일산화질소가 섬유주세포에 의한 교원질 겔의 수축에 미치는 영향

DOI : 10.3341/jkos.2007.48.11.1548

NO는 자유유리기로 생체막을 투과하여 내피세포에 서의 이완작용, 신경계에서의 조절작용, 면역계에서의 면역매개물질 등의 생체에서 중요한 역할을 하는 것으 로 알려져 있고^1,2 안구 내에서 다양한 조직에서 발현되 며³ 생리적인 매개체일 뿐만 아니라 다양한 병리적 역 할을 나타내며 녹내장을 유발하는 기전의 한 가지로도 알려져 있다.^4-6

원발개방각녹내장은 섬유주의 기능저하로 인해 방수 유출로의 저항이 증가되어 안압이 상승함으로써 발병 하는 것으로 알려져 있는데, 섬유주를 구성하고 있는 섬유주세포는 방수유출의 조절에 능동적으로 관여한 다고 한다.^7-9 섬유주를 통한 방수유출을 조절함에 있어 서 일산화질소(nitric oxide, NO)가 중요한 역할을 하며,¹⁰ 녹내장이 있는 경우에는 섬유주의 NO합성효소 의 활성이 감소되어 있고, NO 공여약물을 투여하면 안 압을 낮추는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.^11-14

섬유주는 단순한 방수유출의 통로가 아니라 방수유 출을 능동적으로 조절하며 endothelin과 NO가 이에 관여한다고 알려져 있다.¹⁵ 또한 섬유주세포는 내피세

포와 근육세포의 성질도 함께 가지고 있으므로¹⁶ 이완 효과가 있는 NO에 노출되면 섬유주의 위축을 방지하 여 방수유출을 개선할 것으로 생각되나 이러한 안압하강 의 기전은 생체 내에서 아직 자세히 밝혀지지 않았다.

인체의 섬유주는 섬유주판으로 구성되며 섬유주판은 교원질로 이루어진 중심층과 이를 둘러싼 피질층이 단 단한 뼈대를 이루고 표면에 섬유주세포가 존재하는데 섬유주세포가 섬유주판의 이완과 수축을 조절하는 주된 세포임에 착안하여 실험실 내에서 배양된 섬유주세포가 교원질 겔의 수축에 영향을 미친다면 생체 내에서도 교 원질로 이루어진 섬유주판에 유사하게 작용하여 결과적 으로 섬유주의 방수유출에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각해볼 수 있다. 따라서 본 연구에서는 NO가 섬유 주의 위축에 미치는 영향을 실험실 내에서 간접적으 로 알아보기 위하여 사람의 섬유주세포를 일차배양한 다음, 합성한 교원질 겔에 봉입배양하여 NO제공자 가 섬유주세포에 의한 교원질 겔의 수축에 미치는 영 향을 알아보고자 하였다.

대상과 방법

1. 세포배양

안구은행에서 얻은 사후 6시간 이내에 적출한 안구의 전방각 주위 조직을 제거한 후 전방각에서 섬유주를 벗겨 내어 0.01 mg/ml 폴리라이신(Sigma, USA)으로 처 리한 배양접시에 옮긴 후 penicillin, streptomycin,

일산화질소가 섬유주세포에 의한 교원질 겔의 수축에 미치는 영향

김재우․장우석․이수윤 대구가톨릭대학교 의과대학 안과학교실

목적 : 일산화질소(nitric oxide, NO)가 섬유주세포에 의한 교원질 겔의 수축에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상과 방법 : 사람의 섬유주세포를 일차배양한 다음, 배양한 섬유주세포를 교원질 겔 내에 봉입하여 NO 제공자인 sodium nitropusside와 S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP)에 각각 노출시켜 1주일간 배양하면서 교원 질 겔의 수축 정도를 측정하였다. 세포의 생존은 MTT assay로, NO의 생성은 Griess assay로 각각 조사하였다.

결과 : Sodium nitroprusside와 SNAP는 섬유주세포의 생존에는 영향을 미치지 않았으며 시간과 농도에 비례하여 각각 10% 씩 유의하게 교원질 겔의 수축을 억제하였다(p<0.05).

결론 : NO 제공자는 배양된 사람 섬유주세포에 의한 교원질 겔의 수축을 억제하였다. 따라서 NO 제공자는 섬유주의

이완을 촉진하여 방수유출을 촉진할 수 있을 것으로 생각된다.

<한안지 48(11):1548-1553, 2007>

<접수일 : 2007년 4월 23일, 심사통과일 : 2007년 8월 14일>

통신저자 : 김 재 우

대구시 남구 대명4동 3056-6 대구가톨릭대학병원 안과

Tel: 053-650-4728, Fax: 053-627-0133 E-mail: [email protected]

amphotericin B가 포함된 항생제(Antibitic- amtomycotic, Gibco, USA)와 15% 우태아혈청 (Gibco, USA)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 배지(DMEM, Gibco, USA)를 사용하여 5% CO2 배양기에서 초대배양하였다. 섬유 주세포가 이식된 조직편 주위로 자라나온 것을 확인한 후 섬유주조직의 이식편을 제거하고 배양을 계속하였으 며 세포가 배양접시에 충만해지면 10% 우태아혈청을 포함한 배지로 1:3의 비율로 트립신 처리하여 계대배 양하였다.

2. 약물처리

배양된 섬유주세포를 아래와 같이 제작한 교원질 겔 에 봉입한 후 NO제공자인 10, 100 µM의 sodium nitroprusside (SNP, Sigma, USA)와 1, 10 µM 의 S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP, Sigma, USA)에 각각 1주일간 노출시켜 세포의 생존 과 NO의 생성, 그리고 교원질의 수축 정도을 조사하였 으며 이때 NO합성저해제인 0.5 mM L-NAME (N-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, Sigma, USA)에도 노출시켰다.

3. MTT assay와 Griess assay

NO제공자가 섬유주세포의 생존에 미치는 영향 을 알아보기 위해 MTT assay를 시행하였다.¹⁷ 교원질 겔에 봉입한 섬유주세포를 각 농도의 NO 제공자에 노출시켜 7일간 배양한 다음, 각 배지에 methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA)를 각 well당 100 µl씩 투여한 후 4시간 동안 정치배양하였다. 염류용액으로 씻어낸 후 dimethylsulfoxide (Sigma, USA)를 각 well당 0.5 ml씩 넣어 10분 이상 흔든 다음 96-well 배양접시 에 200 µl씩 옮겨 spectrophotometer (Fluostar Optima, BMG Labtech, Germany)로 570 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포의 증식정도는 실험 군의 값을 약물처리를 하지 않은 대조군의 비로 나누어 백분율로 나타내었다. NO의 생성은 NO의 대사물 인 아질산염(nitrite)의 양을 측정하는 Griess assay를 이용하였는데¹⁸ NO제공자를 처리한 세포 의 배지에 동량의 Griess 반응액(Sigma, USA)를 섞은 후 96-well 배양접시에 옮겨 spectrophotometer 로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선 을 구하기 위해 상용의 sodium nitrite (Sigma, USA)를 단계적으로 희석하여 사용하였다.

4. 교원질 겔의 제작과 수축성 실험(Collagen gel contraction assay)

쥐의 꼬리에 있는 힘줄에서 추출한 교원질 섬유에 0.1% glacial acetic acid (Sigma, USA)를 첨가 하여 교원질 용액을 만들어 교원질 겔 수축성 실험을 시행하였다.¹⁹ 섬유주세포가 포함된 교원질 겔을 만들 기 위하여 교원질 용액과 4배 농도의 DMEM 배지, 혈 청, 그리고 세포부유액을 4:2:1:1의 비율로 섞은 후 24-well 배양접시에서 수분간 정치배양하여 굳힌 다음 (gelatinization) 12 well 배양접시로 옮긴 후 섬유 주세포의 증식에 의한 영향을 배제하기 위하여 혈청이 포함되지 않은 DMEM배지를 넣고 나서 각 농도의 NO제공자에 노출시켰다. 교원질 겔의 수축 정도를 알 아보기 위하여 각각의 교원질 겔의 직경을 노출 후 1 일, 3일, 5일 7일째에 각각 네 군데에서 측정하여 평균 치를 기록하여 교원질 겔의 직경이 감소한 정도를 %로 나타내었다. 이때 교원질 겔의 수축이 교원질 자체의 감손(degradation)에 의한 것인지 구별하기 위하여 NO제공자에 노출 전과 7일간 노출 후의 교원질 겔을 대상으로 교원질을 녹인 후 Bradford assay를 함께 시행하여 비교하였다.²⁰

5. 통계적 처리

모든 실험은 3계대에서 5계대 사이의 세포를 이용하 였고 3회 이상 반복하여 시행하였다. 모든 실험에서 대 조군은 약물에 노출되지 않은 군으로 하였고 실험값은 평균±표준오차로 나타내었으며 실험군과 대조군의 비 교는 unpaired t-test를 이용하였으며 유의수준은 0.05%로 정하였다.

결 과

1. NO제공자가 섬유주세포의 생존에 미치는 영향

교원질 겔에 1주일간 봉입배양한 후 MTT assay 로 세포의 생존을 조사한 결과 SNP와 SNAP은 농도 의 증가에 따라 각각 섬유주세포의 생존을 저하시키는 경향을 나타내었으나 통계학적으로 유의하지는 않았다 (p>0.05, Fig. 1). 따라서 교원질 겔의 수축변화는 세 포의 생존저하에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

2. NO제공자가 섬유주세포에서의 NO의 생성에 미치 는 영향

교원질 겔에 1주일간 봉입배양한 후 Griess assay 로 NO의 생성을 조사한 결과 약물처리를 하지 않은 대 조군에 비해 SNP와 SNAP은 각각 농도에 비례하여 NO의 생성을 유의하게 증가시켰다(p<0.05, Fig. 2).

또한 NO 합성저해제인 L-NAME는 NO의 생성을 유 의하게 감소시켜 NO가 섬유주세포에서 생성됨을 알 수 있었다.

3. NO제공자가 섬유주세포에 의한 교원질 겔의 수 축에 미치는 영향

NO제공자가 교원질 겔의 수축에 미치는 영향을 알 아보기 위하여 섬유주세포를 교원질 겔 내부에 봉입하 여 배양한 다음 7일간 약물에 노출시킨 결과 약물처리 를 하지 않은 대조군에서는 80.9%까지 직경이 감소하 였으나 SNP는 1주일째에 10 µM에서는 90%, 100 µM에서는 92.5%로 교원질 겔의 직경이 감소하여 약 물을 처리하지 않은 대조군에 비해 교원질 겔의 직경감

소가 유의하게 적게 나타나 SNP가 교원질 겔의 수축 을 억제시킨다는 것을 알 수 있었으며(p<0.05, Fig.

3), SNAP도 1주일째에 10 µM에서는 91.2%, 100 µM에서는 91.7%로 교원질 겔의 직경이 감소하여 SNP와 유사하게 교원질 겔의 수축을 억제하는 한 결과를 나타내었다(p<0.05, Fig. 4). 따라서 NO 제공자는 시간과 농도에 비례하여 섬유주세포를 봉 입배양한 교원질 겔의 수축을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

한편 교원질 겔의 수축이 교원질 자체의 감손에 의한 것인지 감별하기 위하여 각각의 약물에 7일간 노출시킨 교원질 겔을 대상으로 실시한 Bradford assay에서는 노출 전(220.4 µg/ml)과 비교하여 7일째의 교원질의 양(203.1 µg/ml)이 유의한 차이를 보이지 않아 (p=0.386) 교원질 겔의 크기의 감소는 교원질 겔의 수축에 의한 것이며 교원질 자체의 감손에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

Figure 1. Effect of NO donors (µM) on the survival of trabecular meshwork cells embedded in the collagen gel measured with MTT assay. L-NAME and NO donors did not affect on the survival. (p>0.05)

Figure 1. Effect of NO donors (μM) on the survival of trabecular meshwork cells embedded in the collagen gel measured with MTT assay. L-NAME and NO donors did not affect on the survival. (p>0.05)

0 20 40 60 80 100 120

L-NAME SNP 10 SNP 100 SNAP 1 SNAP 10

% survival

Figure 2. Effect of NO donors (µM) on the production of NO measured with Griess assay. SNP and SNAP increased NO production significantly. (*; p<0.05)

Figure 2. Effect of NO donors (μM) on the production of NO measured with Griess assay. SNP and SNAP increased NO production significantly. (*; p<0.05) 0

20 40 60 80 100

Control L-NAME SNP 10 SNP 100 SNAP 1 SNAP 10

Nitric oxide (μM)

*

*

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Figure 3. Effect of sodium nitroprusside (SNP) on the contraction of collagen gels. SNP inhibited the contraction of collagen gels significantly. (*; p<0.05, 10 µM) (**;

p<0.05, 100 µM)

Figure 3. Effect of sodium nitroprusside (SNP) on the contraction of collagen gels.

SNP inhibited the contraction of collagen gels significantly. (*; p<0.05, 10 μM) (**;

p<0.05, 100μM) 60

70 80 90 100 110

1 3 5 7 Time (day)

% decrease

0 10 100

**

* *

*

**

**

Figure 4. Effect of SNAP on the contraction of collagen gels. SNAP inhibited the contraction of collagen gels significantly in a time- and dose-dependent manner. (*;

p<0.05, 1 µM) (**; p<0.05, 10 µM)

figur e 4. Effect of SNAP on the contraction of collagen gels. SNAP inhibited the contraction of collagen gels significantly in a time- and dose-dependent manner. (*;

p<0.05, 1μM) (**; p<0.05, 10μM) 60

70 80 90 100 110

1 3 5 7 Time (day)

% decrease

0 1 10

**

** **

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고 찰

본 연구는 NO가 섬유주세포에 작용하여 섬유주의 수축을 억제함으로써 섬유주를 통한 방수유출을 촉진할 가능성이 있다는 것을 보여주고 있다.

인체의 섬유주는 내피로 둘러싸인 세 층으로 구성된 결합조직으로 다양한 성분으로 구성되어 있으며 섬유주 내에 존재하는 섬유주세포는 actin filament를 함유 하고 있어 근육세포와 유사한 수축성을 나타낸다고 한 다.¹⁶ 또한 섬유주세포는 여러 종류의 수용체를 나타낼 뿐만 아니라 NO와 endothelin의 분비를 조절하여 섬 유주를 통한 방수의 투과성을 조절함으로써 방수유출의 조절에 능동적으로 관여한다고 한다.⁹

자유유리기인 NO는 고농도에서는 반응성 산화물질 로 전환되어 세포에 병적인 손상을 유발하기도 하지만 저농도에서는 인체에서 중요한 생리적인 조절인자로 작 용하여 다양한 역할을 하는데^1,2 NO는 근육세포의 이 완을 유발하는 효과가 있으므로 근육세포의 성질도 함 께 가지고 있는 섬유주세포에도 작용하여 섬유주의 이 완을 유발할 수 있을 것이다.

세포의 생존에 미치는 영향은 NO의 농도와 세포의 종류 등에 의해 다르게 나타나지만²¹ 일반적으로 고농 도에서는 세포의 생존에 해로운 영향을 미치며 생리적 으로 필요한 적정농도 이하에서도 산화스트레스를 유발 하여 해로운 영향을 미친다고 한다.²² 본 연구에 사용한 두 가지 NO제공자 모두 세포의 생존에는 유의한 영향 을 미치지 않아 NO 제공자가 교원질 겔의 수축에 미치 는 영향은 섬유주세포의 숫자변화에 의한 것이 아닌 것 으로 나타났다. 한편 NO제공자는 섬유주세포를 봉입 배양한 교원질 겔에서 NO의 농도를 유의한 농도로 증 가시켰는데 NO 합성저해제인 L-NAME는 약물처리 를 하지 않은 대조군에 비해 NO의 생성을 유의하게 감 소시켜 섬유주세포가 NO를 능동적으로 생성한다는 것 을 알 수 있었다.

본 연구에 사용한 두 가지 NO 제공자 모두 약물처리 를 하지 않은 대조군에 비해서 섬유주세포를 봉입배양 한 교원질 겔의 수축을 유의하게 억제하였다. 따라서 NO는 생리적으로 섬유주의 수축을 억제하여 방수유출 을 정상적으로 유지시킬 뿐만 아니라 녹내장이 있는 경 우에는 섬유주의 NO합성효소의 활성이 감소되어 있으

므로,^11-14 외부에서 NO 공여약물을 적절히 투여하면

섬유주의 수축을 감소시켜 방수유출을 증가시킴으로써 안압을 낮추는 효과가 있을 것이다.

결론적으로 섬유주세포를 교원질 겔에 봉입배양하여 NO제공자에 노출시키면 교원질 겔의 수축을 억제하였 다. 따라서 NO제공자는 섬유주의 수축을 방지함으로

써 방수유출을 촉진하는 효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각되므로 NO를 생리적인 적정농도로 유지하거나 녹 내장의 경우와 같이 NO의 생성이 감소되어 있는 경우 에는 NO제공자를 이용하여 섬유주의 수축을 감소시킴 으로써 안압을 하강하는 효과가 있을 것으로 생각되며 향후 생체 내에서 그 작용기전에 관한 보다 상세한 연 구가 필요할 것으로 생각된다.

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Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44:3135-43.

=ABSTRACT=

Effect of Nitric Oxide on the Trabecular Meshwork Cell-mediated Contraction of Collagen Gels

Jae Woo Kim, M.D., Woo Seok Chang, M.D., Su Yoon Lee, M.D.

Department of Ophthalmology, Catholic University of Daegu School of Medicine, Daegu, Korea

Purpose: To investigate the effect of nitric oxide (NO) on the contraction of cultured human trabecular meshwork cells (HTMCs).

Methods: After embedding them into collagen gels, primarily cultured HTMCs were exposed to NO donors, such as sodium nitroprusside (SNP) or S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), for 1 week at various concentrations, and the contraction of the collagen gels was measured. Cellular survival and NO production were measured with MTT assay and Griess assay, respectively.

Results: Though SNP and SNAP did not significantly affect cellular survival, they markedly enhanced NO production. Both sodium nitroprusside and SNAP inhibited the contraction of collagen gels by about 10% in dose and time-dependent manners (p<0.05).

Conclusions: NO donors inhibited the contraction of collagen gels in vitro. Thus, NO donors may relax trabecular meshwork and enhance trabecular outflow.

J Korean Ophthalmol Soc 48(11):1548-1553, 2007

Key Words: Collagen gel, Contraction, Nitric oxide, Trabecular meshwork

Address reprint requests to Jae Woo Kim, M.D., Ph.D.

Department of Ophthalmology, Catholic University of Daegu School of Medicine

#3056-6 Daemyeung-4-dong, Nam-gu, Daegu 705-718, Korea Tel: 82-53-650-4728, Fax: 82-53-627-0133, E-mail: [email protected]