구제역 바이러스 O 혈청형 재조합 단백질 백신을 이용한 다종의 지역형 구제역 바이러스에 대한 교차방어력 연구
이혜영, 박미나, 이현수, 문상범*
Cross Protection of a Recombinant Protein Vaccine against Challenges with Foot and Mouth Disease type O Virus of Three Lineages in Swine
Hae Young Lee, Mi Na Park, Hyun Soo Lee, and Sang Bum Moon*
Received: 22 November 2019 / Revised: 16 December 2019 / Accepted: 18 December 2019
© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Abstract: Foot and mouth disease (FMD) is a very conta- gious disease that occurs in cloven- hoofed livestock. This disease has an adverse effect on the livestock industry by causing blister in mouth and nose, anorexia, high fever and in particular sudden death to young animals. FMD virus (FMDV) has seven different serotypes: O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 and SAT3 but just two serotypes (O, A) have occurred in South Korea so far. In this study, we have developed recombinant protein antigen and verified protective efficacy as a FMD vaccine in contrast to widely used inactivated virus vaccine. Recombinant protein antigen is composed of repeated sequence of two epitopes (141-160, 200-213) of the VP1 of FMDV serotype O and pig immunoglobulin heavy chain as a carrier protein, and as a result, FMD vaccine has been produced by mixing paraffin oil. We have identified that antibody forms against FMDV in a vaccinated pig, measured protection rate against 3 topotypes of FMDV serotype O by excuting frequent challenge tests. It has shown above a cer- tain level (≥80%) regardless of vaccination frequency. It sug- gests that recombinant protein, single antigen can respond to different topotypes in FMDV serotype O. We could assure that we have established the cornerstone for developing non- viral FMD vaccine that can protect against FMDV within the country and beyond neighboring countries.
Keywords: FMDV O serotype, topotype, recombinant protein vaccine, cross protection, single antigen
1. INTRODUCTION
구제역 (foot-and-mouth disease, FMD)은 소, 돼지, 양, 염소 및 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 우제류에 감염되는 질병으로 전염성이 매우 강하며, 입술, 혀, 잇몸, 코, 또는 발굽 등에 수 포를 형성하면서 침 흘림, 발열, 식욕 부진을 일으키거나 어 린 개체의 경우 폐사되는 질병이다 [1]. 구제역 바이러스 (FMD virus, FMDV)는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코르나바이러스 (Picornaviridae)과 아프토바이러스 (Aptho- virus) 속에 속하며 7개의 A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 혈청형이 존재한다. 각 혈청형에서는 다양한 지역형 (총 80 여종)이 밝혀져 있으며, 변이가 빈번히 일어나는 것으로 알 려져 있다. 또한 구제역 바이러스를 혈청형간은 물론이고 지 역형 또한 교차면역이 이루어지지 않는 것으로 알려져 있다 [2]. 7 개의 혈청형 중 O, A, Asia1의 3가지 혈청형이 전세계적 으로 발생빈도가 가장 높으며 [3], 현재까지 국내에서는 A, O 혈청형의 구제역이 주로 발생되어 이를 예방하기 위한 구 제역 백신으로 FMDV를 불활성화 시킨 사백신만을 사용하 고 있다. 본 연구에서는 FMDV O 혈청형을 이용한 비바이러 스성 재조합 단백질 백신을 개발하여 FMDV O 혈청형에 대 한 항체가 형성되고 공격접종시험에서 방어가 유도됨을 확 인하고자 하였다. 또한 VP1의 에피토프 (epitope, 항원결정 기) 만을 바탕으로 설계하였기 때문에 동일 혈청형내의 다른 지역형 바이러스에 대한 방어력도 확인하고자 하였다.
(주)파로스백신 Pharos vaccine Inc.
Tel: +82-31-786-6673 , Fax: +82-31-786-6667 e-mail: [email protected]
Research Paper
2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 재조합 단백질 항원 설계
운반체 펩티드로 사용되는 돼지 면역글로불린 (IgG) 중쇄불 변부위의 N-말단에 구제역바이러스 O혈청형 O/MYA/7/98 의 VP1 아미노산 잔기 141-160, 200-213 영역을 펩타이드 링 커 (GGSSGG)로 각 3회 직렬중복으로 연결하고, 양끝 말단 에 His-tag을 연결하였다. 구제역 바이러스 O 혈청형에 대응 하도록 재조합 단백질 항원을 설계하였다.
설계된 재조합 단백질 유전자 서열을 코돈 최적화 (codon optimization) 후 GenScript (New Jersey, USA)사에 화학적 합 성을 의뢰하였다. 합성된 유전자는 박테리아 발현 벡터 pET28b(+)의 다중제한효소 절단부위에 삽입하여 제작하였 다. pET28b(+) 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단하여 선형화 (linearization)하고 1% agarose gel에서 단일밴드를 확 인한 후 Gel purification kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 추 출, 회수, 정제하였다. 이를 재조합 단백질 유전자에 대한 서 열분석 (sequencing analysis)을 통해 삽입된 목적유전자의 서 열이 해당서열과 일치함을 확인하였다.
2.2. 시험백신의 제조
재조합 단백질 발현 벡터는 대장균 BL21(DE3) (RBC Bioscience, xindian, Taiwan)에 형질전환 시킨 후, 단일 콜로니를 50 µg/
mL 카나마이신 (kanamycin)을 함유하는 2x YT broth에 접종 하였다. 배양액의 흡광도 (OD600)가 5.0 일 때, 발현을 위해 0.5 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 배양이 완료 된 세포를 수거하여 고압세포파쇄기 (PandaPlus2000, GEA Niro Soavi, Italy)을 사용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파 쇄물에서 수거된 봉입체 (inclusion body, IB)를 가용화하여 니켈-친화 크로마토그래피 (Ni-NTA affinity chromatography) 을 이용하여 용출하였다. 용출된 용액을 투석기 (vivaflow, USA) 를 사용하여 농축 및 여과를 실시하여 정제를 완료하였 다. 정제 완료된 재조합 단백질을 확인하기 위하여 10%
SDS-PAGE 분석을 실시하고, Bradford 정량법 (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA)으로 농도를 확인하였다. 확인 된 재조합 단백질은 동물백신에서 널리 사용되는 파라핀유 를 주성분으로 하는 부형제 (adjuvants)와 혼합하여 시험백신 을 준비하였다.
2.3. 분석방법
백신접종 후 면역화된 돼지의 혈청을 LPB ELISA (액상차단 효소면역분석시험, Liquid Phase Blocking enzyme linked immunosorbent assay) 을 이용하여 항체를 측정하였다. 토끼 항 O형 구제역바이러스 혈청으로 코팅된 플레이트에 분석 할 혈청을 2배 순차 희석 (1/4~1/512)하여 각 well에 넣어준 다. Positive control (O형 구제역 양성 혈청), negative control (O 형 구제역 음성 혈청)도 각각 1/8~1/1024, 1/2~1/4의 범위 로 2배 순차 희석하여 넣어준다. O형 구제역 불활화 항원을 희석하여 모든 well에 넣어 희석된 혈청과 반응시킨다. 반응
이 완료되면 각 well을 세척 후, 토끼 항 기니피그 IgG-HRP 를 결합시켜 기질용액, 정지액 등을 처리하여 흡광도 (492 nm) 를 측정한다. 기준값은 각 control 흡광도의 평균값으로 하고, 항체역가는 혈청 흡광도를 기준값과 비교하여 50% 이하가 되는 최고희석배수로 한다. 기준값과 차이가 있으면 차상위 희석배수와의 중간 희석배수로 판단한다.
2.4. 공격접종시험 (Virus Challenge test)
구제역 바이러스 공격접종시험을 통한 구제역 재조합 단백 질 백신의 감염 방어율을 확인하였다. 모든 동물실험은 Lanzhou veterinary research institute의 ABSL3시설에서 실시 되었으며, 접종 구제역 바이러스 역시 Lanzhou veterinary research institute에서 돼지의 50% 감염량 (PID50, Infective dose 50)으로 역가 (titer)가 결정된 구제역 바이러스 O/ZK/
93, O/CHA/4/99, O/MYA/7/98 을 제공받아 준비하였다.
재조합 단백질 백신은 LPB ELISA 에서 구제역 항체가 음 성인 8~10주령의 돼지를 농장에서 선별하여 접종하였다. 대 조군은 백신 비접종군 5마리를 준비하고, 각 실험군은 5마리 씩으로 재조합 단백질 백신 2 mL을 우측 이근부에 1차 접종 하고 3~4주에 2차 접종한 후 3주차에 Lanzhou veterinary research institute 의 ABSL3시설로 입식하였다. 입식 후 1일 계류하여 안정화 기간을 거친 후 바이러스 공격접종시험을 진행하였다. 대조군, 실험군의 모든 돼지에 병독성 구제역 바이러스 10
3ID50을 이근부에 5 mL 직접 주사하여 감염 시 켰다. 10일 동안 1일 1회 임상 증상 관찰을 실시하였다.
구제역 감염 초기 임상증상인 발열, 무기력증, 식욕부진, 침흘림 증상이 나타나고 증상이 경과되어 40
oC 이상 발열, 수포, 파행으로 진행 시 구제역으로 확진하였다. 구제역 임 상증상 판정은 OIE 예방약 표준지침서 (Manual of Vaccines for Terrestrial Animals)에 제시된 감염 방어율시험 (Percentage of protection against generalised foot infection, PPG)의 규정 에 따라 실시하였다 (4).
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 재조합 단백질 항원 설계
재조합 단백질 항원 중 돼지 면역글로불린 (IgG) 중쇄불변부 위의 N-말단에 위치한 FMDV O 혈청형 O/MYA/7/98 의 VP1 아미노산 잔기 141-160, 200-213 영역을 펩타이드 링커 (GGSSGG)로 각각 3회 직렬중복으로 연결시킨 아미노산 서 열 (Table 1)을 유전자 최적화 (codon optimization)한 후 합성 하여 확보하고, 발현 벡터에 삽입하여 재조합 단백질 발현용 플라스미드 벡터를 제작하였다 (Fig. 1,2).
3.2. 재조합 단백질 발현 확인 및 정제
대장균 발현시스템에서 IPTG 유도로 불용성 단백질
(insoluble protein) 형태의 봉입체 (Inclusion body)로 발현되
었으며, 예상 분자량 55 kDa 크기에서 확인되었다 (Fig. 3(A)).
FPLC 시스템에서 His-tag이 표지된 불용성 단백질을 가용화 하여 니켈 컬럼에 흡착시킨 후 용출 및 농축과정을 거쳐 정
제된 재조합 단백질을 회수하였다. 재조합 단백질은 10%
SDS-PAGE 전기영동을 통해 약 55 kDa의 분자량과 순도를 Fig. 1. Schematic diagram of recombinant FMDV antigen protein. The His-Tag peptide, the mature N-terminal and C-terminal repeats region are shown. Detail of amino acid sequence of the full recombinant protein in Table 1. Construction of a recombinant plasmid containing 3 times of VP1 epitopes.
Fig. 2. Schematic diagram for construction of recombinant protein expression vector system.
Table 1. Amino acid sequence of recombinant FMDV antigen protein
Name Position Amino acid sequence
FO3 141-160 LTNVRGDLQVLAQKAARPLP
200-213 RHKQKIVAPVKQSL
Linker GGSSGG
SIC
APKTAPSVYPLAPCGRDVSGPNVALGCLASSYFPEPVTVTWNSGALTSGVHTFPSVLQPSGLYS LSSMVTVPASSLSSKSYTCNVNHPATTTKVDKRVGIHQPQTCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDT LMISQTPEVTCVVVDVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQD WLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTLTCLVIGFYPPDIH VEWKSNGQPEPENTYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGDKFECAVMHEALHNHYT QKSISKTQGK
확인하였다 (Fig. 3(B)).
3.3. 돼지를 이용한 바이러스공격접종시험 (Virus Challenge test in pig)
정제가 완료된 재조합 단백질을 항원으로 준비된 재조합 단 백질 백신은 각 실험군 5마리씩을 접종하였는데 투여 횟수 를 다르게 하여 각 투여군에 단회 혹은 2회 투여하였다. 2회 투여군은 1차 접종 4주차에 추가 접종하여 음성 대조군을 포 함하여 총 15마리의 돼지를 ABSL3시설에 입식하였다. 입식 된 모든 돼지의 혈청을 LPB-ELISA를 이용하여 Ab titer를 분 석하였다. 실험돼지에 구제역 바이러스 O혈청형 O/ZK/93 1,000ID50 를 이근부에 5 ml 직접 주사하여 감염시켰다. 10일 동안 1일 1회 임상증상 관찰하여 임상지표로 구제역 감염을 확진하였다 (Table 2).
입식 직후 (42dpi) 각 실험군의 혈청에 대한 LPB-ELISA 분 석을 실시한 결과에서 재조합 단백질 백신을 단회 투여한 실 험군 B는 평균 58, 2회 투여한 실험군 A는 126의 Ab titer를 나타냈다. 구제역바이러스 O혈청형 O/ZK/93을 1,000ID50 접종하여 재조합 단백질 백신의 유효성 및 방어력을 확인한 결과, 바이러스 공격접종 시험에서는 1회 접종군의 방어력
(4/5, 80%)에 비하여 2회 접종 실험군 B에서 더 높은 방어력 (5/5, 100%) 를 보여주었다. 이는 재조합 단백질이 백신의 항 원으로서 유효성이 있으며, 구제역 바이러스 O혈청형에 대 한 방어력을 입증하였다 (Table 3).
3.4. 돼지를 이용한 교차방어확인시험 (Cross protection test in pig)
돼지에 대한 유효성 및 방어력이 입증된 재조합 단백질 항원 FO3-SIC는 구제역바이러스 O혈청형 O/MYA/7/98의 VP1 epitope 서열을 활용하여 설계되었다. 구제역 바이러스는 동 일 혈청형의 다른 지역형 (topotype) 바이러스에 대한 백신의 교차사용이 어렵다는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러 나 구제역 바이러스 O혈청형의 경우에는 지역형사이의 유 전적 이질성이 비교적 적은 것으로 알려져 있다. 정제된 재 조합 단백질 항원이 설계된 지역형 epitope가 아닌 다른 지역 형 바이러스에 방어력이 입증되었기에 구제역 바이러스 O 혈청형의 다른 지역형 바이러스인 O/CHA/4/99와 동일한 지 역형 O/MYA/7/98에 대한 방어력을 확인하였다. 바이러스 공격접종시험에서 사용된 재조합 단백질 백신과 동일한 조 성의 백신을 제조하여 준비하였다. 준비된 재조합 단백질 백신은 음성 대조군을 제외한 각 실험군 5마리에 접종하였 고 실험군은 1차 접종군과 2차 접종군으로 나누었다. 1차 접 종군은 1차 접종 후 4주차, 2차 접종군은 1차 접종 후 4주차 에 2차 접종하고, 음성 대조군을 포함하여 총 30마리의 돼지 를 농장에 동시에 입식하여 준비하였다. 입식된 모든 돼지의 혈청을 LPB-ELISA를 이용하여 Ab titer를 분석하였다. 돼지 Fig. 3. The expression and purification of the recombinant FMDV proteins detected by SDS-PAGE. (A) SDS-PAGE profiles of the expressed recombinant proteins w/ or w/o IPTG induction. Lane M: prestained protein ladder; Lane 1: E. coli BL21(DE3) lysates without IPTG; Lane 2: E. coli BL21(DE3) lysates with 0.5 mM IPTG after 4 hours. (B) SDS-PAGE profile showing the affinity purification results using Ni-NTA resin. Lane M: prestained protein ladder; Lane 1: Inclusion body (IB); 2: Unbound protein (Flow-through); 3: 50 mM Imidazole (washing step); Lane 4, 5, 6, 7, 8, 9: Eluted purified using 250 mM Imidazole each elusion fraction.
Table 3. Results of virus challenge test(O/ZK/93) in pigs
Group LPB-ELISA Challenge result
at 42dpi Time until infection Protection
NC <4 <4 <4 <4 <4 48hr 48hr 48hr 48hr 48hr 0/5(0%)
A 90 180 512 360 11 - - - - - 5/5(100%)
B 22 90 90 180 22 96hr - - - - 4/5(80%)
Table 2. Method of virus challenge test(O/ZK/93) in pigs
Group vaccine Vaccination ChallengeAg heads Boosting Time Virus
NC No vaccine 5 - 49dpi
O/ZK/93 1,000ID50
A FO3-SIC 5 21dpi 49dpi
B FO3-SIC 5 none 49dpi
에 구제역 바이러스 O혈청형 O/CHA/4/99와 O/MYA/7/98 1,000ID50를 이근부에 5 ml 직접 주사하여 감염시켰다. 10일 동안 1일 1회 임상증상 관찰하여 임상지표로 구제역 감염 을 확진하였다 (Table 4,5).
입식 직후 (42 dpi) 각 실험군의 혈청에 대한 LPB-ELISA 분석을 실시한 결과에서 모두 높은 Ab titer를 나타났으며, 단회 접종군보다 2회 접종군에서 높은 Ab titer를 보였다. 구 제역 바이러스 O혈청형 O/CHA/4/99, O/MYA/7/98 에 대한 공격접종시험에서는 음성 대조군은 48시간이내에 모두 발 병한 반면, 2회 접종군은 모두 방어 (5/5, 100%)하였다. 단회 접종군에서는 구제역 바이러스 O혈청형 O/CHA/4/99 에 대 해서는 모두 방어 (5/5, 100%)하였으나, O/MYA/7/98 에 대해 서는 일부 개체를 제외하고 방어 (4/5, 80%)하였다. 접종횟 수와 상관없이 구제역 바이러스 O혈청형의 주요 지역형인 O/CHA/4/99 (Pan-Asia), O/MYA/7/98 (SEA)에 일정 수준 이 상의 높은 방어력을 보여주었다 (Table 6,7). 이로써 시험백 신의 항원으로 사용한 재조합 단백질 항원은 설계시 고려 된 지역형 바이러스 (O/MYA/7/98)을 포함하여 다른 지역형 바이러스 (O/CHA/4/99, O/ZK/93)에 대해서도 우수한 효과 를 가질 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
T 세포 에피토프가 직렬 반복된 재조합 키메라 단백질은 단일 항원 단백질 보다 면역원성을 증가시키는 것으로 알려 져 있다 [5]. 또한 돼지 IgG 불변중쇄부분을 포함하는 재조합 단백질은 체내 면역반응을 유도할 수 있는 항원의 면역원성
이 높아져 중화항체의 형성 및 감염 방어력이 강화되고 [6], 면역세포에 의한 항체 생산 유도가 증가된다고 보고되어져 있다 [7,8]. 재조합 단백질 구제역백신은 짧은 에피토프 펩타 이드와 비교했을 때 면역원성이 강했으며 긴 반감기를 보이 고 있으며 [9,10,11]. VP1 부분을 활용한 재조합 단백질 구제 역백신은 기니피그와 돼지에서 강한 면역반응에 의해 중화 항체를 유도하여 구제역 바이러스 감염으로부터 보호된다 고 보고되었다 [12].
본 연구에서는 재조합 단백질 백신의 면역원성을 높이기 위해 구제역 바이러스 VP1 에피토프의 반복 배열 횟수를 3 회까지 증가시키고 돼지 IgG 중쇄불변부위의 N말단에 반복 된 VP1 에피토프를 배치한 재조합 단백질 항원을 개발하였 다. IgG 중쇄불변부위 (Fc, Crystallizable fragment)부분과 바 이러스를 결합한 불활화 백신으로 항체 생산이 증가되어 바 이러스 공격접종에 대한 방어능이 확인된바 있으며 [13], 특 히 돼지 IgG의 중쇄불변부위와 VP1 일부를 결합한 백신의 경우 돼지에서 FMDV 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있음 이 입증되어 있다 [7,14].
LPB ELISA를 통하여 구제역 바이러스 항체 음성인 개체 만을 선별하여 시험에 사용하였다. 재조합 단백질 백신을 접 종한 개체의 혈청도 모두 LPB ELISA를 이용하여 분석하고 각 실험군 혈청의 분석값을 기준으로 유효성을 가늠하였다.
LPB ELISA에 의한 분석값과 백신 방어력이 정비례 관계에 있는 것은 아니나, 분석값이 높을수록 항체가 많이 형성되었
Table 4. Method of cross protection test(O/CHA/4/99) in pigs
Group vaccine Vaccination Challenge
Ag Heads Boosting Time Virus
NC-C No Vaccine 5 none - O/CHA/4/99 1,000ID50
A-C FO3-SIC 5 28dpi 56dpi O/CHA/4/99 1,000ID50
B-C FO3-SIC 5 none 56dpi O/CHA/4/99 1,000ID50
Table 5. Method of Cross protection test(O/MYA/7/98) in pigs
Group vaccine Vaccination Challenge
Ag Heads Boosting Time Virus
NC-M No Vaccine 5 none - O/MYA/7/98 1,000ID50
A-M FO3-SIC 5 28dpi 56dpi O/MYA/7/98 1,000ID50
B-M FO3-SIC 5 none 56dpi O/MYA/7/98 1,000ID50
Table 6. Results of Cross protection test(O/CHA/4/99) in pigs
Group LPB-ELISA Ab titer Challenge results
at 56dpi(B group 28dpi) Time until infection Protection(%)
NC-C <4 <4 <4 <4 <4 48hr 48hr 48hr 48hr 48hr 0/5(0%)
A-C 45 256 256 180 180 - - - - - 5/5(100%)
B-C 90 45 45 22 90 - - - - - 5/5(100%)
Table 7. Results of Cross protection test(O/MYA/7/98) in pigs
Group LPB-ELISA Ab titer Challenge results
at 56dpi(B group 28dpi) Time until infection Protection(%)
NC-M <4 <4 died <4 <4 48hr 48hr died 48hr 48hr 0/4(0%)
A-M 512 512 256 256 512 - - - - - 5/5(100%)
B-M 90 90 90 45 45 - - - - 96hr 4/5(80%)
을 가능성이 높기 때문이다. 감수성 동물인 돼지에 적용할 수 있도록 산정된 기준용량에 따라 재조합 단백질 백신을 제 조하여 바이러스에 대한 방어력을 확인 했을 때, 추가 접종 여부와 관계없이 구제역 바이러스 O혈청형 O/ZK/93에 대한 일정수준 이상 (> 80%)의 방어력을 확인 할 수 있었다. 재조 합 단백질 백신의 바이러스 방어력을 확인하기 위한 바이러 스 공격접종시험은 백신의 전체 투여용량으로 시험하는 감 염방어율 (Percentage of protection against generalised foot infection, PPG) 시험을 바탕으로 유사하게 설계되었다. OIE 매뉴얼과 유럽약전에 의하면 PPG 시험에서 감염 방어율이 90% 이상인 경우 구제역을 최소한 75% 이상 방어 한다고 제 시하고 있어, 추가접종을 실시한 실험군의 경우 최소 75%
방어가 가능하다 [4].
구제역 백신은 일반적으로 혈청형내의 동일한 지역형 바 이러스에만 대응이 가능한 것으로 알려져 있는데, 이것은 일반적인 구제역 백신이 구제역 바이러스를 약독화 또는 사 독화하여 병독성을 제거한 불활화 바이러스를 항원으로서 사용하기 때문이다. 구제역 바이러스의 병원성을 결정하는 것으로 알려진 VP1은 동일 혈청형 내 바이러스에서도 매우 보존된 영역으로 알려져 있어 [15], 재조합 단백질 항원 FO3-SIC를 구제역 바이러스 O혈청형 O/MYA/7/98 의 VP1 epitope 염기서열을 모티브로 하여 설계하였다. 구제역 바이 러스 O혈청형은 지역형 사이의 유전적 이질성이 비교적 적 다 (Table 8).
다른 지역형 바이러스 O/ZK/93 (Cathay)에 대한 방어력을 확인하였기에 다른 지역형 바이러스 O/CHA/4/99 (ME-SA) 와 동일 지역형 바이러스 O/MYA/7/98 (SEA)에 대하여 교차 방어력을 비교하게 되었다. 일부 지역형 (SEA, Cathay)에서 는 1회접종보다 2회 접종하였을 때 부스팅 (boosting) 효과로 인하여 더 우수한 방어력을 보여주었으나, 추가 접종여부 와 관계없이 일정수준 이상 (> 80%)의 방어력을 확인함으로 써 동일 지역형 바이러스 (SEA), 다른 지역형 바이러스 (Cathay, ME-SA) 모두에 대한 우수한 효능을 확인하였다.
바이러스 전체를 항원으로 하는 불활화 바이러스 백신과 달리, 재조합 단백질 항원은 병독성과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려진 VP1 중 일부인 epitope만을 반복하여 배치함 으로써 구제역바이러스에 대한 특정항체를 집중적으로 생 성할 수 있게 설계되었다. 재조합 단백질 백신에 의해 생성 된 특정항체는 항원의 모티브가 된 구제역 바이러스 O혈청 형 O/MYA/7/98 (SEA) 뿐만 아니라 O/CHA/4/99 (ME-SA), O/ZK/93 (Cathay) 에도 유효한 방어력을 가진 것으로 유추할 수 있다. 본 연구에서 개발한 구제역 재조합 단백질 항원은
단일항원으로 다양한 지역형 구제역 바이러스에 대한 방어 가능성을 보여줌으로써, 현재 국내 발생하는 구제역 바이러 스 지역형 (2000년, 2002년 FMDV O/ME-SA와 2010년 SEA) 뿐만 아니라 외부에서 유입 가능성이 있는 바이러스 (2015년, 2018년 FMDV O/Cathay- 홍콩)까지 대응할 수 있는 구제역 백신 개발의 발판을 마련하였다.
4. CONCLUSION
본 연구에서는 구제역 바이러스의 단일 혈청형의 여러 지역 형의 항원결정기 부분을 비교하고 이를 이용하여 재조합 단 백질 항원을 개발하였다. 또한 목적동물인 돼지에 대한 여러 지역형 구제역 바이러스에 대한 방어력을 입증하였다. 구제 역 바이러스 재조합 단백질 단일 항원으로 국내 발생 및 국 내 유입 가능한 다종의 지역형 바이러스에 대한 방어가능성 을 제시하였으며, 본 연구를 바탕으로 다양한 지역형 또는 혈청형을 대응하는 재조합 단백질 백신 개발을 시도할 수 있 게 되었다.
Acknowledgements
이 논문은 2019년도 농림축산식품부 주관으로 가축질병대 응기술 연구개발사업 신규과제에 대한 선행연구로 수행되 었음.
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Tandem repeats of T helper epitopes enhance immunogenicity of
Table 8. Comparison of FMDV VP1 epitope1 and epitope 2
Serotype: FMDV O
Epitope 1 Identity
(%) Epitope 2 Identity
(%)
Total Identity (%)
Topotype Isolate
rFMDV Ag: FO3-SIC LTNVRGDLQVLAQKAARPLP 100 RHKQKIVAPVKQSL 100 100
SOUTH EAST ASIA (SEA) O/MYA/7/98 LTNVRGDLQVLAQKAARPLP 100 RHKQKIVAPVKQSL 100 100
Pan Asia (ME-SA) O/CHA/4/99 VTNVRGDLQVLAQKAARTLP 95 RHKQKIVAPVKQLL 100 91
CATHAY O/ZK/93 VSNVRGDLRVLAQKAERALP 90 RHKQKIVAPAKQLL 92 80
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