

(Jeju, Korea)

에서제공받아실험에사용되었다

.

실험에 사용한

M. nummuloides

^의^{일반성분조성은}^조회분

59.24%,

조 단백질

18.87%,

수분

6.26%,

조섬유

1.77%

및조지방

1.03%

이었으며

(data not shown),

이를기초로하여규조함량이

0% (

대조구

), 1%, 2%

^및

3% (D1, D2

^및

D3)

^로^첨가된

4

^개의^실험 사료를제작하였고

,

규조의소화흡수를높이기위하여유산균 인

L. plantarum

^을^{첨가하였다}

(Table 1).

실험사료는사료원을 조성표에따라혼합한후

,

사료제작기

(SP-50, Gumgang ENG, Daegu, Korea)

을이용하여

2-3 mm

의크기로성형하였다

.

성형 된사료는

24

^시간^건조^후^사료공급^전까지^냉동보관

(-20°C)

^후 공급하였다

.

사료공급은

1

일

2

회

(09:00, 14:00 h)

에걸쳐만복 공급

(saturation)

하였으며

,

공급후

60

분뒤환수를실시하여수 조의수질을유지하였으며

,

사육은총

8

주간진행하였다

. 계측 및 생존율 분석

규조의사료내첨가가실험어체중변화에미치는영향을조 사하기위하여

8

주간의사료공급실험후어류의평균체중을 측정하여성장율

,

사료효율및생존율을각각계산하였다

.

생존 율은

1

일간격으로각실험구에폐사한개체가있는지관찰하 여상법으로산출하였다

.

실험어의어체측정은측정

24

시간전 부터절식시킨후

,

^각^{실험구에서}^무작위로

65

^마리를^선별하여

100 ppm

의마취용액

(2-phenoxy-ethanol, Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO, USA)

으로마취시킨후실시하였다

. 항산화 활성 분석

항산화활성은

8

주간의사료공급실험후

0.01%

의마취용

액

(2-phenoxy-ethanol)

^으로 ^마취시킨 ^후

,

^간을 ^적출하여

su-

peroxide dismutase (SOD), catalase (CAT)

및

glutathione

(GSH)

의 활성을분석하였다

. SOD

활성은 간 조직을

SOD

assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

를사용하여

buffer solution

로균질화한후

10,000 g

^에서

10

분간원심분리 하여얻은상층액을이용하여분석하였다

. CAT

^활성은^간^조직 을

catalase activity colorimetric kit (BioVision, SanFrancisco,

CA, USA)

를사용하여

assay buffer

로균질화한후

10,000 g

^에 서

15

분간원심분리하여얻은상층액을이용하여분석하였다

.

GSH

활성은실험어의간조직을

GSSG/GSH Quantification

kit (Dojindo, Rockville, MD, USA)

^를^사용하여

5% 5-sulfo-

salicylic acid (SSA)

를첨가하여균질화후

8,000 g

^에서

10

분 간 원심분리하여얻은상층액을

Dojindo

사의

kit

를이용하여 분석하였다

.

(3)

규조류 및 유산균 첨가 사료에 의한 넙치의 성장 및 면역 촉진 반응

599 비특이적 면역 반응 분석

비특이적 면역은

lysozyme (LYS)

^및

myeloperoxidase (MPO)

활성을통하여비교분석하였다

.

혈액의채취는

8

주간 의사료공급실험후

0.01%

의마취용액

(2-phenoxy-ethanol, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

으로마취시킨후

,

헤파린

(Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA; 4.69 mg/mL, sterile distilled

water)

처리된일회용주사기를사용하여미부정맥으로실시하

였다

.

채취한혈액은원심분리기를이용하여

8,000 g

^에서

10

분동안원심분리하여혈장

(plasma)

을분리한뒤분석전까지

-55°C

에서보관하였다

.

혈장내

LYS

활성은혈장을

15 μL

씩

96 well plate

^에^분주한^후

, 150 μL Micrococcus lysodeikticus

solution (0.2 mg/mL, 0.1 M PBS, pH=6.8)

^를^첨가한^후

25°C

에서

1

분간반응후

microplate reader (Thermo, Waltham, MA USA)

를이용하여

540 nm

에서흡광도를측정한후

,

다시

5

분

간반응시킨뒤동일한파장에서흡광도를측정하여

lysis

전후

의흡광도차를비교하여측정하였다

.

혈장내

MPO

^활성은

HBSS (Hank 's Balanced Salt Solution, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

를

96 well plates

에

80 μL

^씩^분주한^후^혈장

20 μL

를넣은후

20 mM TMB (3, 3' 5, 5-tetramethylbenzidine hydrochloride)

용액과

5 mM H

₂

0

₂용액 을첨가하고

, 2

분간반응시킨후

4 M H

₂

SO

₄용액을

35 μL

첨가 한후

microplate reader (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA USA)

를이용하여

450 nm

에서흡광도를측정하였다

.

면역관련 유전자 분석

규조첨가사료의공급에따른면역관련유전자의변화는

ga- lectin

및

c-type lysozyme

을분석하였다

.

먼저

,

면역관련유

전자들의발현을확인하기위해

total RNA

^는^{실험어로부터}^신

장

(head kidney)

조직을적출하여

RNAiso Plus (Takara Bio Inc, Kusatsu, Japan)

를사용하여 추출하였다

.

건조된

RNA pellet

을

RNase-DNase free water (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)

에용해시키고

, NanoDrop (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)

^를 ^이용하여^순도

(purity)

^및^농도

(con- centration)

를 측정하여

cDNA

합성에사용하였다

. cDNA

는

cDNA Synthesis kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan)

를사용 하여합성한뒤

-20°C

에서보관하여

PCR

증폭에사용하였다

.

Real-time PCR (qPCR)

는

cDNA

를주형으로

SYBR Green (Enzynomics, Daejeon,Korea)

^및

real-time PCR machine (Bio-rad, Hercules, CA, USA)

를사용하여 실험을진행하였 다

. β-actin

을 내부 대조군으로 사용하여

c-type lysozyme

과

galectin

의상대적발현수준을

qPCR

을사용하여나타내었다

(Table 2).

통계처리

본 실험의 모든 결과값은 평균 표준편차로 나타내었으며

, IBM SPSS Statistics 24 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)

을활용 하여

One-way ANOVA-test

로통계분석을실시하였다

.

데이 터값의유의차는

Duncan’s multiple test

사후분석을실시하여 Table 1. Dietary formulation and proximate composition of the

experimental diets for olive flounder Paralichthys olivaceus (% of dry matter)

Ingredients Experimental diets

Control D1 D2 D3

Fish meal (sardine) 60 60 60 60

Soybean meal 12 12 12 12

Corn gluten meal 3 3 3 3

Soy protein concentrate 3 3 3 3

Wheat flour 11 11 11 11

Fish oil 3.5 3.5 3.5 3.5

Lecithin 0.5 0.5 0.5 0.5

Monocalcium phosphate¹ 0.5 0.5 0.5 0.5

Vitamin premix² 1 1 1 1

Mineral premix³ 1 1 1 1

Choline 0.5 0.5 0.5 0.5

Cellulose 3 2 1 0

Lactobacillus plantarum⁴ 1 1 1 1

Melosira nummuloides⁵ 0 1 2 3

1Mono-Calcium Phosphate (22% of phosphate). ²Vitamin premix (g/kg-1 of mixture): L-ascorbic acid, 121.2; DL-α tocopheryl acetate, 18.8; thiamin hydrochloride, 2.7; riboflavin, 9.1; pyridoxine hydrochloride, 1.8; niacin, 36.4; Ca-D-pantothenate, 12.7; myo- inositol, 181.8; D-biotin, 0.27; folic acid, 0.68; p-aminobezoic acid, 18.2; menadione, 1.8; retinyl acetate, 0.73; cholecalficerol, 0.003; cyanocobalamin, 0.003. ³Mineral premix (g/kg-1 of mixture): MgSO₄.7H₂O, 80.0; NaH₂PO₄.2H₂O, 370.0; KCl, 130.0; Fer- ric citrate, 40.0; ZnSO₄.7H₂O, 20.0; Ca-lactate, 356.5; CuCl, 0.2;

AlCl₃. 6H₂O, 0.15; Na₂Se₂O₃, 0.01; MnSO₄.H₂O, 2.0; CoCl₂.6H₂O, 1.0. ⁴ Lactobacillus plantarum was purchased from woojin B&G Co. Ltd., (Gyeonggi, Korea). ⁵Melosira nummuloides containing from JNC bio Co. Ltd., (Jeju, Korea). D1, 1% of diatom powder in diet; D2, 2% of diatom powder in diet; D3, 3% of diatom powder in diet.

Table 2. Primer sequences used in the study Primer Direction Sequences(5’- 3’)

β-actin Forward TTCCTCGGTATGGAGTCCTG

Reverse AGCACAGTGTTGGCGTACAG

c-type

lysozyme Forward CTGTGGGCAGGAAAGACTTC

Reverse GGAAGTGTTGGTGGAGAGGA

galectin Forward TGTTGAGTCACGGAGACGAG

Reverse ACCTCCATCCAGATCAGTGC

(4)

노윤혜

ㆍ

김기혁

ㆍ

문혜나

ㆍ

고경민

ㆍ

여인규

600

측정하였으며

, P<0.05

에서유의성을판단하였다

.

결 과

체중 및 생존율

규조사료첨가제공급에따른넙치의성장률

,

사료효율및생 존율의변화결과는

Table 2

에나타내었다

.

실험개시전체중 은평균

29.79±4.60 g

^로

8

^주간의^사료공급^결과

,

^최종^성장^체 중은대조구에서

64.76±9.93 g, D1

에서

81.61±15.02 g, D2

에서

79.30±16.24 g, D3

에서

75.16±11.06 g

으로나타나

,

규 조첨가구가대조구에비교하여유의하게높게나타났으며

, D1

실험구에서실험개시전에비해

173.94%

의증체율을나타내 어가장빠른성장을나타났다

(Table 2, P<0.05).

사료효율에있 어서도대조구에서

0.303%, D1

에서

0.411%, D2

에서

0.369%, D3

에서

0.356%

로

, D1

에서가장높게나타났다

(Table 2).

반면

,

생존율은대조구에서

98.13±2.65%, D1

^에서

98.75±1.77%, D2

에서

99.06±1.33%, D3

에서

98.13±2.65%

로

D2

에서가 장높게나타났다

(Table 2).

항산화 활성 분석

규조사료첨가제공급에따른넙치의생체내항산화활성을 조사하기위한

SOD, CAT

^및

GSH

^의^분석^결과는

Fig. 1

^와^같다

. SOD

는대조구에서

99.06±3.67 U/mL, D1

에서

100.14±3.46 U/mL, D2

에서

99.85±1.33 U/mL, D3

에서

99.63±1.42 U/

mL

로모든실험구에서유의적인차이는나타나지않았다

(Fig.

1, P>0.05). CAT

또한대조구에서

5.51±2.29 mU/mL, D1

에 서

4.67±2.42 mU/mL, D2

^에서

4.64±2.08 mU/mL, D3

^에서

5.39±1.75 mU/mL

로모든실험구에서유의적인차이는없었

Fig. 1. Changes of superoxide dismutase (SOD; A), catalase (CAT;

B) and glutathione (GSH; C) in liver of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets containing different levels of diatom powder 0%, 1%, 2% and 3% (Con, D1, D2 and D3) for 8 weeks. Values (means of duplicate±SD) in the same column sharing a common superscript are not significantly different (P<0.05).

0 2 4 6 8 10

Con D1 D2 D3

0 2 4 6 8 10

Con D1 D2 D3

0 30 60 90 120

Con D1 D2 D3

SOD (U/mL)

(A)

CAT (mU/mL)

(B)

GSH (μmol/L)

(C)

ab

a

b b

0.0 0.5 1.0 1.5

Con D1 D2 D3

0.0 0.4 0.8 1.2

Con D1 D2 D3

LYS (%) GAL (%)

(A)

(B)

c

a a

b

a

a ab

0 1 2 3 4 5

Con a

D1 a

D2 b

D3 a 0.00

0.02 0.04 0.06

Con D1 D2 D3

a

b

bc

c

LYS (U/mL)

(A)

MPO (mU/mg)

(B)

Fig. 2. Lysozyme activity (LYS; A) and myeloperoxidase activity (MPO; B) in serum of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets containing different levels of diatom powder 0%, 1%, 2% and 3% (Con, D1, D2 and D3) for 8 weeks. Values (means of duplicate±SD) in the same column sharing a common superscript are not significantly different (P<0.05).

0 2 4 6 8 10

Con D1 D2 D3

0 2 4 6 8 10

Con D1 D2 D3

0 30 60 90 120

Con D1 D2 D3

SOD (U/mL)

(A)

CAT (mU/mL)

(B)

GSH (μmol/L)

(C)

ab

a

b b

0.0 0.5 1.0 1.5

Con D1 D2 D3

0.0 0.4 0.8 1.2

Con D1 D2 D3

LYS (%) GAL (%)

(A)

(B)

c

a a

b

a

a ab

0 1 2 3 4 5

Con a

D1 a

D2 b

D3 a 0.00

0.02 0.04 0.06

Con D1 D2 D3

a

b

bc

c

LYS (U/mL)

(A)

MPO (mU/mg)

(B)

(5)

규조류 및 유산균 첨가 사료에 의한 넙치의 성장 및 면역 촉진 반응

601

다

(Fig. 1, P>0.05). GSH

^는 ^{대조구에서}

5.25±1.30 μmol/L, D1

^에서

6.01±1.42 μmol/L, D2

^에서

4.72±0.65 μmol/L, D3

에서

6.32±0.27 μmol/L

로나타나

D1

및

D3

의실험구에서대

조구에비해높게나타나는경향을보였으나

, D2

에서는유의

하게낮았다

(Fig. 1, P<0.05).

비특이적 면역 분석

규조사료첨가제공급에따른넙치혈장에서의비특이적방

어기작을조사하기위하여

LYS

및

MPO

활성을각각분석하

였다

(Fig. 2).

LYS

은 대조구에서

0.016±0.002 U/mL, D1

에서

0.029±

0.002 U/mL, D2

에서

0.031±0.008 U/mL, D3

에서

0.036 ±0.008 U/mL

^로^모든^규조^{사료첨가제의}^급이^{실험구에서}^대

조구에비해유의하게높은수치를나타내었으며

,

특히

D3

실 험구에서가장높은활성을나타내었다

(Fig. 2, P<0.05). MPO

는대조구에서

2.37±0.65 mU/mg, D1

에서

2.54±0.32 mU/

mg, D2

에서

3.59±0.24 mU/mg, D3

에서

2.69±0.33 mU/mg

로

D2

^가^다른^실험구에 ^비해^{유의적으로}^높게^나타났다

(Fig.

2, P<0.05).

면역관련 유전자 분석

규조 사료첨가제 급이에 따른 넙치 신장에서의 면역관련 유전자를 조사하기 위하여

galetin

및

c-type lysozyme

활 성을 각각 분석하여 나타내었다

(Fig. 3). Galectin

^은 ^대조 구에서

0.904±0.169%, D1

에서

0.614±0.144%, D2

에서

0.055±0.018%, D3

에서

0.103±0.024%

로

,

대조구에서 가 장높은수치를나타내었으며

, D2

및

D3

실험구에서매우낮 은수치를나타내었다

(Fig. 3, P<0.05). c-type lysozyme

은대 조구에서

0.725±0.177%, D1

^에서

0.504±0.155%, D2

^에서

0.284±0.066%, D3

에서

0.416±0.062%

로나타나

galectin

과 유사하게대조구가가장높고

D2

및

D3

실험구에유의적으로 낮았다

(Fig. 3, P<0.05).

고 찰

본연구에서나타난규조사료첨가제공급에따른넙치의성 장변화에서사료내규조의첨가는성장및생존율에긍정적 영향을끼치는것으로추정된다

.

본사육실험에서대조사료를

8

주간섭취한실험어

(

최초무게

29.79±4.60 g)

의최종무게 는

64.76±9.93 g

^이었으며

,

^{사료효율은}

0.303%

^로 ^나타났으 며

,

사료내규조를첨가한모든그룹에서대조구보다유의적

Table 3 Growth performance of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 8 weeks

Growth performances Experimental diets

Control D1 D2 D3

Final body weight (g) 64.76±9.93^a 81.61±15.02^c 79.30±16.24^bc 75.16±11.06^b

Weight gain (%)¹ 117.40 173.94 166.21 152.31

Feed efficiency (%) ² 0.303 0.411 0.369 0.356

Survival rate (%) 98.13±2.65 98.75±1.77 99.06±1.33 98.13±2.65

1Weight gain (%)=100×(final mean body weight-initial mean body weight)/initial mean body weight.²Feed efficiency (%)=Weight gain of fish×100/feed intake (dry matter). Values (means of duplicate±SD) in the same column sharing a common superscript are not significantly different (P<0.05). D1, 1% of diatom powder in diet; D2, 2% of diatom powder in diet; D3, 3% of diatom powder in diet.

Fig. 3. Change of galectin (GAL; A) andlysozyme (LYS; B) expression change in kidney of olive flounder Paralichthys olivaceus fed the experimental diets containing different levels of diatom powder 0%, 1%, 2% and 3% (Con, D1, D2 and D3) for 8 weeks.

Expression levels were normalized against the internal control, β-actin. Expression levels between the two groups were compared by real-time PCR. Values (means of duplicate±SD) in the same column sharing a common superscript are not significantly different (P<0.05). PCR, polymerase chain reaction.

0 2 4 6 8 10

Con D1 D2 D3

0 2 4 6 8 10

Con D1 D2 D3

0 30 60 90 120

Con D1 D2 D3

SOD (U/mL)

(A)

CAT (mU/mL)

(B)

GSH (μmol/L)

(C)

ab

a

b b

0.0 0.5 1.0 1.5

Con D1 D2 D3

0.0 0.4 0.8 1.2

Con D1 D2 D3

LYS (%) GAL (%)

(A)

(B)

c

a a

b

a

a ab

0 1 2 3 4 5

Con a

D1 a

D2 b

D3 a 0.00

0.02 0.04 0.06

Con D1 D2 D3

a

b

bc

c

LYS (U/mL)

(A)

MPO (mU/mg)

(B)

(6)

노윤혜

ㆍ

김기혁

ㆍ

문혜나

ㆍ

고경민

ㆍ

여인규

602

으로높은무게성장및사료이용률을보였다

. Pacific red snap- per (L. peru)

^을^대상으로^한^연구

Martha et al. (2014)

에서 는규조및유산균을혼합하여첨가한사료

(

대조구

, Navicula sp.+Lactobacillus sakei, Navicula sp., L.sakei)

를첨가하여

8

주간공급한후성장률을측정하였다

.

그결과

,

대조구에비해

Navicula sp.

^와

L.sakei

^를^혼합한^실험구가^{유의적으로}^가장^높 은성장률을보였으며

, Navicula sp.

^단독구^및

L.sakei

^단독구 또한대조구에비해높은성장률을 나타내어본연구와유사 한결과를보였다

.

규조는단독으로사용하였을때보다유산균

(probiotic)

를첨가하였을때사육개선효과가크게작용할수 있는것으로판단된다

.

^이러한^결과는^{프리바이오틱스}^및^프로 바이오틱스의혼합하여첨가하였을때나타난효과로판단되 며

,

이처럼혼합하였을때유익균을증가시켜

,

숙주의위장관 의기능을증진시키는데효과를발휘하여

,

소화흡수를개선시 킨다고보고되어있어

(Gibson and Roberfroid, 1995)

현재어 류양식산업에서친환경사료첨가제로다양하게사용되는것 으로보고된다

.

미세조류중에서도규조는다양한종에서먹이생물로활용 되고있으며

(Kang et al., 2011),

사료내규조의첨가는이매패 류의무게

,

각장및각고의성장을증가시킨다는것으로보고되 어있다

(Chen, 2007).

^또한^새우인

black tiger prawn Penaeus monodon

^에^여러^종의^미세조류

(Nannochloropsis sp., Melo- sira sp., Entomoneis sp., Chlorella sp., Stauroneis sp.

^및

Du- naliella sp.)

를

4

주간공급한결과

,

규조류인

Melosira sp.

의공 급이다른미세조류의공급에비해생존율에있어유의적으로 높은수치를나타났으며

,

^성장률에^있어서도^유의적인^차이는 없었으나

,

가장높은수치를나타내었다고보고되어졌다

(Li et al., 2016).

본연구결과에서도규조인

M. nummuloides

^의^사료 첨가제공급으로인해성장및사료효율이높아지는것으로나 타나

,

양식어류의사료첨가제로서의규조의활용가능성이매 우높다고판단된다

.

한편

,

일반적으로어류에가해지는 독성및염분등과같은 외부인자에의한스트레스는체내에서활성산소

(oxygen free

radical, ROS)

의생성을증가시켜산화스트레스를유발한다

(Dalton et al., 1993).

생물체는활성산소에의한산화스트레스 로부터자신을보호하고항상성을유지하기위하여항산화방 어기작을가지고있으며

,

활성산소를공격성이없는물질로전 환하거나

(

유해성을저해하거나

)

제거하는존재로항산화효소 와항산화물질로나누어진다

(Martinez-Alvarez et al., 2005).

해양생물에서항산화방어기작에관여하는대표적인항산화 효소로는

SOD, CAT

^및

glutathione peroxidase (GPx)

^등이^있 으며

,

항산화물질에는

GSH, ascorbic acid

및

metallothionein (MT)

및

α-tocopherol

등이존재하며

,

해양생물의간에서생성 되는것으로알려져있다

(Basha and Rani, 2003).

그중

SOD

는산화스트레스에대한

1

차방어기작으로

superoxide radical

을과산화수소

(H

₂

O

₂

)

^와^산소

(O

₂

)

^로^{분해시키는}^효소이며

,

^이

과산화수소는

CAT

^와

GSH

^를^만나^물

(H

₂

O)

^로^변한^후^배출하 여산화손상으로부터유기체를보호하는역할을하는것으로 알려져있다

(Forman et al., 1973; Di Giulio et al., 1989).

또 한

GSH, glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx),

및

glutathione sulfotransferase (GST)

를포함한글루타 티온의의존성방어시스템은비생물적스트레스요인하에서 어류의세포산화환원항상성을유지하는데있어그중요성이 입증된바있다

(Srikanth and Gwack, 2013).

본연구에서규조 사료첨가를통한사료내규조의첨가에따른

SOD

및

CAT

활

성은유의적인차이를보이지않았으며

, GSH

활성결과

D2

가

대조구에비해유의하게낮고

D1

^및

D3

^에서^유의하게^높은^수 치를나타내었다

.

이는환경에적응하면서모든그룹에서

SOD

및

CAT

를이용하여산화스트레스낮추는과정을지나

GSH

를 이용하여

,

과산화수소를물로변화시켜더욱안정화시키는과

정으로진입하여

, GSH

의활성이높아진것으로여겨진다

.

이러

한결과는본실험에서의규조첨가제의공급은사육넙치의활

성산소변화에는큰영향을미치지않는것으로판단되나

, GSH

의경우

D2

의실험구에서대조구에비해낮은수치를나타내어 체내활성산소의저하요인으로작용했을가능성이있으나

, D1

및

D3

실험구에서는오히려높게나타나체내활성산소변화에 미치는규조의사료첨가효과에대해서는추가적인연구가필 요할것으로여겨진다

.

생물체에서가지는선천적인비특이적방어기작은면역자극 제에의해신속하게활성화되며

,

병원균에대항하여어류를보

호하기위해빠르게동원되는것으로알려져있다

(Smith and

Lumsden, 1983).

^그^중

LYS

^는^어류의

1

^차^{방어선으로}^비특이 적면역능

(innate immunity)

의척도로서사용되어왔으며

(Bols et al., 2001),

다양한균에항균작용을나타내는효소로서

,

세 균세포벽의구성성분인

peptidoglycan

의

β-1,4

결합을가수분 해하여 항균작용을나타낸다

(Grinde, 1989). MPO

의경우에 는 호중구

,

^호염기구

,

^호산구에 ^존재하는^{과산화효소이며}

,

^과 산화수소를

hypochlorus acid (HClO)

로전환시켜병원성미생 물을사멸시키는작용이있는것으로

,

생체내

MPO

활성증가 는병원체에대한항균효과를증폭시켜면역반응

(

감염과염증 반응에작용

)

을증가시키는역할을하는것으로보고되고있다

(Palic et al., 2005). Martha et al. (2014)

^은

pacific red snapper (L. peru)

^을^이용하여^규조류의^일종인

Navicula sp.

^와^유산균 인

L. sakei

^을^사료에^첨가하여^공급한^결과

,

대조구에비해

Na- vicula sp.+L. sakei

를첨가한실험구가유의적으로높은

LYS

활성을보였으며

, Navicula

^단독구^및

L. sakei

^단독구^또한^대 조구에비해높은경향을나타낸것으로보고하고있다

.

^본^연

구에서있어서도규조인

M. nummuloides

^를^사료에^첨가하여

공급한결과

, LYS

활성이규조를첨가한실험구에서대조구보

다유의적으로높은경향을보였으며

,

농도의존적으로증가하 는결과를나타내었다

.

또한본연구에서

MPO

활성에있어서 도

D2

^사료첨가^{실험구에서}^유의하게^높은

MPO

^활성을^나타