제 13강 식물의 DNA 추출 및 전기영동
1. 실험목표
1) 식물의 DNA를 추출하여 관찰하고 확인할 수 있다.
2) DNA 검사 등에 사용되는 전기영동의 원리를 안다.
2. 실험 소개
DNA라는 용어는 우리가 일상에서도 흔히 쓰고 있는 대표적인 과학용어 중에 하나이다. “DNA 감식을 통해 범인 검거에 성공했습니다.” 등 뉴스나 신문에 심심치 않게 DNA에 대한 내용이 나온다. 이처럼 다 양한 미디어를 통해 학생들은 이미 저학년 때부터 DNA라는 용어를 접하고 있지만 현행 교육과정에서 DNA에 대한 내용은 고등학교 수준에서 다루어진다. 학생들은 DNA가 모든 생물에 존재하는 유전물질임을 지식적으로는 알고 있지만 실제로 관찰할 기회가 거의 없다. 본 실험에서는 막연히 관찰이 어려울 것으로 만 생각되는 DNA를 브로콜리, 키위, 바나나 혹은 딸기 같은 일상적인 재료들을 사용하여 손쉽게 추출하는 실험을 통해 학생들이 DNA의 구조와 기능에 대한 이해를 넓히도록 하고, 생명과학에 대한 흥미를 높이도 록 한다.
3. DNA에 대하여
1) DNA의 발견
독일의 동물학자였던 오스카 헤르트비히는 현미경을 이용해 성게의 수정과정을 연구하던 중에 난자와 정자가 만난 뒤 정자의 핵이 난자 안으로 빨려 들어가 두 핵이 하나로 합쳐지면서 새로운 수정란이 만들 어지는 과정을 관찰하였다. 이때 정자가 난자에게 전해주는 것은 오직 세포핵뿐이지만, 수정란은 자라서 하나의 개체로 발달하였다. 유성생식을 하는 생물의 경우, 양친에게서 골고루 유전적 성질을 물려받는다.
즉, 남성이 자손에게 넘겨주는 것은 오직 세포핵뿐이다. 따라서 남성이 생식에 기여하기 위해서는 이 핵 속에 유전정보를 넣어 전해 주지 않으면 불가능 하다.
핵 속에 들어있는 물질의 정체를 밝힌 사람들의 계보를 찾아 올라가면, 스위스의 생화학자 프리드리히 미셔의 이름까지 올라간다. 미셔는 고름에 들어있는 백혈구의 핵을 추출하여 그 성분을 분석한 결과 세포 핵 안에는 인과 질소가 매우 풍부하게 들어 있음을 알게 도니다. 인과 질소가 어떤 물질의 구성성분인지는 알지 못했지만, 그래도 이 두 물질을 핵 속에 존재하는 물질을 구성하는 대표 원소라고 생각했고, 핵 속에 들어 있는 물질에 뉴클레인이라는 이름을 붙여 주었다. 그 후 연구를 계속한 결과 백혈구의 핵뿐만 아니라 다른 세포의 핵에도 인과 질소가 가득 들어 있다는 것을 알게 되었다. 후에 이 물질이 산성을 나타낸다는 것을 발견하고 다시 nucleic acid, 즉 핵산이라는 이름을 붙여 주었다. 얼마 후, 핵산의 일종인 DNA의 구조가 밝혀졌지만, DNA는 그 구조가 너무 단순한 것이 오히려 마이너스 요인으로 작용했다. DNA는 디 옥시리보오스와 인산 그리고 네 종류의 염기(A, G, C, T)로만 구성되어 있기 때문이다. 겨우 네 가지만으 로 그토록 복잡한 인간의 정보를 모두 표현할 수 없을 것이라 생각했던 것이다. 인간을 이루는 정보가 복 잡할 것이라는 생각은 그 기본구조 물질 역시 여러 종류일 것이라는 선입견을 가지게 했고, 이는 오랫동안 인간의 유전물질이 DNA가 아니라 단백질일 것이라는 생각에 무게를 실어 주게 된다. 단백질은 끊임없이 생성되고 없어지는 등 변화무쌍한데 반해, DNA는 평소에는 아무런 일을 하지 않는 것처럼 보인다. 따라서 학자들은 DNA가 유전물질이 아니라 유전물질인 단백질을 지지해 주는 버팀목 같은 존재라고 생각하게 된 다.
2) DNA의 구조
DNA의 분자구조는 1953년 미국의 J.D.왓슨과 영국의 F.C.크릭에 의해 해명되었다. 이 구조는 2중 나
- 2 -
선 구조로서, 뉴클레오티드의 기다란 사슬 두 가닥이 새끼줄처럼 꼬여 있다. 이 구조는 마치 사다리를 비 틀어서 꼬아놓은 것과 같은 것이라고도 할 수 있는데, 가령 이 새끼줄과 같은 2중 나선을 똑바로 펴면 다 음과 같은 구조가 된다. 여기서 A, G, C, T는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 타이민 4종의 염기를 표시하고, S는 디옥시리보오스를, 그리고 P는 인산을 나타낸다. 사다리의 두 다리는 디옥시리보오스와 인산의 연결 (-S-P-S-P…)에 해당하고, 사다리의 발판은 두 다리에서 직각으로 뻗어 나와 서로 마주보고 있는 염기에 해당한다고 할 수 있다.
위의 구조에서 A와 T, 그리고 G와 C는 서로 짝을 이루고 있는데 그들 사이의 점선은 이 두 염기 사이 에 형성된 약한 결합인 수소결합을 의미한다. A와 T 사이에는 두 곳에서 수소결합이 형성되어 있고, G와 C 사이에는 세 곳에서 형성되어 있다. 이 수소결합으로 2개의 서로 마주보는 염기가 붙들려 있으므로 사 다리의 두 다리 또는 새끼의 두 가닥이 서로 붙들려 있게 된다.
DNA의 2중나선 구조에서 A는 반드시 T와, 그리고 G는 반드시 C와 마주보고 있다. 그 이유는 이 4종 의 염기의 화학구조 때문인데 이렇게 짝지었을 때 비로소 두 가닥이 일정한 간격을 가지고 2중 나선 구조 를 유지할 수 있는 것이다.
따라서 DNA를 그 성분 뉴클레오티드로 완전히 분해한 다음 4종의 염기의 함량비를 측정해 보면 A의 함량(mol)은 T와 똑같고 G의 함량은 C와 똑같다. 이 A-T, G-C의 짝짓기는 DNA가 유전자로서의 기능을 나타내는 데 매우 중요한 의미가 있다. DNA의 2중나선 구조에서 나선의 한 바퀴 수직길이는 3.4nm이고 뉴클레오티드 10개가 나선 한 바퀴를 형성한다. 그리고 나선의 지름은 2nm이다.
그림 1. DNA의 구조
4. DNA의 추출
진핵세포의 DNA는 선형이고 이중나선 구조로 되어 있다. 세포 내 DNA는 많은 양의 단백질과 결합하 여 여러 단계로 응축되어 존재하며, 세포분열 시에는 이러한 DNA가 더욱 꼬이고 응축되어 염색체로 관찰 된다. 따라서 세포에서 DNA를 추출하기 위해서는 먼저 세포막과 핵막을 터뜨려야 하며, DNA와 결합하고 있는 단백질을 제거해야 한다.
식물은 진핵생물이므로 그 DNA 또한 진핵생물의 일반적인 DNA와 거의 유사하다고 할 수 있다. 최근 에 이 식물세포가 동물과 거의 유사한 유전자의 구조와 기능을 가지고 있으나, 광합성 등 식물에 특이적인 기능에 관련된 유전자 및 유전현상 또한 많이 존재하고 있기 때문에 그러한 현상들을 근본적으로 분자의 측면에서 접근하는데 노력하고 있다.
식물세포는 동물세포와는 달리 셀룰로오스와 펙틴 등의 섬유소를 함유한 단단한 세포벽으로 둘러싸여 있어 식물세포로부터 유전체를 분리하는 방법은 동물이나 박테리아로부터 유전체 DNA를 분리하는 것에
비해 어렵다. 특히 단단한 세포벽을 물리적인 방법으로 분해하는 과정에서 거대 유전체 DNA분자가 쉽게 잘려진다. 또한 식물세포는 다른 세포에 비해 많은 양의 탄수화물, 2차 대사산물 및 핵산분해효소를 포함 하고 있어 순수한 DNA 분리를 어렵게 하므로 이를 제거하는 단계가 추가로 요구된다.
지금까지 식물에서 DNA를 분리하는 기본과정은 1) 식물분쇄, 2) 세포용해, 3) 용해된 세포에서의 DNA 추출과 농축 등의 단계로 이루어진다. 식물세포의 특성상 함유된 많은 양의 탄수화물의 효과적인 제거를 위하여 양이온 세제인 CTAB를 완충액에 포함시켜 사용한다. CTAB는 고염의 조건에서 DNA와 용해성 복 합체를 형성하므로, 클로로포름 추출방법에 의해 세포벽 찌꺼기나 변성된 단백질과 탄수화물을 효과적으로 제거 할 수 있다.
이 밖에도 실험 재료를 유전체 분리실험 전 2~3일 동안 암소에 보관하여 탄수화물의 양을 줄인 후 사 용하는 방법도 효과적이다. 근래에는 개량된 실리카 흡착법을 응용하여 매우 효과적으로 거대한 식물 유전 체 DNA를 분리할 수 있는 키트가 상업적으로 개발되어 많이 사용된다.
5. 전기영동의 원리
전기영동(electrophoresis)의 원리는 눈에 보이지 않는 DNA시료를 gel에 놓은 후 전기를 걸어서 시료 의 각 성분이 크기에 따라 다르게 움직이는 성질의 차이로 분리하는 방법이다. DNA는 많은 인산기를 가 지고 있기 때문에 전기적으로 음(-)전하를 띠고 있다. 따라서 전기를 걸어주면 -극에서 +극으로 이동하게 된다. 이 때 DNA의 이동이 일어나고 있는 Agarose gel에는 균일한 작은 입자들이 촘촘히 박혀 있는 일 종의 필터 구조를 형성하고 있기 때문에 크기가 작은 시료는 입자를 사이를 쉽게 빠져나갈 수 있고, 크기 가 큰 입자는 움직임에 방해를 받아서 느리게 이동하게 된다. DNA 분자의 크기에 따라 발생하는 이러한 이동 속도의 차이에 따라 DNA 분자의 분리가 가능해지고, 이 방법은 특정 유전자를 포함하는 DNA 조각 을 추출하거나, 사람들 사이에서 나타나는 DNA 서열 차이의 비교를 통한 유전자 검사 등에 응용될 수 있 다.
그림 2. Agarose gel을 이용한 DNA의 전기영동
DNA는 맨 눈으로 관찰이 어려운 시료이기 때문에, 실험 과정에서는 DNA의 시각적 확인을 위해서 특 수한 염색 방법을 사용한다. 일반적으로 실험실에서는 Ethidium bromide(EtBr)라는 화학물질을 사용하는 데, EtBr은 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진 그룹을 지니고 있어서 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리된 상태의 EtBr와 달리 자외선에서 형광을 나타낸다. 이렇게 EtBr에 염색된 DNA가 내는 형 광 가시광선을 통해 우리는 DNA를 시각적으로 확인하고 분석할 수 있다. 하지만 EtBr은 강력한 발암물질 이고 독성을 지닌다. 따라서 학생들을 대상으로 한 실험에서는 EtBr 대신 핵산을 염색할 수 있는 메틸렌 블루를 사용한다.
- 4 -
<강의용 PPT자료>
- 6 -
- 8 -
- 10 -
- 12 -
<학생활동지>
식물의 DNA 추출 및 전기영동
년 월 일 반 이름
1. 실험목표
1) 식물의 DNA를 추출하여 관찰하고 확인할 수 있다.
2) DNA 검사 등에 사용되는 전기영동의 원리를 안다.
2. 실험 준비물
▶ DNA 추출
Ÿ 기구 : 막자사발, 비커(250㎖/500㎖), 삼각 플라스크, 구멍이 작은 체, 유리막대 Ÿ 재료 : 브로콜리, 딸기, 바나나, 100% 에탄올, 소금, 주방용 세제, 증류수
▶ 전기영동
Ÿ 기구 : 전기영동 세트, 빛 투과용 판
Ÿ 재료 및 시약 : Agarose, TAE 완충용액, 증류수, 메틸렌블루 용액
3. 실험 방법
▶ DNA 추출
1) 증류수, 소금, 세제를 이용하여 추출에 필요한 용액을 만든다. (약수저이용) -> 소금 NaCl 2숟갈 + 세제 뚜껑 한개 + 150ml이 되도록 증류수 추가 2) 브로컬리의 송이부분을 한송이 도려낸다.
3) 송이부분을 막자사발에 넣고 덩어리가 생기지 않도록 충분히 갈아준다.
4) 갈아진 브로컬리에 미리 만들어둔 용액을 50ml 정도 추가한다.
5) 용액을 잘 섞어주며 (계속 막자사발에서 갈아준다) 브로컬리와 용액이 충분히 반응할 수 있도록 10 분 기다린다.
6) 10분이 지난 뒤 체를 이용하여 그 용액을 새로운 용기 (비커)에 걸려낸다.
7) 걸러진 용액에 그 양의 2배정도의 에탄올을 넣는다. (천천히 처리한다)
-> 나무젓가락을 벽에 기댄 뒤 에탄올이 나무젓가락을 타고 흘러들어 가게 한다.
8) 잠깐 동안 섞지 않고 방치한다.
9) DNA가 응고되어 흰색으로 관찰된다.
10) 나무젓가락을 이용하여 DNA를 감아 꺼내어 본다.
▶ 전기영동
1) 깨끗하고 건조한 유리판(또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.
2) 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액(1x TAE)을 충분히 준비한다.
다음 표를 이용하여 분리하고자 하는 DNA 크기에 해당하는 양의 agarose 분말과 완충액을 삼각 플라스크 또는 유리병에 담는다.
3) 전자레인지를 이용하여 agarose가 녹을 때까지 서서히 가열한다.4) 용액을 60°C까지 식힌다.
5) Comb을 agarose를 모두 부었을 때 주형의 밑바닥으로부터 0.5∼1.0 mm정도 떨어져서 위치하여
- 14 - 홈을 형성할 수 있도록 고정시킨다.
6) 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붇는다. Gel은 3∼5 mm 두께가 되도록 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다.
7) 실온에서 20∼30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전 기영동 tank안에 설치한다.
8) Gel을 1 mm 정도의 두께로 덮을 수 있을 정도로 충분한 양의 전기영동 완충용액(1x TAE)을 가한 다.
9) DNA 시료를 전기영동용 loading 완충용액과 혼합한 후 pipette을 이용하여 잠겨있는 gel의 홈에 혼합액을 조심스럽게 가한다.
10) Gel tank의 뚜껑을 닫고 DNA가 양극 쪽으로 이동해갈 수 있도록 양극에 빨간 도선을, 음극에 검 정 도선을 연결하고, 전극간의 거리 1 cm당 1∼5 V의 전압을 가한다.
11) 전기영동이 끝나면 전기를 끄고 도선을 제거한 후 gel tank의 뚜껑을 연 다음 gel을 메틸렌블루 용액에 15분 염색한다.
12) 염색이 끝나면 증류수에서 10분정도 나머지 메틸렌블루 용액을 씻어낸다.
13) 빛이 투과되는 판위에서 gel을 관찰한다.
4. 결과 정리
1) 식물의 어느 부위에 DNA가 들어 있는지 토의해보자.
2) DNA와 에탄올이 만나면 어떻게 되는지 설명해보자.
3) 처음에 넣어준 소금과 세제는 어떤 역할을 하는가?
4) 두 배의 에탄올을 넣는 까닭은 무엇 때문인가?
5) 에탄올을 상온의 에탄올보다는 냉장고에 보관하였던 에탄올을 사용하는 이유는?
6) 전기영동 실험을 통해 알아본 각자가 실험한 DNA의 크기는 몇 bp인가? 이 때 bp는 어떤 의미인 가?
