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책임저자 : 김권천, 광주시 동구 필문대로 365
501-717, 조선대학교병원 외과 Tel: 062-220-3072, Fax: 062-228-3441 E-mail: [email protected]
접수일：2011년 11월 21일, 수정일：2012년 4월 11일, 게재승인일：2012년 4월 12일
이 논문은 2009년도 조선대학교 학술 연구비의 지원을 받아 연구 되었음.
유두상 갑상선 암에서 Cyclin D1, Cytokeratin 7, Cytokeratin 20, Vimentin의 발현 및 예후 인자와의 연관성에 대한 분석
조선대학교병원 외과
김호진ㆍ김유석ㆍ김세원ㆍ김권천
Expression of Cyclin D1, Cytokeratin 7, Cytokeratin 20 and Vimentin in Papillary Thyroid Cancer and Relationship with Patient’s Prognostic Factors
Ho Jin Kim, M.D., Yoo Seok Kim, M.D., Se Won Kim,
M.D. and Kweon Cheon Kim, M.D.Purpose: Cyclin D1, cytokeratin(CK)7, CK20 and vimentin
play an important role in tumorigenesis and tumor progres- sion. Our aim was to investigate the expression of cyclin D1, CK7, CK20 and vimentin in 138 papillary thyroid cancer and relationship with clinicobiological factors. We also tried to evaluate the value of those as prognostic factors.Methods: We performed an immunohistochemical assay for
cyclin D1, CK7, CK20, and vimentin in 138 papillary thyroid cancer tissue specimens. The correlation between these factors and the clinicobiological parameters was analyzed.Results: In 138 papillary thyroid carcinoma specimens, the
expression of cyclin D1, CK7, CK20 and vimentin was seen in 118 cases (85.5%), 133 cases (96.4%), 2 cases (1.4%) and 119 cases (86.2%), respectively. In our cases, there was a significant association among the expressions of cy- clin D1, gender and lymph node metastasis. However, no obvious correlation was found between those proteins, age, tumor size, tumor amount, lymph node status and the TNM stage.Conclusion: Our results suggested increased cyclin D1 ex-
pression was seen in female gender and it may be a useful marker for evaluating lymph node metastasis. However, the clinical utility of cyclin D1, CK7, CK20 and vimentin in thy- roid cancer patients has to be further defined by pro- spective studies with larger sample sizes. (Korean J Endo-crine Surg 2012;12:92-97)
Key Words: Papillary thyroid cancer, Cyclin D1, Cytokeratin
7, Cytokeratin 20, Vimentin중심 단어:유두상 갑상선암, Cyclin D1, Cytokeratin 7, Cytokeratin 20, Vimentin
Department of Surgery, Chosun University College of Medicine, Gwangju, Korea
서 론
Cyclin D1은 염색체 11번에 위치하는 cyclin D1 유전자의 단백질 산물로 세포주기 중 G1/S기의 이행에 관여하는데, cyclin D1이 cyclin dependent kinase 4 (CDK4) 또는 CDK6와 복합체를 이루어 활성화되면 retinoblastoma 단백을 인산화 시켜 세포를 S기로 이행하게 한다(Fig. 1).(1) 그러므로, cy- clin D1이 유전자 증폭이나 과발현이 될 경우 세포증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다.(2) 갑상선 암에서 cyclin D1 의 역할은 잘 알려져 있지는 않지만 유두상 갑상선 암의 면역조직화학 검사에서 cyclin D1의 발현이 60% 이상에서 관찰되어지고 있다(Fig. 2).(3,4)
Cytokeratin (CK)은 중간 미세섬유 단백질의 complex fa- mily로서 20개 이상의 다른 폴리펩티드로 구성되어 있고 주 로 양성 및 악성 상피세포에서 발견된다. 20종의 cytokeratin 이 있으며, 조직의 종류에 따라 또는 세포의 분화 및 성장에 따라 발현되는 종류가 특이하다.(5) 정상 세포들이 암으로 변화되어 가더라도 그 고유의 중간 미세섬유의 특이성을 간직하기 때문에 원발 병소의 진단과 분화 및 성장 정도의 척도로서 유용한 가치를 지닌다(Fig. 3, 4).(6,7)
Vimentin은 주로 연부조직에서 관찰되는 중간 단섬유 family의 구성원으로 cytoskeleton의 주요 요소이며 meso- derm 기원의 조직에 대한 표지자 및 유육종의 면역조직화 학 표지자로 이용되고 있다. 종양세포의 국소침범, 전이의 능력과 vimentin의 연관성과 관련하여 여러 연구들이 있는 것으로 알려져 있다(Fig. 5).
현재 여러 종양에서 이러한 cell-cycle regulator에 대한 연 구가 이루어지고 있으나 유두상 갑상선암에서 cyclin D1을
Fig. 3. CK7 stain demonstrates intense cytoplasmic reactivity (CK7, H&E, ×100).
Fig. 4. CK20 staining shows negativity in tumor (CK20, H&E,
×100).
Fig. 1. Schematic view of regulation of cell cycle.
Fig. 2. Cyclin D1 immunoreactivity is present in papillary carcinoma (Cyclin D1, H&E, ×100).
제외한 CK7, CK20 및 vimentin의 발현에 대한 연구는 부족 하다. 따라서, 본 연구에서는 유두상 갑상선암에서 Cyclin D1의 역할에 대한 재조명, CK7, CK20 및 vimentin의 발현과 유두상 갑상선암 환자의 상관관계를 분석하여 예후인자와
의 연관성 및 임상적 이용도를 알아보고자 하였다.
방 법 1) 대상
2008년 1월부터 2010년 8월까지 유두상 갑상선암으로 갑 상선 절제술을 시행한 환자 중 면역조직화학검사를 시행한 138명의 환자를 대상으로 하였다. 대상군에서 남자가 18명, 여자는 120명이었으며, 대상 환자들의 평균 연령은 49.3세 였고 연령 분포는 19세부터 82세였다. 환자의 자료는 임상 기록지, 병리학 진단 기록지를 근거로 후향적으로 연구하 였으며, 환자의 성별, 종양의 개수 및 크기, 림프절 전이 유 무, TNM stage 등으로 구분하였다.
Fig. 5. Tumor cell diffuse cytoplasmic reactivity for vimentin (Vimentin, H&E, ×100).
Number Cyclin D1 P value CK7 P value CK20 P value Vimentin P value
Sex
Male 18 (13.1) 12 (66.7) 0.015 17 (94.4) 0.638 2 (11.1) 0.000 16 (88.9) 0.726
Female 120 (86.9) 106 (88.3) 116 (96.7) 0 (0) 103 (85.8)
Age
＜45 44 (31.8) 38 (86.4) 0.520 41 (93.2) 0.664 1 (2.3) 0.562 35 (79.5) 0.267
≥45 94 (68.2) 80 (85.1) 92 (97.9) 1 (1.1) 84 (89.4)
Number
1 109 (78.9) 94 (86.2) 0.720 104 (95.4) 0.710 2 (1.8) 0.910 93 (85.3) 0.347
≥2 29 (21.1) 24 (82.8) 29 (100) 0 (0) 26 (89.7)
TNM stage
I 102 (73.9) 84 (82.4) 0.354 97 (95.1) 0.608 1 (1.0) 0.000 86 (84.3) 0.397
II 3 (2.2) 3 (100) 3 (100) 0 (0) 2 (66.7)
III 32 (23.2) 30 (93.8) 32 (100) 0 (0) 30 (93.8)
IV 1 (0.7) 1 (100) 1 (100) 1 (100) 1 (100)
Tumor size
＜1 cm 86 (62.3) 72 (83.7) 0.443 84 (97.7) 0.294 0 (0) 0.067 75 (87.2) 0.668
≥1 cm 52 (37.7) 46 (88.5) 49 (94.2) 2 (3.8) 44 (84.6)
Lymph node
Positive 55 (39.9) 51 (92.7) 0.050 55 (100) 0.064 2 (3.6) 0.080 51 (92.7) 0.071
Negative 83 (60.1) 67 (80.7) 78 (94.0) 0 (0) 68 (81.9)
Table 1. Correlation between patient’s risk factors and expression of cyclin D1, CK7, CK20 and vimentin 2) 면역조직화학적 염색 및 결과의 해석
10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 조직의 파라핀 블록 을 4∼6μm 두께로 연속절편 후 60oC 항온기에서 60분간 가열 후 xylene으로 3∼5분간 3회 침수하여 파라핀을 제거 하였다. 항원성을 증진시키기 위해 pH 6.0 citrate buffer에 넣고 micro-oven에서 20분 가열 후 내인성 과산화 효소의 활성을 억제시키기 위하여 3% 과산화수소수를 사용하여 10분간 처리 후 PBS (phosphate buffer solution)에 씻고 일차
및 이차 항체의 비특이적 결합을 막기 위하여 정상 염소 혈청을 가한 후 실온에서 10분간 반응시켰다. 일차 항체로 실온에서 1시간 반응 후 PBS에 세척, 이차 항체로 20분 반 응 후 PBS에 세척 후 avidin-biotin complex (ABC) chromogen 에서 발색 후 대조염색은 Mayer Hematoxylin에서 3∼5초 발 색 후 수세한 다음 봉입 후 검경하였으며 고배율(×400) 시 야에서 관찰하여 핵이나 세포질에서 발현된 경우를 양성으 로 판독하였다.
3) 통계적 분석
Social Science program 10.1 version (SPSS Inc. Chicago IL) 의 통계 프로그램을 이용하였다. 임상자료와 Cyclin D1, CK 7, CK20과 Vimentin의 발현과의 관계를 Chi-squire 방법과 Fisher's exact test를 사용하였으며. P value는 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 하였다.
결 과
138예의 유두상 갑상선 암 환자에서 cyclin D1, CK7, CK20 및 vimentin의 발현은 각각 118예(85.5%), 133예 (96.4%), 2예(1.4%) 그리고 119예(86.2%)에서 관찰되었다.
성별에 따른 각각의 발현 정도나 TNM stage 기준에 따라 나이를 45세 미만인 군(44예)과 45세 이상인 군(94예)으로 나누었으며 종양의 개수가 1개인 경우와 2개 이상인 경우 에서 각각의 발현 정도를 비교하였을 때 이들 임상적 인자 들의 유의성은 관찰되지 않았다. AJCC에 근거하여 종양의
크기를 미세 유두상 갑상선 암의 크기와 관련하여 1 cm 미 만인 군 86예와 1 cm 이상인 군 52예로 구분하였을 때, cy- clin D1, CK7, CK20, vimentin의 발현이 1 cm 미만인 군에서 각각 72예, 84예, 0예, 75예, 1 cm 이상인 군에서는 각각 46 예, 49예, 2예, 44예에서 보였고 통계적 유의성은 없었다.
TNM stage에 따른 분류에서 각각 stage I-102, 97, 1, 86예, II-3, 3, 0, 2예, III-32, 32, 0, 30예, IV-모두 1예였으며 이의 통계적 유의성은 없었다. 림프절 전이는 55예(39.9%)였으며 Cyclin D1 발현이 되었을 경우 더 많은 림프절 전이를 보였 고 통계적으로 유의하였으나(P=0.050) 나머지 CK7, CK20, vimentin의 발현과 림프절 전이와의 관련성은 통계적으로 유의성을 보이지 않았다(Table 1).
고 찰
유두상 갑상선암은 갑상선에서 발생하는 가장 흔한 암으 로 예후는 좋은 것으로 알려져 있으나 일부에서는 미분화 암으로 퇴행성 변화를 보여 예후가 나빠지기도 한다. 최근 분자 생물학적 연구 방법의 발달로 특정 유전자나 생물학 적 표지자로 예후 및 질환의 진행 및 침범도 등의 평가에 도움이 되는 것으로 알려져 있으나, 이들 인자를 단독으로 적용하여 예후 및 질환의 진행 정도를 예측하는 것은 아직 명확히 확립되어 있지는 않다. 따라서, 본 연구에서는 유두 상 갑상선암에서 cyclin D1, CK7, CK20과 vimentin의 발현 을 알아보고, 이들의 발현이 성별, 나이, 종양의 개수, TNM stage, 림프절 전이 등의 예후 인자와 연관이 있는지를 알아 보고자 하였다.
Cyclin D1은 세포 주기에 관여하여 세포 성장을 촉진시키 고 초기에 갑상선 종양의 형성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 여포암이나 미분화 갑상선 암에 비해 유두상 갑상선 암에서 cyclin D1의 발현이 80% 정도로 더 많은 비율을 보 이고 있다.(8) Wang 등(9)은 cyclin D1이 갑상선 종양의 발전 과 예후에서 중요한 역할을 한다고 하였고, Goto 등(10)은 고분화암에서 32.0% (39/122)가 양성으로, 저분화 암에서 36.8% (7/19)가 양성으로 발현되어 여포상선종의 3.0% (1/33) 발현에 비해 유의한 차이를 보였다고 하였다. 또한 cyclin D1이 종양 형성에 기여하고 림프절 전이를 평가할 수 있는 표지자라고 보고하였다.(3,4,11,12)
본 연구에서 cyclin D1의 발현은 118예(85.5%)로 다른 연 구와 유사한 결과를 보였으며 림프절 전이를 보인 55예 중 51예(92.7%)에서 발현되었고 림프절 전이가 없는 83예 중 67예(80.7%)에서 발현 (P=0.050)을 보였으며 이는 cyclin D1 이 림프절 전이여부를 평가하는 표지자로서의 역할을 보고 한 연구(3,4,11,12)의 결과와 부합한다. 또한 림프절 전이여 부가 국소재발과 관련이 있고 예후에 영향을 미치므로 cy- clin D1이 유두상 갑상선암에서 예후 인자로서의 가치를 지 님을 알 수 있었다.
유두상 갑상선암 환자에서 예후 인자로서 cyclin D1의 발 현의 연관성을 알아보기 위해 갑상선 암의 진행 정도와 상 관성을 분석했을 때 암의 크기가 클수록 cyclin D1의 발현 이 증가한다는 Park 등(13)의 보고와는 상이한 결과를 보였 으나 이는 대상환자의 크기가 적어 예후인자로의 유용성을 규명할 수 없다고 기술하였기 때문에 예후 인자로의 가치 평가는 더 많은 환자에서의 연구가 필요할 것으로 생각된 다. 또한 본 연구에서 유두상 갑상선암 환자에서 여성에서 106예(88.3%)로 남성의 12예(66.7%)에서보다 더 높은 비율 을 보였고 통계학적으로 유의성(P=0.015)을 보였으나 남성 환자의 수 자체가 많지 않기 때문에 더 많은 수의 남성 모 집단을 이용한 연구가 필요할 것으로 생각된다. 갑상선 암 의 병기에 따른 cyclin D1의 발현 변화는 뚜렷이 관찰되지 않았다.
Cytokeratin은 다양한 종류의 원발성 및 전이성 암에서 발 견이 되고 있으며 여포상 및 유두상 갑상선 암에서 CK7이 강한 immunopositivity를 보이나 CK20은 단지 약하고 국소 적인 immunopositivity를 보인다는 보고가 있었고,(14) 마찬 가지로 다른 연구에서 CK7은 정상 갑상선 조직, 유두상 갑 상선암, 여포암과 저분화암에서 100% 양성 발현을 보였으 나, 미분화암에서는 발현되지 않았으며, CK20은 41예의 유 두상 갑상선암 중 1예에서 약한 양성 발현(weak immunor- eactivity)을 보였다는 동일한 보고가 있었다.(15)
그리고 CK7과 CK20의 발현과 갑상선 종양에 대한 여러 연구에서 CK7은 유두상 갑상선암, 여포성암, 그리고 대다 수의 미분화 암과 저분화 암에서 발현되었으나 CK20은 발 현되지 않는 것으로 보고가 되었다.(16-18)
Schmitz-Winnenthal 등(19)은 분화 및 미분화 갑상선 암에 서 종양 조직과 혈액에서의 RT-PCR을 이용한 CK20의 검출 과 예후와의 관련성을 연구하였는데 32예 중 15예(47%)에 서 CK20이 검출되었다고 하였는데 이로 보아 유두상 갑상 선암에서 CK20의 mRNA는 만들어지나 단백질로의 발현이 안되는 것으로 추정된다.
본 연구에서도 유두상 갑상선암에서 CK7은 대부분 양성 발현이었지만 Fonseca 등(15)의 연구에서와 같이 CK20은 2 명(1.4%)에서 양성 발현을 보였는데 예후 인자와의 연관성 은 없었지만 Fonseca 등은 cytokeratin의 발현에 대해 이는 아마도 미토콘드리아의 높은 비율과 관련되어 있으며 비특 이적 발현이라는 견해를 주장하고 있어서 추후 더 많은 예 에서의 연구가 필요할 것 같다.
Vimentin은 주로 연부조직에서 관찰되어지는 중간 단섬 유 family의 구성원으로 cytoskeleton의 주요 요소이다.
McInroy 등(20)은 vimentin발현은 결장암과 유방암에서 암 세포의 침습성 및 이동성과 관련 있다고 보고하였다.
Bennett 등(21)은 미분화 종양 세포일수록 vimentin의 발현 도가 높다고 보고하였고 미분화 갑상선암에서 vimentin의 발현도가 높은 것으로 보고하였다. Vasko 등(22)은 유두상
갑상선암 조직 및 림프절에서 vimentin의 발현과 vimentin mRNA 검출에 대한 연구를 하였는데, vimentin mRNA와 단 백 발현은 모든 유두상 갑상선암과 림프절에서 나타났으나 정상 갑상선 조직에서는 검출되지 않았다고 하였다.
Vimentin의 면역조직화학적 염색 강도는 주위조직 침범 (P=0.005), 림프절 전이(P=0.004) 및 다발성(P=0.013) 등과 관련 있으나, 종양의 크기, 환자의 나이 및 성별 등과는 상 관관계가 없었다고 하였다. Yamamoto 등(23)은 vimentin은 정상 갑상선 조직(65%)을 포함한 잠재암(97%)에서 발현되 며, 원격전이와 상관없이 모든 유두상 갑상선암에서 발현 을 보이나 정상세포 보다는 종양세포에서 더 강한 발현을 보인다고 하였다. Yagi 등(24)도 미세 유두상 갑상선암과 3cm 보다 큰 유두상 갑상선암의 비교에서 vimentin의 발현 은 차이가 없다고 보고했다.
위 연구들에서 살펴보면 vimentin과 예후인자와의 상관 관계에 대해서는 여전히 일관된 결과가 없는 것 같다. 본 연구에서는 vimentin은 138명 중 19명을 제외한 대다수 환 자의 조직에서 발현되었으나 예후인자와의 상관관계는 없 었다.
결 론
본 연구에서 유두상 갑상선 암 환자에서 cyclin D1과 성 별 및 림프절 전이와의 상관성을 알 수 있었으나, CK7, CK20, vimentin의 발현과 임상적 예후 인자들과의 상관성은 보이지 않았다. Cyclin D1의 발현은 여성 갑상선암 환자의 경우에서 높았으나 cyclin D1을 포함한 CK7, CK20, vi- mentin의 모든 염색에서 남성 유두상 갑상선암 환자의 수가 적어 예후인자로서의 가치를 평가하기에 어려울 것으로 생 각된다. 하지만 cyclin D1의 발현과 림프절 전이와는 상관성 을 지니고 있었고 또한 림프절의 전이는 국소재발과 연관 이 있고 예후에 영향을 미치므로 cyclin D1의 발현이 예후 인자로서 가치가 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구 에서 대상 환자 수가 적고 성별과 관련하여서도 남성 환자 의 비율이 너무 적다는 점이 연구의 맹점이라고 생각되고 향후 더 많은 수의 모집단을 대상으로 연구가 필요할 것으 로 생각된다.
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