대립유전자 특이 시퀀싱으로 분리한 대립유전자를 가진 2예

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접수일：2011년 3월 31일, 수정일：2011년 4월 15일, 승인일：2011년 4월 15일

책임저자：조 덕 519-809 전남 화순군 화순읍 일심리 160 화순전남대학교병원 진단검사의학과

대립유전자 특이 시퀀싱으로 분리한 Aw10 대립유전자를 가진 2예

원은정ㆍ조 덕ㆍ신명근ㆍ권소영¹ㆍ조남선¹ㆍ양동욱

전남대학교 의과대학 진단검사의학교실, 대한적십자사 혈액수혈연구원¹

= Abstract =

Two A

weak

B Cases with Aw10 Allele Separated by Allele-specific Sequencing

Eun-Jeong Won, Duck Cho, Myung-Geun Shin, So-Yong Kwon¹, Nam-Sun Cho¹, Dong-Wook Ryang

Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Blood Transfusion Research Institute, Korean Red Cross¹, Seoul, Korea

We separated an Aw10 allele by allele-specific sequencing in two Aw10/B101 samples that had the AweakB phenotype. Two samples with the A102/B101 genotype were also tested as a control. The reverse primers using position 930 at exon7 were designed for allele-specific sequencing. The differential positions were a total of 52 points for distinguishing the A-allele from the B-allele. Although overlaps with another haplotype allele that showed a minor chromatographic peak were observed in almost all the points, the specific allele-separation rate was 100% (52/52) by assessing the dominance in the chromatographic peak height. Based on the separation rate in the two cases with Aw10/B101 and the two AB controls, allele-specific sequencing is a convenient and reliable method for the separating the A-allele and B-allele in a clinical laboratory. (Korean J Blood Transfus 2011;22:59-64)

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Key words: ABO gene, Allele separation, Allele-specific sequencing

서 론

ABO유전자에 대한 선행 연구 결과에 의하면,

^1-4)

A형과 B형 대립유전자의 cDNA 비교시 297번, 526번, 657번, 703번, 796번, 803번 그리고 930번 의 7개의 염기를 제외하고는 그 염기서열이 모두 같다. 이를 바탕으로 해외 뿐 아니라 한국인의 각 종 ABO 아형에서 새로운 ABO 대립유전자가 규

명되어 Blood Group Antigen Gene Mutation Data- base에 등록되고 있다.

^3-11)

일반적으로 새로운 대 립유전자의 변이를 의심되면 명확한 규명을 위해 대립유전자 분리(allele separation)가 필수적이다.

그간 소개된 방법은 표준법인 클로닝법, 최근에

소개된 bead를 활용한 Dynabeads M-270 Streptoa-

vidin법, haplotype PCR법, 그리고 대립유전자 특이

시퀀싱(allele specific sequencing, AS-sequencing)이

(2)

다.

6,7,10,12,13)

이들 중 클로닝 법은 복잡하고 시간 및 노동력이 많이 소요되는 단점이 있고, bead 법 은 비교적 정확한 결과를 보이는 반면, 비용이 많 이 들고 시행 과정이 복잡한 한계점이 있다. Seo 등은 한국인에서 발견된 새로운 B 아형을 규명하 기 위해 haplotype PCR을 적용하였는데,

¹⁰⁾

그들은 ABO 유전형 분석을 위해 사용된 염기서열분석 법과 다른 새로운 PCR 조건을 확립해야 했다. 한 편, 대립유전자 분리를 위해 HLA 분야 등에서 사 용되어 온 대립유전자 특이 시퀀싱은 분석을 위 해 증폭한 PCR 산물을 그대로 활용하고, 다만 대 립유전자 특이 시발체만을 사용하면 되므로 추가 적인 노력 없이 대립유전자를 분리하는 방법이 다.

¹⁴⁾

그런데, 이처럼 편리한 대립유전자 특이 시 퀀싱은 그간 ABO 유전자의 새로운 대립유전자 규명에는 널리 사용되지 않았고, 국내에서도 시 도되지 않았다. 이에 저자들은 표현형은 AwB, 유 전형은 Aw10/B101를 보인 2검체에서 Aw10 대립 유전자를 분리하고자 930번 염기의 다형성을 이 용하여 역방향으로 대립유전자 특이시발체를 고 안하여, Aw10를 대립유전자 특이 시퀸싱으로 분 리하였기에 ABO 대립유전자 분리에 관한 문헌 고찰과 함께 보고하는 바이다.

증 례

유전자검사동의서와 함께 ABO 유전형 검사가 의뢰되어 Aw10 대립유전자가 규명되었던 두 검 체를 대상으로 하였으며 그 혈청학적 검사는 ABO 혈구형 검사에서 항-A (Bioscot, Livingston, UK)에 trace, 항-B (Bioscot, Livingston, UK)에 4＋, 항-AB (Biotest, Dreieich, Germany)에 3∼4＋, 항- A

1

에 음성, 항-H (Biotest, Dreieich, Germany)에 1∼

2＋였으며, 혈청형 검사에서 A

1

혈구에 trace, B 혈구에 음성 반응을 보였다. 대조군으로는 정상

적인 AB 표현형을 보이며 A102/B101 유전형을 가진 두 검체를 사용하였다.

1. 대립유전자 특이 시퀀싱

ABO 유전자의 액손 6과 7에 대한 분석은 Cho 등이 보고한 방법으로 시행하였는데, 간략하게 기술하면 다음과 같다.

⁶⁾

EDTA 전혈에서 DNA를 추출하여 ABOe6F와 ABOe7R 시발체 쌍으로 exon 6 및 7을 포함하는 2,080 bp를 증폭하였고 시퀀싱 은 ABOe6R, ABOe7F, ABOe7SF1 및 ABOe7SF2 으로 실시하였다. 대립유전자 특이 시퀀싱은 동 일한 조건에서 증폭한 PCR 산물을 정제한 후 형광 dNTP가 들어 있는 Big dye Terminator cycle sequen- cing kit (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 시퀀싱을 실시하였다. 이때 사용한 시발체는 A 대립유전자 특이한 930A_R (5’-GGTTTGTGGCGCAGC-3’), B 대립유전자 특 이한 930B_R (5’-GGGTTTGTGGCGCAGT-3’)이 었다. PCR 조건은 96

^o

C에서 1분간 처리한 후에 96

^o

C 10초, 50

^o

C 5초, 60

^o

C 4분씩 25회 증폭하고 난 후 마지막 4

^o

C로 유지하였다. 자동염기서열 분석은 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer/Applied Biosystems)을 이용하였다.

2. 대립유전자 분리 후 염기서열 분석

분리된 대립유전자의 분석 시에는 2개 이상의

peak이 있을 경우 우위 피크(dominant peak)를 해

당 유전자로 분석하였으며, 이를 A-대립유전자

혹은 B-대립유전자의 표준 염기서열과 비교하여

특이대립유전자 분리율을 산정하였다. ABO 유

전자의 염기서열의 비교 분석은 A101 유전자(Gen-

Bank Accession Number AJ536122)의 염기를 기준

으로 하여 검체에서 얻은 염기서열을 SEQUENCHER

(Gene Codes Corp, Ann Arbor, USA) software를 사

용하여 비교 분석하였다. 대조군으로 삼은 정상

(3)

Table 1.

Allele separation rate of 2 A102/B101 and 2 Aw10/B101 by allele-specific sequencing

Allele specific primer Differential base points in exon 7 of ABO gene

Matched points/total points

467 526 657 703 784 796 803

930A_R* 4/4 4/4 4/4 4/4 2/2 4/4 4/4 26/26 (100%)

930B_R^† 4/4 4/4 4/4 4/4 2/2 4/4 4/4 26/26 (100%)

*930A_R is designed for the selection of A or Aw10 allele, ^†930B_R is designed for the selection of B allele.

Fig. 1. A representative example of allele-specific sequencing of exon 7 in a sample that had the Aw10/B101.

Upper figure shows chromatogram obtained from the sequencing of ABOe7F, ABOe7SF1, ABOe7SF2 primers for common ABO alleles (A, B, O allele). Middle figure shows chromatogram obtained from the sequencing of 930A_R primer which was designed for A allele separation. Lower figure shows chromatogram obtained from the sequencing of 930B_R primer which was designed for B allele separation. Chromatogram of allele-specific sequencing (middle and lower figure) shows a peak dominant pattern in each allele-specific primer at all points.

AB형, A102/B101 유전형을 갖는 두 검체의 염기 서열분석 결과 6개의 감별 위치에서, 930A_R로 시행한 경우 467T, 526C, 657C, 703G, 796C, 803G 에 dominant peak을 보여 해당 A대립유전자와 일 치하였으며, 930B_R로 시행한 경우 467C, 526G, 657T, 703A, 796A, 803C에 dominant peak을 보여 B대립유전자와 일치하였다. 한편, AweakB 형,

Aw10/B101 유전형을 갖는 두 검체는 784번 염기

감별점이 추가되어 총 7개의 감별 위치를 분석하

였다. 930A_R로 시행한 경우 784A를 포함한 467T, 526C, 657C, 703G, 796C, 803G에서 do- minant peak을 보여 해당 Aw10과 일치하였으며, 930B_R로 시행한 경우도 모든 감별점에서 해당 B대립유전자와 일치하였다(Fig. 1).

대립유전자 특이시퀀싱으로 분리한 염기서열

분석시 감별점으로 A102/B101 분리의 경우 6개의

감별 부위가 사용되었으며, Aw10/B101 분리의 경우

Aw10 대립유전자가 784G＞A을 특징으로 갖기

(4)

때문에 7개의 감별 부위가 사용되었다. 930A_R로 생성된 chromatographic peak은 총 26감별점에서 모두 해당 특이 대립유전자와 100% (26/26) 일치 하였고, 930B_R에 의해 생성된 감별점도 100%

(26/26) 동일하였다(Table 1).

고 찰

ABO 유전형 검사는 혈액은행 검사실에서 자 주 접하는 ABO 불일치의 해결이나 각종 ABO아 형의 확진 등에 사용되는 중요한 검사이다. 그 중 직접염기서열분석법은 ABO유전자의 분석부위 의 자세한 염기서열 정보를 주기 때문에 불일치 의 해결 뿐 아니라 새로운 유전자를 규명하는데 널리 사용되고 있다. 그런데 직접염기서열분석을 통해 새로운 ABO 대립유전자가 의심되면 대립 유전자 중 어느 쪽에서 기원했는지를 규명하는 것이 중요하다. Won 등이 보고한 바에 의하면,

cis-AB를 의심하고 시행한 ABO 유전형검사에서

703G＞A의 새로운 변이가 발견되었다. 처음에는 이 변이가 cis-AB 대립유전자에서 기원할 것으로 예상했지만, 대립유전자분리를 통해 해당 변이는 O대립유전자에 기원한 새로운 O

var

대립유전자라 고 밝힌 바 있다.

¹⁵⁾

이처럼 새로운 ABO대립유전 자가 의심되면 클로닝 법, haplotype PCR법, 최근 소개된 bead법 등으로 대립유전자 분리를 시행한 다.

6,7,10,12,13)

하지만, 이들 방법은 시간, 노동력 및 비용이 많이 소요되어 검사실에서 간편하게 시행 하기가 어렵다. 이에 본 연구에서는 본 기관의 검 사실에서 일상적으로 사용하고 있는 ABO 유전 형 분석과 동일하게 PCR을 시행하고, 이 산물을 대립유전자 특이 시발체로 시퀀싱하였다. 이를 위해 고안한 대립유전자 특이 시발체는 A-대립 유전자와 B-대립유전자의 감별점 중의 하나인 엑 손 7의 930번 염기 위치를 활용하였다. 930번 위

치에서 역방향(reverse)으로 시발체를 제작하면 다른 감별점보다 한국인에서 흔히 보고되는

cis-AB (803G＞C), B306 (547G＞A), Aw10 (784G＞

A) 등의 대립유전자를 보다 효율적으로 분리할 수 있기 때문이었다.

^5-7)

역방향으로 제작한 시발 체 930A_R은 3’ 끝 염기서열이 A-대립유전자와 일치하고, 930B_R은 B-대립유전자와 일치하게 제작하여 대립유전자에 특이하게 반응하도록 고 안하였다.

이렇게 고안한 대립유전자 특이 시퀀싱을 정상 인 A102/B101형 두 검체, Aw10/B101 두 검체에 시 행한 결과, 모든 감별점(52곳)에서 대립유전자 특 이적인 peak뿐만 아니라 비특이적인 minor peak이 함께 관찰되었다. 하지만, 분석한 모든 감별점에서 100% (52/52) 특이 시발체에 의해 생성된 chromato- graphic peak이 우월한(dominant) peak을 보여 정 확하게 대립유전자 분리를 할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 연구에서는 A-와 B-대립유전자 분리의 효 능을 확인하기 위해 액손 7의 후반부에 위치한 930번을 활용하였으므로, 한국인에서 보고된 Aw14,

B308과 같이 본 시발체로 분석할 수 있는 범위를

넘어선 위치의 변이가 있는 경우이거나, O-대립 유전자의 분리를 위해서는 다른 시발체의 제작이 필요할 것이다.

¹¹⁾

또한 혼입된 대립유전자 비특 이적인 minor peak을 줄이기 위해서는 시발체의 변형 및 개선된 시퀀싱 조건의 확립이 필요할 것 이다.

본 연구에서 저자들은 표현형은 AwB, 유전형 은 Aw10/B101를 보인 2검체에서 Aw10 대립유전 자를 대립유전자 특이 시퀸싱으로 분리하였다.

또한 이를 정상 AB형 A102/B101 유전형을 가진

두 검체를 대조군으로 사용하여 대립유전자 분리

능을 확인하였다. 비록 비 특이적인 chromatographic

peak의 혼입이 관찰되었지만, 분석한 모든 감별

(5)

점에서 특이적인 시발체로 얻은 chromatographic peak이 항상 우월하여 ABO 유전자의 대립유전자 를 정확하게 분리할 수 있었고, 이는 일반 검사실 에서도 간편하고 유용하게 사용될 수 있을 것이 다.

요 약

저자들은 표현형은 AwB, 유전형은 Aw10/B101 를 보인 2검체에서 Aw10를 대립유전자 특이 시 퀸싱으로 분리하였다. 이때 대립유전자 특이시발 체는 930번 염기의 다형성을 이용하여 역방향으 로 고안하였고, 정상 AB형, A102/B102 유전형을 가진 각각 2검체를 대조군으로 사용하였다. 대조 군으로 포함한 총 4검체의 A- 및 B-대립유전자의 감별 위치는 총 52곳이었다. 비록 모든 감별점에 서 특이 대립유전자와 비특이대립유전자가 공존 하였지만, ‘peak dominance’를 근거로 100% (52/

52)에서 대립유전자를 비교적 간편하고, 정확하 게 분리할 수 있었다. 이와 같이 AwB 2예에서

Aw10 대립유전자를 분리하는데 적용한 본 대립

유전자 특이 시퀀싱은 ABO 유전학 분야에서 간 편하고 신뢰할 만한 A- 및 B- 대립유전자 분리법 으로 사용될 수 있을 것이다.

감사의 글

본 연구에 기술적 도움을 주신 화순전남대병원 정성두, 황유미 선생님께 감사드립니다.

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