골형태형성단백질과 키토산 혼용이 골결손부 재생에 미치는 영향

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I. 서론

치주치료는 치주질환의 증상 제거뿐만 아니라 파 괴된 치조골, 치주인대, 백악질 및 치은을 포함하는 치주조직을 재생시켜 본래의 기능을 회복하고, 이를 유지할 수 있는 정상적인 구조적 환경을 형성해 주 는 것을 목표로 한다¹⁾. 현재까지 발달된 재생 술식 으로는 치주판막술, 골이식술, 치근면 처치술, 조직 유도재생술, 성장인자를 이용하는 방법 및 이들의 복합 술식 등이 있으나 아직 완전한 치주조직 재생 을 얻을 수 있는 술식은 확립되지 못한 실정이다^2-4). 조직재생을 위해 이용되는 의공학적 재료들 가운 데 빈번히 응용되는 생체적합성이 높은 교원질은 항 원성이 낮고 창상치유 및 혈액응고를 촉진시키며 교 차결합을 조절하여 원하는 성질을 얻을 수 있는 것 으로 알려져 있다^5,6). 이러한 성질을 활용하여 일반 적인 수술시 지혈제로 광범위하게 이용되었고⁷⁾ 치주 영역에서도 치주점막 수술에서 구개부 공여부의 출 혈조절을 위한 지혈제⁸⁾로 응용되기도 하였으며, 조 직유도재생술의 차폐막⁹⁾과 골결손부 지지체, 생물학

적 물질을 함유시켜 생체 내에서 장시간 유지하게 하는 매개체¹⁰⁾등으로 임상에서 이용되고 있다.

최근 천연산 중합체인 키토산이 개발되어 치과영 역에서 그 활용도를 확대하고 있는데 키토산은 치주 인대의 증식과 골조직 재생에 기여할 수 있고, 부작 용과 독성이 없으면서 치주인대세포 및 조골세포의 활성을 증가시킬 수 있다고 알려져 있다. 또한 인체 조직과 유사한 결합형태로 생체흡수성, 생체적합성

11,12)

및 항미생물 작용¹³⁾, 창상치유촉진¹⁴⁾, 지혈작 용¹⁵⁾, 골전도성^11,16,17) 등의 기능을 가지며 생분해되 고 풍부한 천연재료인 키틴으로부터 쉽게 유도하여 사용할 수 있어 다양한 분야의 생체재료로 활용되고 있다.¹⁾

창상 치유 및 치주조직 재생에 관여하는 생물학적 인자인 성장인자들로는 혈소판유래성장인자(Platelet Derived Growth Factor, PDGF), 인슐린유사성 장인자(Insulin-like Growth Factor, IGF), 상 피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 등이 보고되고 있으며^18-20) 그중에서 1965년 Urist 에 의해 발견된 골형태형성단백질(Bone Morphoge

*교신저자：박준봉, 서울시 동대문구 회기동 1번지 경희대학교 치과대학 치주과학교실, 우편번호：130-702 E-mail：[email protected]

대한치주과학회지 : Vol. 36, No. 1, 2006

골형태형성단백질과 키토산 혼용이 골결손부 재생에 미치는 영향

강경리 ․ 박준봉 ․ 권영혁 ․ 허 익 ․ 정종혁 경희대학교 치과대학 치주과학교실

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-netic Protein, BMP)은 생체 내에서 미분화간엽 세포에 작용하여 연골내 골화과정을 유도하는 강력 한 골형태형성유도물질로 치주조직 재생 연구에 활 발히 이용되고 있다^21-24).

본 연구의 목적은 소실된 골조직의 재생에 영향을 미치는 생물학적 매개체와 이들을 함유하는 지지체 의 효과를 연구하는 것으로, 최근까지 교원질을 지 지체로 하여 골형태형성단백질을 적용한 연구들은 많이 보고되었으나 그 자체로서 골 재생 유도능력이 있다고 보고된 키토산을 지지체로 하여 골형태형성 단백질을 적용하는 연구는 아직 미미한 실정이다.

따라서 골 재생 유도능이 있다는 키토산에 골형태형 성단백질을 혼용시 그 효과가 증가할 것이라는 가설 을 세우고 그 효과의 상승정도를 파악하기 위해 본 연구를 시행하였다.

II. 연구재료 및 방법

1. 실험동물

실험대상은 자연 상태에서 치주질환이 지속적으로 발생되어 치주질환 연구에 사용되는 대표적 실험동 물인 비글견으로 생후 약 1년 6개월 이상, 체중 15kg내외의 성견 3마리를 사용하였고 실험부위로는 하악골을 이용하였다.

2. 실험 재료

교원질(CollaPlug^®, Sulzer Dental Inc., NJ, USA)은 결손부에 채워 넣기 위해 키토산막과 유사 한 크기로 세절하여 충전하였다. 키토산막 ( NanoGide-C^®, NIBEC, Seoul, Korea)도 결손부 에 채워 넣기 좋도록 2x5mm 크기로 세절하여 충전 하였으며 골형태형성단백질 (recombinant human Bone Morpho-genetic Protein-4, R&D SYSTEMS, Minneapolis, USA)은 10㎍을 0.05M 아세트산 10㎕에 용해시켜 마이크로피펫으로 키토산막이 채워 진 결손부에 적용하였다.

3. 외과적 술식

실험동물은 염산케타민(0.22-0.44㎖/kg)과 럼푼 (0.15㎖/kg)을 대퇴부에 근육주사하여 전신마취시 키고, 1: 100,000 에피네프린이 함유된 2% 염산 리도카인을 지혈 및 국소마취의 목적으로 시술부위 인 양측 하악골의 해당 부위 치은조직에 주사하였다.

No. 15 수술도로 치조정과 치은열구에 절개 후 전 층판막을 거상하였다. 노출된 하악골 측면에 치근부 위를 피해 직경 5mm의 트레핀 버로 원형 결손부를 좌우측에 각각 3개씩 형성하였다. 이때, 골삭제시 과도한 열 발생을 방지하기 위해 식염수 주수 하에 시행하였으며 거즈로 압박 지혈 후 교원질군과 키토 산군은 잘라서 결손부 골 표면에 평행하도록 각각 충전하였고, 골형태형성단백질과 키토산의 혼용군 (이하 ‘혼용군’이라함)은 0.05M 아세트산 10㎕를 골형태형성단백질 10㎍에 주입하여 용해시킨 후 이 용액을 다시 마이크로피펫으로 미리 충전한 키토산 에 적용하였다. 판막을 원래 위치에 고정시키고 4-0 나일론으로 봉합하였으며 반대측에도 동일한 방법으 로 시술하였다. 술후 2주일에 발사하였다.

4. 실험동물 희생 및 조직 표본 준비

술후 감염방지를 위해 5일간 0.1㎖/kg 겐타마이 신과 0.04㎖/kg 케토프로를 1일 1회 근육주사하고 1, 3, 8주에 각각 희생하여 하악골을 절제하였다.

채득한 하악골은 즉시 3% 포르말린 용액으로 고정 한 후 10% EDTA와 1% paraformaldehyde,그리 고 0.1M 인산완충액을 혼합한 pH 7.4의 탈회용액 에서 7-8주간 탈회하였다. 충분한 탈회 후 30%

sucrose 용액에 24시간동안 담그고 조직이 용액 내 에서 완전히 가라앉은 것을 확인 후 냉동조직 시편 을 위한 침전제(Tissue-Tek^®, O.C.T compound,

Sakura, U.S.A.)에 30분간 침전하였다. 그 후 -20℃에서 급속 냉동시켜 냉동절편기를 이용해 약 10㎛의 두께로 박절한 후 절편은 냉동 보관하였고, 실온에서 2시간 동안 건조, 부착하여 제작한 조직은

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Hematoxylin-Eosin 염색방법으로 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다.

III. 연구 성적

1. 교원질군

1) 술후 1주 소견

기존 골조직과 인공 골결손부의 경계가 비교적 뚜 렷하고 결손부 내부에는 교원질 섬유다발들이 가득 차 있으며 염증세포의 침윤을 볼 수 있다(Figure 1, 2).

결손부내부에 삽입된 불규칙한 방향성의 교원질 섬유다발들과 염증세포의 침윤이 관찰되었다 (Figure 3).

고배율에서도 중심부에 확장된 혈관들이 존재하고 치밀한 결합조직이 농염되었으나 신생골 생성 소견 은 관찰되지 않았다(Figure 4).

교직골 형태의 신생골이 여러 부위에서 관찰되며 교원질을 둘러싸고 있다 (Figure 5). 고배율에서 결합조직이 밀집된 양상이 관찰되며 기존골과의 경 계부와 충전된 교원질이 존재했던 많은 공동주위에 농염된 활동성 골아세포들이 배열되어 있다(Figure 6).

2. 키토산군

가느다란 교원질 섬유들이 가득 차 있으며 충전된 시료가 존재한 골결손부 내부에는 염증세포 침윤을 관찰할 수 있고 (Figure 7), 고배율에서도 흡수중 인 키토산과 미세하게 확장된 모세혈관 수의 증가와 교원질 섬유를 볼 수 있다(Figure 8).

기존골과 키토산 충전 부위의 조직이 아직 완전히 결합하지 못하고 있으며, 일부 연결된 부분과 시료 의 존재부위로 추정되는 공동 주변에는 골아세포라 생각되는 농염된 세포들의 배열이 발견된다(Figure 9). 고배율에서는 두 조직의 연결상과 잘 배열된 교 원질 섬유를 관찰할 수 있다(Figure 10).

전체적으로 염증소견은 관찰되지 않고 기존골에 인접한 부위와 흡수된 키토산 주변에는 골아세포의 배열이 관찰되고 신생골이라 할 수 있는 골침 (bony spicule)의 발현이 괄목할 만하다(Figure 11). 고 배율에서 공동 주변에 많은 골아세포가 관찰되고, 아직은 미성숙한 형태를 보이지만, 일부 부위에서는 전형적인 골 구조도 관찰되었다. 기존골 표면에 인 접한 부위에서는 활동성의 골아세포가 진하게 염색 되어 배열한 것을 관찰할 수 있다(Figure 12).

3. 골형태형성단백질과 키토산의 혼용군

많은 염증세포의 침윤과 풍부한 교원질 합성, 불 규칙한 교원질 섬유다발을 관찰할 수 있다(Figure 13). 고배율에서 미세하지만 확장된 모세혈관 수의 증가와 교원질 섬유의 밀집상을 볼 수 있다(Figure 14).

기존골면과 골결손부의 인접면은 완전히 결합된 양상이 두드러지고 골 결손 내부에는 확장된 모세혈 관, 흡수중인 키토산과 그 주변의 교원질 섬유들을 관찰할 수 있고(Figure 15), 고배율에서 기존 골조 직에 직각을 이루는 농염된 섬유아세포들의 일정한 배열상을 관찰할 수 있고 충전된 키토산을 중심으로 일정한 방향성을 가지며 배열된 교원질 섬유다발과 신생골이 생성되는 양상을 볼 수 있다(Figure 16).

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기존 골 조직으로부터 규칙적인 골침(bony spicule)의 형태로, 새로운 골 조직이 형성중인 사실과 흡수중인 키토산을 관찰할 수 있다. 골의 양과 치밀 도는 교원질군보다 더 많고 치밀한 형태이다(Figure 17). 고배율에서 새로 형성된 골은 내부에 많은 골 세포를 함유하고 있어, 아직은 미성숙 상태를 보이 지만 교원질군에 비해서는 치밀한 골 구조를 보인다.

신생골 표면에는 활동성의 골아세포가 진하게 염색 되어 배열된 것을 관찰할 수 있다(Figure 18).

IV. 총괄 및 고찰

치주치료의 궁극적 목표는 치주질환의 진행을 막 고 증상을 제거하는 것 뿐 아니라 파괴된 치주조직 의 신생골, 신생 백악질 그리고 그 사이의 치주인대 가 형성되는 치주조직의 재생에 있다. 그 중에서 가 장 흔히 이용되는 재생술식으로 골이식술을 들 수 있으며 현재까지 여러 가지 이식재와 수술법이 개발 되어 널리 응용되고 있으나 아직 한계점들을 가지고 있으며 계속적으로 새로운 재료가 개발, 연구되고 있다. 이상적인 이식재의 조건²⁵⁾으로는 골 형성 및 백악질 형성 유도 능력이 있어야 하며 염증 반응이 없고 빠른 혈관 형성이 이루어지며 숙주조직에 친화 성이 있어야 하고 사용이 용이하며 경제적이어야 함 을 들 수 있다. 골이식술은 좋은 결과를 보이기도 하 나, 치근흡수, 골 유착, 이식재 탈락 및 부골형성, 질환의 전염 가능성, 이식항원에 대한 거부반응 등 의 부작용도 가능하다는 단점들이 있다. 또한 이식 재의 이상적 조건중 하나인 골형성유도능력은 임상 적으로 불충분하고 주로 충전재로서만 작용하는 것 으로 보이는 경우도 있다. 따라서 세포의 화학주성, 증식, 분화 및 세포기질 형성을 자극하여 세포 이주, 부착 및 증식을 조절하는 성장인자들을 이용하여 조 직재생을 유도하는 방법, 체내 부작용 없이 골 조직 재생에 효과적인 제재에 대한 연구, 또한 기존의 재 생 술식들과 새로운 방법의 복합적 이용에 대한 연 구가 다양하게 진행되고 있다.

교원질은 치주영역에서 다양하게 활용되어 왔다.

Mattsson등²⁶⁾은 교원질 지혈제를 백서의 하악에 형성된 골결손부에 적용시 만성염증이 관찰되고 골 치유를 방해한다고 보고하였고, Solheim등²⁷⁾은 교 원질 paste가 골유도성을 방해하고 대식세포에 의 한 만성염증을 유발한다고 보고하였으며, 조등²⁸⁾은 혈소판유래성장인자의 함유매개체로 교원질을 사용 시 염증반응이 심하게 나타나며 성견의 치근이개부 병변의 치유를 저해하였다고 보고하였다. 이에 반해 Doillon등⁵⁾과 Chva-pil등⁶⁾은 교원질의 섬유성 구 조로 인한 다공이 교원질 내로의 세포의 유입을 가 능하게 해 준다고 보고하였다. 이러한 성질을 이용 하여 교원질을 조직의 치유를 촉진시키고자 결손부 에 적용하고 이식재와 성장인자 같은 약제의 매개체 로도 사용한 보고도 있다. Blumenthal등²⁹⁾과 Yaffe등³⁰⁾은 치주질환으로 인한 3벽성 골내병소에 각각 교원질 겔(gel)과 용액을 적용시 교원질이 치 주인대세포에 화학주성을 나타내고, 상피세포의 치 근단방향으로의 이동을 방해한다고 보고하였으며, Bell등³¹⁾은 tricalcium phos-phate, hydrox- yapatite를 교원질과 혼합하여 쥐의 하악 결손부에 적용시, 교원질에 의한 조직의 치유방해는 없었다고 보고하였다. 또 Helm등³²⁾은 자가골과 혼합된 교원 질 겔이 골아세포의 성장을 위한 골전도성 기질을 제공한다고 보고하였다. 이번 실험에서는 발치 후 발치와에 삽입하여 발치와의 치유를 촉진하고 치유 후 조직형태를 고유형태로 유지하기 위해 활용하던 원추형 교원질을 사용하였다. 그 결과 충전 초기부 터 염증반응이 미약하고 시술 8주후에는 부위에 따 라 치밀한 결체조직이 농염된 부위에서는 미약하나 마 골아세포의 배열상이 관찰되어 골결손부의 조직 재생에 교원질 활용이 타당하다고 판단되었다. 이러 한 실험결과는 다공형의 교원질 내부로 세포유입이 가능하여 골 형성이 촉진되었다는 Doillon등⁵⁾및 Chvapil등⁶⁾의 주장과 일치한다고 생각된다.

현재까지 여러 재료들이 지지체로 응용되어 왔으 나 최근 부작용과 독성이 없고 생체적합성, 생물분 해성을 가지며 lysozyme에 의해서 점차 해축

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(depolyme-rization)되어 6개월 이내에 완전히 흡 수되는 키토산¹¹⁾이 새로운 지지체로서 활발히 연구 되고 있다. 또한 키토산은 여러 약제에 대한 조절성 방출 기능이 있는 것으로 알려지고 있어 여러 연구 에서 항생제, 성장인자, 항염제 및 여러 고분자 약물 등을 위한 국소약물송달체계로서 키토산 기질을 이 용한 시도들이 있어 왔으며 키토산의 뛰어난 생접착 성으로 치주 및 구강점막질환을 위한 약물송달체계 로도 사용될 수 있음이 보고되었는데³³⁾ 미노싸이클 린의 투여를 위해 키토산 미소캡슐을 이용하여 성인 형 치주염 환자에 효과적인 치료결과를 얻은 바 있 다³⁴⁾. Hirano등³⁵⁾은 lysozyme과 chitinase에 의 한 효소 가수분해 속도는 N-acetyl group의 치환 도에 의해서 조절할 수 있으므로, 키토산을 조절된 약물 유리를 위한 약물수송체계의 기저물질로 이용 할 수 있을 것이라고 하였으며, 여러 형태로 제작할 수 있는 장점이 있어 조직 공학 및 성장인자의 운반 체로 이용하기 위한 많은 연구와 개발이 계속 진행 되고 있다. 본 연구에서는 골형태형성단백질을 적용 시 키토산을 지지체로 이용했으며, 골형태형성단백 질이 키토산에 잘 결합할 수 있도록 충분히 적셔 건 조시킨 후 결손부에 삽입하여 골형태형성단백질이 서서히 방출되도록 하여서 그 효과를 극대화시키지 못한 점이 결과에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.

따라서 향후 실험방법을 개선하여 시료의 평가가 필 요하리라 생각된다.

뿐만 아니라 키토산은 신생조직의 재생촉진 목적 으로 인공피부재로도 이용되며 기계적 강도가 우수 하고 물질의 투과 조절이 용이하므로 생체흡수성 봉 합사로도 활용성이 크다. 배양피부의 진피를 만드는 데 교원질과 함께 이용되기도 하며³⁶⁾ 치주낭, 구개 부 상처 및 발치창의 치유에 키토산 분말을 이용하 여 좋은 결과를 얻은 보고³⁷⁾도 있다. Mu-zzarelli 등은 치주 창상에 키토산을 적용시 조직화가 증진되 며 섬유화가 감소되는 것을 보고하였고³⁸⁾, 뒤이어 골결손부에 키토산을 적용하여 정상골 형성을 증진 시켰다고 보고하였다³⁹⁾. Lee등은 키토산/tricalcium phosphate sponge를 조직공학에 응용하여 3차원

적 구조로 조골세포가 자랄 수 있는 골격을 제공할 수 있으며⁴⁰⁾ 또한 PDGF-BB의 운반체로서의 유용 성을 제시하였다⁴¹⁾. 그리고 키토산은 그 자체의 골 재생 유도능력으로 인하여 골대체물질로서도 많은 관심을 모으고 있다⁴²⁾. 골전도성을 가지며 임상적으 로 생체활성을 갖는 골대체물로도 유용하다는 보고 가 있으며 Klo-kkevold등¹⁶⁾은 in vitro 실험에서 키토산 투여시 흰쥐 두개관 세포가 대조군에 비해 유의성 있게 석회화 결절을 많이 형성하였으며 키토 산이 골아세포와 같은 골전구세포의 이동과 분화를 촉진시키는 기질 역할을 하는 반면, 섬유모세포와 같이 골 형성 방해하는 세포의 기능을 방해하여 간 접적으로 골 형성 증진시킬 수 있다고 하였다.

Malette등⁴³⁾은 개의 요골에 결손부를 형성하고 실 험군에 키토산을, 대조군에 생리식염수를 적용한 결 과, 대조군에서 일반적 골 생성-흡수의 골 개조 순 서를 보이며 가골이 형성된 반면, 키토산 처리 부위 에서는 가골 형성 없이 바로 피질골로 치유가 됨을 관찰하였다. 최근 골재생술식에 유용한 생체재료로 활용될 수 있음이 확인되었으며 고농도의 키토산이 치은섬유아세포의 골아세포로의 분화를 촉진하여 골 형성 촉진시킨다는 보고도 있다⁴⁴⁾. 이외에도 키토산 은 골 형성증진을 위해 다른 재료들과 혼합하여서도 사용되었는데 Ito등^17,45)은 키토산과 수산화인회석, 키토산과 β-tricalcium phosphate의 자가 경화 혼 합물을 개발하였으며, 이들 재료를 치주 결손부에 골 충전용 paste로 사용할 수 있다고 하였다. 본 연 구에서도 지금까지의 연구결과와 같이 키토산의 우 수한 골 재생 촉진 효과를 확인할 수 있었다. 실험결 과 키토산 충전 초기에는 골결손부 내부에 염증세포 침윤이 잔존하였고 미세하게 확장된 모세혈관 수의 증가가 나타났으며 시간이 경과함에 따라 공동 주변 에 골아세포로 판단되는 세포들의 일관성 있는 배열 이 관찰되었다. 실험 후반기에는 전반적으로 염증소 견은 관찰되지 않고 기존골 인접부위와 흡수된 키토 산 주변에는 골아세포의 배열이 전형적인 골 구조로 관찰되었다. 이러한 결과는 Klokke-vold등¹⁶⁾의 시 험관적 실험보고와 키토산이 치은섬유아세포의 골아

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세포로의 분화를 촉진하여 골 형성을 촉진시킨다는 김등⁴⁴⁾의 보고와 일치되는 경향이라고 판단된다.

최근 치주조직 재생에 특정 세포의 이동과 증식의 중요성이 밝혀지면서 그에 대한 조절을 시도하는 연 구가 진행되고 있다. 이러한 연구의 일환으로 성장 인자를 조직의 치유 촉진을 위해 적용하는 연구와 그 지지체에 대한 연구등도 활발히 시행되고 있다.

성장인자들은 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드로 써 창상 치유 과정 중에 일어나는 여러 가지 세포활 성도를 자극하는 생물학적 매개체이다. 이들 중 일 부는 섬유아세포의 화학주성 및 증식을 자극하고 기 질성분의 합성을 촉진시키며 특히 재생되는 세포의 증식속도를 촉진시킴으로써 선택적인 조직증식을 유 도할 수 있는 가능성이 제시되었다. 최근 골형태형 성단백질을 이용한 조직재생에 관한 연구가 활발한 데 1965년 Urist가 처음 발견하여 명명한 이래로 기능적 생물 검정을 통하여 천연의 골형태형성단백 질이 정제되었고 분자 클로닝과 재조합된 인간 골형 태형성단백질의 발현으로 수종의 골형태형성단백질 이 발견, 분류되었다. 일반적 특성, 아미노산 서열, 삼차원적 구조가 TGF-β와 유사성을 갖는 대가계로 알려져 있으며 이들은 다시 아미노산 서열의 유사성 에 따라 골형태형성단백질-2/-4군, 골형태형성단백 질-5/-6/-7/-8군, 골형태형성단백질-3/-12/-13군 의 3개의 소군으로 나누어지며, 생체내 여러 세포에 의해 합성되어 dimeric, glycosylated protein의 형태로 존재한다^21,23,24). 골형태형성단백질은 골 분 화과정의 기시제로 작용하여 태생기 분화 및 구강악 안면 조직을 포함한 신체 골격형성과 기관형성에 관 여하며 태생기 이후에도 치유될 골 조직으로 세포들 의 이주와 부착, 증식, 생합성 및 연골아세포와 골아 세포의 분화를 촉진시켜 골 형성을 유도하게 된다

23,46). 이외에도 미분화 간엽세포를 자극하여 정상적

인 골 대사 과정, 골절부위의 치유 및 이식골의 생착 등에 관여한다. 특히 다른 골대용 생체재료와 달리 골유도능을 지닌다는 사실에서 임상화에 성공할 경 우 골이식을 대신할 이식재로써 더 많은 관심이 집 중되고 있다. 또한 다른 성장인자들에 비해 골형태

형성단백질은 미성숙 연골아세포와 골아세포의분화 촉진뿐만 아니라 성숙된 골아세포에도 영향을 미치 므로 거의 무제한적인 골 형성능력을 가진다고 할

수 있다^21,26,47). 여러 실험을 통해 골형태형성단백질

중 골형태형성단백질-2/4군이 낮은 농도에서도 골 형성 능력이 뛰어나며^48,49) 구강 악안면 영역의 발생 에 많은 영향을 미치고 신생골 형성, 신생결합조직 부착부의 증가 및 신생백악질의 형성 촉진 등 치주 조직 재생에 영향을 미치는 것으로 보고되었다^50-52). 본 연구에 사용된 골형태형성단백질(rhBMP-4군) 은 2군과 더불어 다른 군에 비해 유전자 서열이 가 장 유사하며 낮은 농도에서도 골 형성능력이 뛰어나 많은 실험에 이용되고 있다. Choi등⁵³⁾은 골형태형 성단백질 2군을 성견의 3벽성 골내 결손에 이식하여 치조골재생의 효과가 있음을 보고하였고, Ahn등⁵⁴⁾ 은 골형태형성단백질 4군/흡수성 교원질 스폰지를 백서 두개골 결손에 이식시 탁월한 골재생을 보고한 바 있다. 또한 치배, 상아모세포층, 구개궁, 두개 안 면부 조직의 발생에 기여하며 손상된 치주조직의 치 유시 치근 흡수를 방지하고 치아의 유착을 줄여주며 치주인대와 백악질 및 치조골의 생성을 촉진하는 등 치주조직 재생에 영향을 미치는 것으로 보고되었다.

그러나 골형태형성단백질은 골형성 중간단계인 연 골 단계 없이 간엽에서 직접 골 형성을 일으키는 치 근강직을 보이며⁵⁵⁾, 순수 골형태형성단백질은 대량 생산이 힘들고, 체내에서 쉽게 확산되어 소실되므로 적용시 생리활성을 극대화시키기 위해서 서서히 지 속적으로 방출시키는 적절한 매개체가 필요하다는 단점들이 있다. 이 매개체를 지지체라 하며 골형태 형성단백질에 이상적인 지지체는 골형태형성단백질 과 결합이 양호하고, 생체 친화적이어야 하며, 증식 분화된 세포들에 대한 비계역할을 담당하며, 쉽게 제작, 구입할 수 있어야 하고, 가공 및 성형이 용이 해야 한다. 그리고 골 형성과 함께 흡수되어 소실되 거나 골과 일체화를 이룰 수 있어야 한다⁵⁶⁾. 본 연 구에서는 키토산을 지지체로 골형태형성단백질을 적용함으로써 각각 우수한 골재생 촉진효과를 나타 내는 두 물질의 상승효과를 기대하였으며 실험 결과,

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기존골과 신생조직과의 결합도 다른 군들에 비해 더 단단하였으며 신생골이 교원질군에 비해 더 많고 치 밀한 골구조를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 교 원질이나 키토산만 삽입시보다 골형태형성단백질을 같이 적용시 골조직재생에 더 효과가 좋음을 추측할 수 있다.

따라서 키토산은 그 자체로도 좋은 골대체물질로 생각되며 키토산과 골형태형성단백질 두 물질 모두 골조직 재생을 위해 적절하다고 생각된다. 향후 키 토산을 지지체로 골형태형성단백질을 적용시 적절한 적용 방법, 키토산만 적용한 군과의 장기적 결과 비 교, 키토산의 골재생 유도능력 작용 기전, 효과적인 골형태형성단백질의 사용 농도, 골형태형성단백질과 다른 성장인자들과의 작용, 치주 술식에서 이들의 보다 용이한 응용 등에 대한 더 깊이 있는 연구가 필요하다고 생각된다.

V. 결론

골결손부 재생에 응용되는 교원질, 골형태형성단 백질 그리고 골재생유도능력을 가지는 골형태형성단 백질과 키토산을 동시에 적용시 골결손부 재생과정 에 미치는 영향을 상호평가하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 비글 성견의 하악골에 편측당 3곳씩 원 형 인공적 결손부를 형성하고 교원질, 키토산, 키토 산을 지지체로하여 골형태형성단백질을 각각 적용한 후 1, 3, 8주에 희생하여서 생체의 치유반응을 조직 학적으로 비교 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 조골세포의 배열과 같은 신생골 형성의 징후는 기존골면에 인접한 부위와 키토산등 이식재 주 변부터 형성됨이 관찰되었다.

2. 골형성 속도는 골형태형성단백질과 키토산을 혼용한 군, 키토산 군, 교원질 군의 순으로 나 타났으며 혼용군에서는 다른 군들에 비해 좀 더 많은, 양질의 신생골을 형성하였다.

3. 다른 군과는 달리 혼용군에서는 술후 3주에 골 형성을 관찰 할 수 있었다. 술후 8주에는 세 군 모두에서 골형성 양상을 잘 관찰할 수 있 었으나 혼용군, 키토산군에서 교원질군보다 더 치밀한 골조직을 나타내었다.

상기 결과를 토대로 골형태형성단백질과 키토산은 골재생술식에서 유용하게 활용할 수 있다고 판단된 다. 특히 키토산은 골결손부 형태유지를 위한 부목 역할을 할 수 있으며 좋은 골이식재이나 골형태형성 단백질을 같이 사용시 그 효과가 훨씬 더 좋으리라 생각된다.

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(11)

사진 부도 설명

Figure 1. Collagen group, 1 week (x40, H&E stain)

The demarcation between original bone tissue and artificial bone defect was clear. Collagen fibers were filled and the inflammatory cells were infiltrated in the defect.

Figure 2. Higher magnification of the Figure 1. (x100, H&E stain) Figure 3. Collagen group, 3 weeks (x40, H&E stain)

Collagen fiber bundles were arranged irregularly and infiltration of inflammatory cells were observed in the defect.

Figure 4. Higher magnification of the Figure 3. (x100, H&E stain)

There were enlarged vessels in the center area and dense connective tissue was stained strongly, but new bone formation was not observed.

Figure 5. Collagen group, 8 weeks (x40, H&E stain)

The new woven bone was observed in many areas and surrounding collagen.

Figure 6. Higher magnification of the Figure 5. (x100, H&E stain)

Dense connective tissue was observed. Active osteoblasts, which were stained strongly, were lined at the borders of the original bone and around many cavities where collagen had been filled.

Figure 7. Chitosan group, 1 week (x40, H&E stain)

Collagen fibrils were filled and inflammatory cells were infiltrated in the defect where chitosan had been filled.

Figure 8. Higher magnification of the Figure 7 (x100, H&E stain)

Chitosan was in the course of resorption. The number of minutely enlarged vessels was increased and collagen fibrils were observed.

Figure 9. Chitosan group, 3 weeks (x40, H&E stain)

The new tissue was separated from the original bone because of weak integration and there were strongly stained osteoblasts in some integrated areas and around cavities.

The integration of the two tissues and well-arranged collagen fibers were observed.

Figure 11. Chitosan group, 8 weeks (x40, H&E stain)

Osteoblast lining was observed near the original bone and around resorbed chitosan. The new bone in the form of bony spicule was remarkable.

(12)

Many osteoblasts were observed around the cavities and typical bone structure, which was still immature, was presented in some areas. Strongly stained active osteoblasts were lined near the original bone.

Figure 13. rhBMP-4 / chitosan group, 1 week (x40, H&E stain)

Many inflammatory cells were infiltrated. Much collagen formation and irregular collagen fiber bundles were observed.

The number of minutely enlarged vessels was increased and dense collagen fibers were observed.

Figure 15. rhBMP-4 / chitosan group, 3 weeks (x40, H&E stain)

The complete integration of the old and new tissue was remarkable and enlarged vessels, resorbing chitosan, and the collagen fibers around the chitosan were observed in the defect.

The line of strongly stained fibroblasts perpendicular to the old bone was Regularly arranged collagen fiber bundles and new bone formation were presented.

Figure 17. rhBMP-4 / chitosan group, 8 weeks (x40, H&E stain)

Chitosan was resorbing and new bone formation was observed in the form of regular bony spicule from the old bone. The new bone was more and denser than the collagen group.

The new bone contains many osteoblasts, presenting immature appearance, but was denser than in collagen group. Active osteoblasts were stained strongly and lined at the surface of the new bones.

(13)

사진부도 (Ⅰ)

Figure 1.

Figure 2.

Figure 3.

Figure 4.

Figure 5.

Figure 6.

(14)

사진부도 (Ⅱ)

Figure 7.

Figure 8.

Figure 9.

Figure 10.

Figure 11.

Figure 12.

(15)

사진부도 (Ⅲ)

Figure 13.

Figure 14.

Figure 15.

Figure 16.

Figure 17.

Figure 18.

(16)

-Abstract-

The effect of combinat ion of rhBMP-4 and chit osan on the regeneration of bone defects

Kyung-Lhi Kang ․Joon-Bong Park ․Young-Hyuk Kwon Yeek Herr ․Jong-Hyuk Chung

Department of Periodontology, Kyung Hee University, Seoul, Korea

The aim of this study is to evaluate the effects of combination of rhBMP-4 and chitosan, which have osteoinductive capacity, on the regeneration of bone defects in dogs. Three beagle dogs aged over one and half years and weighed about 15Kg were used in this study. Three round defects were made by trephine bur in each side of mandibles. Each defect was filled with collagen, chitosan, rhBMP-4/chitosan. The dogs were sacrificed at 1, 3 or 8 weeks postsurgery and the results were evaluated histologically.

The results of this study were as follows:

1. The sign of new bone formation, rearrangement of osteoblasts was revealed adjacent of preexisted bone or around graft materials such as chitosan.

2. The descending order of groups in bone regeneration speed was the rhBMP-4/chitosan group, chitosan group, collagen group. In the combination group, new bone was regen- erated more and in better quality than others.

3. The regeneration of bone was observed in the rhBMP-4/chitosan group in 3 weeks after surgery. In 8 weeks after surgery, bone regeneration was observed in all three groups, and new bone at 8th week was denser in the chitosan and rhBMP-4/chitosan group than collagen group.

In conclusion, rhBMP-4 and chitosan can be applied in the bone regeneration procedures usefully. It is considered that chitosan can be a splint for the maintenance of the defect form and produce much better effect when used with good grafting material or bone morphogenetic protein.²⁾

Key words：rh MBP-4, chitosan, regeneration.