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©The Korean Society of Food Science and Technology
발효옻 추출물의 헬리코박터파이로리 생장억제 및 항염증 활성
최은영·석기태
1·최한석
2·김명곤
3·권용수
4·김명조
5,*
강원대학교 식물자원응용과학전공, 1한림대학교 의과대학 내과학교실, 2농촌진흥청 국립농업과학원 발효식품과, 3전북대학교 식품공학과, 4강원대학교 약학과, 5강원대학교 한방바이오연구소
Anti-inflammatory activities of fermented
Rhus verniciflua stem bark
extract and its growth inhibitory effect on
Helicobacter pylori
Eun Yeong Choi, Ki Tae Suk1, Han Seok Choi2, Myung Kon Kim3, Yong Soo Kwon4, and Myong Jo Kim5,* Applied Plant Sciences Program, Kangwon National University
1Department of Internal Medicine, Hallym University College of Medicine 2Fermented Food Science Division, National Academy of Agricultural Science, RDA
3Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University 4Department of Pharmacy, Kangwon National University
5Bioherb Research Institute, Kangwon National University
Abstract This study was designed to investigate the beneficial effects of fermented Rhus verniciflua stem bark extract (RVSBE) on the stomach. We evaluated RVSBE for its antimicrobial activity against Helicobacter pylori (H. pylori), along with its ability to reduce the viability of human gastric cancer AGS cells. In addition, its anti-inflammatory effect was examined by evaluating nitric oxide (NO) production, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX)-2 mRNA expression in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells. RVSBE showed antimicrobial activity, as 2.0 mg of the extract produced a clear inhibition zone of 4.0 mm. RVSBE inhibited the growth of AGS cells by 20% at concentrations ranging from 0.25-1.0 mg/mL. Regarding the anti-inflammatory effects of RVSBE, at 0.1-1.0 mg/mL, the extract showed more than 75% inhibition of NO production. In addition, cells treated with 0.25 mg/mL RVSBE showed a 25% decrease in iNOS mRNA levels compared to those in the LPS-treated cells. These results suggest that RVSBE may have significant inhibitory effects on inflammatory mediators, and therefore, may be a potential anti-inflammatory candidate. Keywords: fermented Rhus verniciflua, Helicobacter pylori, AGS cell, anti-inflammatory response
서
론
1983년 Warren과 Marshall에 의해 발견된 Helicobacter pylori (H. pylori)는 그람음성, 미호기성 간균으로서 발견된 이래 지속적 으로 많은 연구가 이루어지고 있으며, 최근에는 사람의 위점막 조직에 정착하여 살면서 만성 위십이지장 질병과 위암을 일으키 는 원인 세균으로 밝혀졌다(1,2). Yim 등(3)이 보고한 바에 따르 면 우리나라 16세 이상 H. pylori 유병률은 59.6%로 나타났으며, 남성이 여성보다 감염비율이 높고 50대에서 가장 높은 유병률을 가진다고 조사되었다. 보통 H. pylori 감염경로는 점염에 의한 것 으로 알려져 있으며, 한국인의 경우 가족간의 공동 생활과 전통 적인 식습관에 의하여 기타 선진국에 비하여 높은 보균율을 가 지고 있다고 보고되고 있다(4). H. pylori 감염에 의하여 유발되 는 위염은 일반적으로 선조직의 염증으로 점막의 염증 중 가장 중요한 변화로 알려져 있으나, 실질적으로 선조직 뿐만 아니라 점막하층, 근층, 장막에까지 염증이 미치고 있는 것을 포괄적으 로 위염이라고 한다(5). 만성 위염에 대한 최근 연구에서 종양억 제 유전자의 촉진자 메틸화에 대한 다양한 보고가 이루어지고 있 으며, 이러한 종양억제 유전자 촉진자의 메틸화는 최근 주요 발 암기전으로 대두되고 있는 실정이다(6).
옻나무(Rhus verniciflua)는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 낙 엽 활엽 교목으로 원산지는 중앙아시아 고원과 히말라야지방으 로 알려져 있으며, 현재는 열대지방을 중심으로 아열대와 온대지 방에 널리 분포하고 있다(7). 옻나무 껍질에 상처를 내면 나오는 수액을 옻이라 하며 옻은 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용 되어 왔다. 옻나무에 대한 기록은 중국에서 약 4000년 전부터 재 배를 시작, 우리나라에서는 2000년된 옻칠기가 발견되어 이용 역 사를 추측하고 있으며, 어혈제거, 구충 및 위장질환 등의 민간요 법으로 사용 되어 왔다는 기록이 남아 있다(8). 이러한, 옻나무 수피에는 urushiol, fisetin, fustin, sulfuretin, butein등 다양한 유효 성분이 함유되어 있다고 알려져 있으나, 이중 urushiol의 경우 알 레르기 성분으로 수포, 가려움, 발진 등을 동반한 접촉성피부염 을 유발하기 때문에 그 사용범위가 매우 제한적이었다(9). 그러 나, 2004년 식품의약품안정청에서는 urushiol 성분을 제거한 옻나 무 물 추출물 형태로 옻닭 또는 옻오리 조리용으로 사용할 수 있 도록 규제를 완화하여 제한적 사용을 허가함으로써 옻나무의 *Corresponding author: Myong Jo Kim, Applied Plant Sciences
Pro-gram, Kangwon National University, Chuncheon, Gangwon 24341 Korea
Tel: +82-33-250-6413 Fax: +82-33-244-6413 Email: [email protected]
Received May 18, 2016; revised June 16, 2016; accepted June 21, 2016
urushiol을 제거할 수 있는 다양한 방법들이 개발되어 이용되고 있다(10). 한의학에서는 옻나무를 몸 안에 뭉친 피를 제거하여 혈행에 도 움을 주며, 지혈, 살충, 소산적체(消散積滯)시키는 효과를 가지고 있어 위장질환과 암 치료 등에도 사용되어왔으며, urushiol 성분 을 제거한 추출물에서도 항암, 산화방지 효과가 있다는 연구가 보고된바 있다(11). 그러나, 최근까지 식용으로만 사용되었던 옻 나무의 위장질환 개선효과에 관련된 연구가 미비하고 특히, urushiol 성분이 제거된 옻나무를 이용한 연구는 더욱이 미비한 상태이다. 이에, 본 연구에서는 장수버섯(Fomitella fraxinea)을 이용하여 발 효처리 한 무독화 옻나무 추출물을 이용하여 위장기능 개선능을 평가하고자, 발효옻나무 추출물의 H. pylori 생장억제활성을 확인 하고 H. pylori에 의하여 유발되는 위장 내 염증발생 억제능을 평 가함으로서 무독화 옻나무의 위장기능 관련 식의약 소재로서의 개발가능성을 제시하고자 한다.
재료 및 방법
시료준비 본 시험에 사용된 발효옻은 Choi 등(12)이 수행한 방법으로 옻 나무 껍질에 장수버섯 종균(Fomitella fraxinea)을 혼합 접종하여 발효하여 urushiol 성분을 제거 한 껍질을 국립농업과학원에서 제 공받았다. 발효된 옻나무 껍질은 다시 질량 대비 5배수의 증류수 를 첨가하여 95oC로 8시간동안 열수추출 한 후 여과하여 동결 건조 하였다. 건조된 시료는 urushiol 표준품과 비교하여 urushiol 성분이 제거된 것을 확인 한 후 일정 농도로 희석하여 실험에 사 용하였다(13). Helicobacter pylori 생장억제 활성Helicobacter pylori (H. pylori) 균주는 한국 헬리코박터 은행((재) 연구소재중앙센터)에서 분양받아 실험에 사용하였다. H. pylori 생 장 억제효과를 확인하기 위해 brucella broth medium (BD, Fran-klin Lakes, NJ, USA)에 10% Bovine serum (GIBCO, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 petri dish에 분주하여 배지를 준비 하였다. 생장억제 활성 검정은 Cho 등(14)이 검정한 방법을 변형 하여 수행하였으며 적정 배지에 H. pylori 균을 도말 한 후 37oC,
10% CO2조건에서 2일간 배양한 후 실험에 사용하였다. 실험은 디스크 확산법과 시료를 배지에 혼합하여 조성하는 방법으로 수 행하였다. 디스크 확산법은 일정농도로 희석된 시료를 종이디스 크(ø 8 mm, Advantec, Tokyo, Japan)에 20 μL씩 주입 후 H. pylori 가 도말 된 배지에 삽입한 후 배양기에서 37oC의 미호기 성 조건에서 24시간 증식 후 디스크 주위의 clear zone 생성 여 부로 각 시료의 생장억제능을 확인하였다. 배지조성법은 적정배 양 배지 조성시 일정량의 시료를 배지에 첨가하여 조성 한 후 H. pylori 균을 도말하여 균의 증식여부를 확인하였다. 세포배양 실험에 사용한 위암세포 AGS 세포와 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분 양받아 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)와 1% antibiotic mixture (Penicil-lin-Streptomycin Solution, HyClone Laboratories)가 함유된 RPMI-1640 medium (HyClone Laboratories)과 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, HyClone Laboratories)에서 5% CO2,
37oC 조건으로 CO2 humidified incubator (NU-5510G, NuAire Inc., Plymouth, MN, USA)에서 배양하였다. 세포는 일정 주기로 계대배양을 실시한 후 실험에 사용하였다. 세포생장활성 검정 발효옻 추출물의 세포생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 이용한 방법에 의해 측정하 였다. 일정량 이상으로 배양된 세포를 1×105 cell/well의 밀도로 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양시 사용된 배 지를 깨끗이 제거한 후 배지 90 μL와 농도별로 희석된 시료를 10μL씩 첨가하여 5% CO2 incubator (NU-5510G, NuAire Inc.)에 서 24시간 배양하였다. 이후 기존의 배지를 모두 제거한 후 5 mg/ mL의 농도 용해시켜 제조한 MTT (Sigma, St. Louis, MO, USA) 10μL를 새로운 배지 90 μL와 함께 첨가하여 3시간 동안 배양한 후 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO, Daejung, Siheung, Korea) 100μL를 첨가하여 microplate reader (Model-680, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도(Abs)를 측정하여 세포의 생존율을 대조구와 비교하여 백 분율로 표시하였다.
Cell viability (%)=(Abs sample/Abs control)×100
Nitric oxide (NO) 생성 저해율
추출물의 NO 생성 저해효과를 측정하기 위하여 마우스 대식 세포(RAW 264.7 cell)에 lipopolysaccharide (LPS, Sigma)를 처리 하여 염증을 유도하여 실험에 사용하였다. LPS에 의해 발생된 NO 생성량을 확인하기 위하여 일정기간 배양된 세포를 96 well plate에 1×106 cell/well의 밀도로 분주하고 24시간 배양하였다. 각 반응구에 농도별로 추출물을 첨가한 후 최종농도 1.0 μg/mL의 농 도가 되도록 LPS로 동시처리 또는 LPS를 단독 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 상층액 100 μL와 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine in 25% phosphoric acid) 100μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader (Model-680, Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 540 nm에서 흡광도(Abs)를 측정하여 NO 생성 저해율을 LPS 무 처리구와 비교하여 백분율로 표시하였다.
Inhibition rate (%)=[1−(Abs sample/Abs control)]×100
RT-PCR
mRNA 수준에서의 염증 관련 바이오마커를 이용하여 발현도 를 RT-PCR로 확인하였다. RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1×106 cell/well의 밀도로 분주하여 시료를 농도별로 처리하고 24 시간 처리 후 Total RNA Extraction Kit (Intron, Seongnam, Korea)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA의 농도를 측 정하여 정량하였으며, 이를 이용하여 cDNA를 합성한 후 template 로 사용하여 각각의 유전자를 polymerase chain reaction (PCR, SC200, Kyratec, Queensland, Australia)방법으로 증폭하였다.
Internal control로는 glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase (GAPDH)를사용하였다. 각 PCR 산물들은 1% agarose gel (USB Co., Cleveland, OH, USA)을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr)를 이용하여 UV하에서 image analyse system (Fir-eReader, UVITec Co., Cambridge, England)을 이용하여 발현정도 를 확인하였다. RT-PCR에 사용한 primer의 염기서열은 Table 1과 같다.
통계처리
모든 실험의 통계처리는 Statistical Package for Social Sciences (SPSS, version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준편차를 산출하였으며 T-test를 사용하여 유의성을 p<0.05, p<0.01 수준에서 검증하였다.
결과 및 고찰
Helicobacter pylori 생장억제 활성(in vitro)
H. pylori 생장억제 활성은 디스크 확산법과 배지조성법을 이 용하여 측정하였으며 측정 결과는 Fig. 1과 같이 확인되었다. 일 정하게 균을 도말 한 배지 위에 발효옻 추출물을 0.05-2.0 mg을 접종한 ø 8 mm의 종이 디스크를 일정 간격으로 배치 한 후 24 시간 후 디스크 주변에서 H. pylori 생장억제구역을 확인하였다 (Fig. 1 E,F). 접종된 종이디스크 주변으로 시료농도 0.1 mg까지는 저해환 확인 할 수 없었으나 0.2 mg 이상의 용량을 접종한 경우 종이디스크 주변으로 1.0 mm의 생장억제구역이 확인되었으며, 2.0 mg을 접종한 경우 4.0 mm의 생장억제구역을 확인하였다. 그러나, 디스크 확산법의 경우 시료를 고농도로 처리할 경우 배지에 시 료의 색상이 착색되고 디스크 접종가능 농도에 한계점이 있어 디 스크 확산법으로 확인된 생장억제 농도를 재검정하고자 배지에 일정량의 시료를 첨가하여 배지를 조성하는 방법으로 확인된 농 도 범위에서 재검정하였다. 배지조성법은 H. pylori 배지 제조시 발효옻 추출물을 1.0-5.0 mg/m의 농도로 혼합하여 제조한 후 추 출물을 첨가한 배지와 추출물을 무첨가 한 배지 각각에 H. pylori 를 도말한 후 증식여부로 생장억제 활성을 확인하였다. 추출물 무첨가 혼합 배지에서는 정상적인 H. pylori의 성장이 확인되었 으나 추출물을 농도별로 첨가한 모든 배지에서는 H. pylori 증식 이 억제되는 것을 확인하였다. 1.0 mg을 첨가한 배지에서는 무 첨가 배지와 비교하였을 때 H. pylori 접종구역과 비접종 구역간 의 경계가 감소하는 추이를 보였으며, 2.0 mg 이상의 농도에서는 경계에서 H. pylori 성장이 확인되지 않았다(Fig. 1 A-D). 이에 상 기의 in vitro 실험을 통하여 발효옻 추출물의 H. pylori 생장억제 활성을 확인하였다. 이는 Kim(15)이 연구한 아세트산의 H. pylori 항균 능력과 비교하였을 때 발효옻 추출물의 항균 활성을 확인 한 결과이다. 기존 아세트산을 이용한 연구에서 유기산이 H. pylori 억제에 효과가 뛰어나다는 연구 결과를 바탕으로 아세트산의 항 균활성을 농도별로 측정한 결과 아세트산 0.7%를 처리하였을 때 2.0 mm의 생장억제구역을 생성되었으며, 아세트산의 농도가 증가 할수록 단시간 내에 항균활성을 확인 할 수 있었다. 그러나, 아 세트산을 이용한 in vivo 연구 진행시 기내 실험보다 더욱 고농 도에서 항균활성을 확인할 수 있었으며, 아세트산 투여시 고농도 로 사용 할 수 없다는 한계점을 가지고 있다는 점과 비교하였을 때 발효옻 추출물은 다양한 농도 범위로 실험에 적용 할 수 있 다는 점을 주목 할 수 있다. 또한 특정 물질을 단리하지 않은 열 수 추출물에서 생장억제활성을 나타냈다는 점을 고려하였을 때 H. pylori 억제와 관련된 연구 개발 범위가 식의약 소재를 포함 Table 1. Sequences of primer used in real-time PCR analysis
Name Sequences
iNOS Forward 5'-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3' Reverse 5'-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3' COX-2 Forward 5'-CACTACATCCTGACCCACTT-3'
Reverse 5'-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3' GAPDH Forward 5'-CACTCACGGCAAATTCAACGGCAC-3'
Reverse 5'-GACTCCACGACATACTCAGCAC-3'
Fig. 1. Antimicrobial activity of fermented Rhus verniciflua stem bark extract against Helicobacter pylori. The sample was enclose in the medium (A-D) and paper disc (E-F).
하여 더욱 방대해질 수 있을 것으로 생각된다. 발효옻 추출물 처리에 따른 위암 세포 생장억제활성 H. pylori는 위점막에 기생하면서 만성위염, 소화성궤양 및 위 암을 일으키는 것으로 알려져 있으며 감염자의 0.1-3%가 위암을 일으키는 것으로 보고되고 있다(16). 앞선 연구에서 발효옻 추출 물의 H. pylori의 성장억제능을 확인하였으며 추가적으로 위암발 생 억제제로서의 사용가능성을 확인하고자 MTT를 이용한 방법 으로 위암세포 사멸율을 측정하였다. 실험은 H. pylori 성장 억제 활성이 확인된 농도를 기준으로 0.1-1.0 mg/mL의 농도 범위를 설 정하였다. 해당농도로 실험에 적용하기 앞서 세포를 이용한 실험 에서 설정농도 범위에서 확인되는 결과가 세포독성에 기인한 것 인지 확인하기 위하여 RAW 264.7 대식세포주를 이용하여 발효 옻 추출물을 설정농도로 처리한 후 세포독성을 측정하였다. 측정 결과 0.5 mg/mL 이하의 농도에서 약 90%의 세포 생존률이 확인 되었으며, 최종 농도인 1.0 mg/mL의 농도에서 75% 이상의 세포 생존률이 확인되어 고농도에서도 비교적 높은 세포 생존률을 확 인하였다(Fig. 2). 이는 균 발효로 생산된 생 전환 옻피 추출물이 생 옻피 추출물에 비하여 세포독성이 약 2.5-4.5배 정도 낮아진 다고 보고한 Choi(17)의 발표와 같이 발효옻 제조 과정에서 많은 독성 물질이 제거되는 것으로 사료된다. 발효옻 추출물을 AGS 위암세포에 동일한 농도 범위로 처리한 결과는 Fig. 3과 같이 확 인되었다. 발효옻 추출물을 0.25 mg/mL 이상의 농도로 처리하였 을 때 약 12-30%의 세포 사멸율을 보여 유의적인 결과가 확인 되었으며, 최종농도인 1.0 mg/mL에서 32%의 생장억제 활성이 확 인되었다. 앞선 RAW 264.7 세포 생존율과 비교하였을 때 모든 농도에서 추가적으로 약 10% 전후의 세포 사멸율이 확인되었으 나 AGS 세포에서 확인된 유의적인 감소 농도를 고려하였을 때 발효옻 추출물이 위암세포 생장억제에 영향을 주는 것으로 사료 된다. Lim 등(18)이 유백피를 이용하여 AGS 위암세포에 미치는 영향을 확인 한 결과에서도 농도 의존적으로 세포사멸이 증가함 을 확인하였으며, 0.2 mg/mL의 유백피 추출물을 처리하였을 때 약 20%의 세포 사멸율을 나타냄으로서 발효옻 추출물과 유사한 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 앞서 발효옻 추출물 처리에 따른 H. pylori 생장 억제를 확인함과 같이 이에 기인하여 발생 하는 위암세포에 대하여 발효옻 추출물이 위암 세포 생장과의 연 계성을 확인하고자 연구를 수행하였다. 실험결과 발효옻 추출물 이 AGS 위암세포 생장에 직접 또는 간접적인 영향을 주는 것으 로 사료되나 이는 메커니즘상으로 증명된 바가 아니며 이와 관 련된 추가적인 연구가 요구되는 바이다.
Nitric oxide (NO) 생성저해 활성
위염은 다양한 원인에 의하여 발생하나 H. pylori 감염에 의하 여 유발되는 만성위염은 위점막의 만성 염증성 질환을 유발하여 소화불량과 합병증을 유발하는 것으로 알려져 있다(19). H. pylori 감염에 의한 위점막 손상은 대식세포와 중성구 등의 침윤을 통 하여 염증세포가 nitric oxide (NO)를 분비하고 염증을 동반하게 되면서 NO가 독성을 발생하면서 위점막의 손상을 일으킨다고 보 고된바 있다(20). NO는 활성질소종(reactive nitrogen species)의 하 나로 최근 염증반응의 중요한 작용인자로 보고되고 있으며 산화 질소는 지용성 물질로 세포 내에서 인체 면역, 신경, 혈관계통 등 다양한 생물학적인 과정에 관여한다고 알려져 있다(21). 이와 같 이 세포손상을 야기하는 NO의 생성저해 효과를 검정하기 위하 여 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 LPS를 첨가하여 염 증반응을 유도한 후 연구를 수행하였다. LPS로 NO 생성을 유도 한 RAW 264.7 세포에 일정 농도로 희석한 발효옻 추출물을 첨 Fig. 3. Cell viability effect of fermented Rhus verniciflua stem bark extract on AGS human gastric cancer cells. All values are mean±SD of triplicate determinations. * significantly different from the control (p<0.05)
Fig. 4. Effect of fermented Rhus verniciflua stem bark extract on NO production in LPS-induced RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with fermented Rhus verniciflua stem bark extract and LPS (1.0 μg/mL) for 24 hr. NO production was determined in culture supernatant by Griess. All values are mean±SD of triplicate determinations. * significantly different from the control (p<0.05) Fig. 2. Cell viability effect of fermented Rhus verniciflua stem
bark extract on RAW 264.7 cells. All values are mean±SD of triplicate determinations. * significantly different from the control (p<0.05)
가하여 일정시간 반응 시킨 후 Griess 시약을 처리하여 발생한 NO의 양을 측정하였다. 발효옻 추출물의 농도는 앞서 수행한 세 포독성 결과에 따라 0.1-1.0 mg/mL으로 설정하였다. 연구결과 추 출물 처리 농도가 증가함에 따라 농도유의적으로 NO 생성율이 감소하였으며 모든 농도에서 70% 이상의 높은 NO 생성 저해율 을 확인하였다(Fig. 4). 이를 RAW 264.7 세포의 세포생존율과 비 교하였을 때 0.10-0.50 mg/mL 농도에서 RAW 264.7 세포는 90% 의 세포생존율이 확인 되었으나 NO 생성 저해율은 농도가 증가 함에 따라 74, 89, 91%로 순차적으로 저해율이 증가하는 것을 확 인하였다. 본 연구의 경우 최저 처리농도를 0.1 mg/mL로 설정하 였을 때 73%의 NO 생성 저해율을 확인하였으나, Kim(22)이 연 구한 발효옻 추출물의 세포 생리 특성 연구에서 발효옻 추출물 을 0.018-0.03 mg/mL로 처리하였을 때 0.015 mg/mL을 기준으로 약 50% 이상의 NO 생성률을 확인 함으로서 저농도에서도 발효 옻이 가지는 뛰어난 NO 생성 저해율을 입증하였다. 연구결과 발 효옻은 뛰어난 NO 생성 저해능을 가지고 있는 것을 확인하였으 며 이를 식의약 소재로 이용할 경우 인체 내에서 NO 과발현에 따라 후차적으로 발생되는 다양한 인체 내 대사활동 문제와 질 병을 예방 할 수 있다는 측면에서 매우 긍정적인 결과라 할 수 있다. iNOS 및 COX-2 발현억제 효과 염증 반응에 관여하는 iNOS는 염증반응에서 NO의 생성량에 영향을 주는 효소로 정상상태에서는 방어 작용, 신경전달물질과 혈관 조절 기능 등을 수행하나 염증 반응에서는 강한 독성을 가 지는 NO를 발생시켜 세포 손상 및 만성염증, 자가 면역질환의 원인이 된다고 알려져 있다(23). COX-2는 종양억제 유전자는 아 니지만 암유전자(oncogene)로서 암 발생과 연관성이 높으며, 위 에서 염증 발생에 있어 arachidonic acid로부터 혈관확장, 통증발 생 등 염증반응에 많은 영향을 주는 prostaglandin E2 (PGE2)를 생 성하는데 관여하는 주요 효소이다. H. pylori에 감염되었을 경우 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 숙주 염증반응 유전자가 유도되 면서 nuclear factor (NF)-κB가 활성화되고 뒤이어 COX-2의 발현 이 촉진되는 일련의 과정이 진행된다(6,24). 이러한 염증 관련 유 발 인자에 증가 및 과발현은 세포자살과 세포과증식, 혈관형성 및 종양형성 등에 영향을 미치며 위암 발생과 연관이 있는 것으 로 보고됨으로써 결과적으로 iNOS와 COX-2의 발현억제는 염증 및 위암 발생률을 감소하는 것으로 해석되고 있다(25). 이에 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2 발현에 있어 발 효옻 추출물의 발현 억제능을 확인하고자 RT-PCR을 이용하여 발 현 정도를 확인하였다. RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증 을 유도한 후 발효옻 추출물을 0.1-1.0 mg/mL의 농도로 처리하였 다. 발효옻 처리 후 세포 내 pro-inflammatory 유전자인 iNOS와 COX-2의 유전자 발현 변화를 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 그 결과, LPS에 의해 염증이 유도된 대조구에 비해 iNOS와 COX-2의 발현이 감소됨을 확인하였다. 발효옻 추출물을 0.1-1.0 mg/mL 로 처리하였을 때 처리 농도가 증가함에 따라 일정농도 이상에 서 염증관련 유전자의 발현 감소가 확인되었으며 0.5 mg/mL을 처리하였을 때 iNOS의 경우 약 50%, COX-2의 경우 15%의 유 전자 발현 감소율을 보였다(Fig. 5). 특히, iNOS의 경우 Fig. 5B 와 같이 발효옻 추출물을 0.1 mg/mL의 낮은 농도 처리하였을 때 약 20%의 발현 억제율을 나타냄으로서 뛰어난 항염증 활성을 확 인하였다. 이는 앞서 언급한 NO 생성 저해율을 고려하였을 때 NO 생성에 직접적인 영향을 주는 iNOS의 뚜렷한 감소가 직접 적인 영향을 준 것으로 사료되며, 암유전자로 알려져 있는 COX-2의 감소는 간접적으로 AGS 위암세포 사멸과 연계성을 가지고 있을 수 있으나 후차적으로 메커니즘과 관련된 연구를 통하여 입 증해야 할 부분으로 사료된다. 결과적으로 발효옻 추출물에 함유 Fig. 5. Inhibitory effects of fermented Rhus verniciflua stem bark extract on iNOS and COX-2 mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The images were presented that PCR products were performed gel-electrophoresis (A). The iNOS (B) and COX-2 (C) mRNA expression was quantified by LPS-stimulated control. Mean values±SD from triplicate separated experiments are shown. * significantly different from LPS-stimulated control (*p<0.05, **p<0.01)
된 생리활성 물질이 NO 생성을 억제하고 pro-inflammatory 반응 을 매개하는 일부 유전자들의 발현을 조절 할 수 있음을 보여준다
요
약
본 연구는 장수버섯(Fomitella fraxinea)을 이용하여 발효처리 한 무독화 옻나무 추출물의 위장기능 개선능을 확인하고자 발효옻 추출물을 이용하여 H. pylori 생장억제활성, 위암세포 생장억제활 성과 항염증 활성을 평가하였다. H. pylori를 접종한 배지에 발효 옻 추출물을 농도별로 첨가하였을 때 2.0 mg의 농도에서 4.0 mm 의 생장억제환을 확인하였으며, 발효옻 추출물을 배지에 1.0-5.0 mg 농도로 혼합한 후 H. pylori을 접종한 경우에도 생장억제능이 확인되었다. 이를 바탕으로 세포 수준에서 H. pylori에 의해 유발 된다고 알려진 위암과 위염 개선능을 평가하고자 세포독성을 나 타내지 않은 0.1-1.0 mg/mL의 농도범위로 AGS 위암세포 생장억 제활성 및 NO 생성 저해율을 확인하였다. 실험결과 0.25 mg/mL 이상의 농도에서 20% 이상의 위암세포 생장억제활성을 확인하 였으며, LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에서 추출물 0.25 mg/mL처리시 90%의 높은 NO 생성 저해율을 확인하였다. 염증 유발인자인 iNOS와 COX-2의 발현 억제율은 0.50 mg/mL 농도에 서 각각 50, 10%의 억제율을 보여 NO 생성저해율은 iNOS에 의 한 영향인 것으로 사료된다. 상기 결과로 발효옻 추출물은 H. pylori 생장억제능 및 높은 NO 생성저해 활성이 확인됨으로서 간 접적인 위암발생 억제제 및 항염증제로서의 이용가능성을 확인 하였다. 따라서 발효옻 추출물을 이용한 위장개선 식의약 소재로 서의 개발 가능성이 매우 높은 것으로 생각되며 이를 위해 추가 적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.감사의 글
본 연구는 농촌진흥청 어젠다 연구사업(세부과명: 발효옻 위 건강 관련 물질 분리, 세부과제번호 PJ00985901) 및 2015년도 강 원대학교 대학회계 연구비 지원을 받아 이루어진 결과로 이에 감 사드립니다.References
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