Effects of Chunglijagam-tang Aqueous Extracts on Streptozotocin-induced Rat Diabetes and Related Complications

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․교신저자: 강석봉 대구시 수성구 상동 165번지

대구한의학교 부속 대구한방병원 신계내과학교실 TEL: 053-770-2102 FAX: 053-770-2055 E-mail: [email protected]

청리자감탕이 Streptozotocin으로 誘發된 흰쥐의 糖尿病 및 糖尿病合倂症에 미치는 영향

박윤식, 윤경민, 임은영, 신현철, 강석봉 대구한의대학교 한의과대학 신계내과학교실

Effects of Chunglijagam-tang Aqueous Extracts on Streptozotocin-induced Rat Diabetes and Related Complications

Yoon-sik Park, Gyeong-min Yoon, Eun-yeong Im, Hyeon-chul Shin, Seok-bong Kang Dept. of Oriental Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Daegu Haany University ABSTRACT

Objective :The object of this study was to observe the effects of aqueous extracts ofChunglijagam-tang(CLJGT), which has traditionally been used in Korean medicine for treating various diseases, on streptozotocin(STZ)-induced rat diabetes and related complications: diabetic nephropathy, hepatopathy and hyperlipemia.

Methods :CLJGT extracts were orally administered once a day for 28 days at a dosage 50, 100 and 200㎎/㎏ from 21 days after STZ treatment, and the changes on body weights, blood glucose levels, kidney and liver weights, serum BUN(blood urea nitrogen), creatinine, AST(aspartate transaminase), ALT(alanine aminotransferase), HDL(high-density lipoprotein), LDL (low-density lipoprotein), total cholesterol and triglyceride levels were observed with pancreatic malondialdehyde(MDA) and glutathione(GSH) contents. The results were compared with silymarin 100㎎/㎏.

Results :Significant decrease of blood glucose levels, kidney and liver weights, serum BUN, creatinine, AST, ALT, LDL, total cholesterol, triglyceride levels, pancreatic malondialdehyde contents and significant increase of body weights, serum HDL levels, pancreatic glutathione contents were detected in CLJGT extracts 50, 100 and 200㎎/㎏ administered groups as compared to the STZ control group.

Conclusion : CLJGT extracts showed favorable effects on the STZ-induced diabetes and related complications mediated by their antioxidant effects as similar to silymarin. Therefore, it is expected that DBEH has potential for use in the management of diabetes and various diabetic complications.

Key words : Chunglijagam-tang(Qinglizikan-tang), diabetes, hyperlipemia, antioxidant, silymarin

Ⅰ. 서 론

당뇨병은 인슐린의 절대적 또는 상대적 결핍과 조직에서의 인슐린의 작용저하에 기인한 고혈당

및 이에 수반되는 대사장애를 특징으로 하는 질환 군이다¹. 당뇨병의 유병률은 급속적으로 증가하고 있어 2005년에는 30대 이상에서 8.1% 유병율을 보 였고, 사망률도 1996년의 3.4%에서 2006년에는 4.8%

로 증가하여 사망원인이 증가추세에 있다². 당뇨병의 합병증은 급성합병증과 만성합병증으 로 구분되는데, 급성합병증은 최근 현저히 줄어든 반면, 만성합병증은 인슐린 요법에도 불구하고 대

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부분의 당뇨병환자에서 발생한다고 알려져 있어 이에 대한 예방 및 치료가 필요하다. 이러한 만성 합병증은 망막병증, 신장병증 및 신경병증과 같은 미세혈관 합병증과 동맥경화증과 관련된 심근경색 증, 협심증 등의 심혈관질환, 뇌졸중, 말초혈관질환 과 같은 대혈관 합병증으로 대별된다. 그 외 비혈 관계합병증으로 위마비, 설사 등의 위장관 질환과 배뇨장애, 성기능장애 등의 비뇨생식기 질환, 그리 고 피부과 질환 등이 있다³.

한의학에서 당뇨병은 消渴의 범주에 속하는데 陰盡虧損하여 燥熱內生하는 것이 기본 병기이다.

임상상 上消, 中消, 下消로 분류하며 淸熱, 生津, 止渴의 치법이 응용되는데 消渴이 치료되지 않고 오 래되면 轉變하여 目無見, 手足偏廢, 癰疽, 雀目, 內障瘡瘍 등이 발생한다고 하였다⁴.

淸离滋坎湯은 龔⁵의 萬病回春에 처음 收錄되어 있으며, 陰虛火動으로 인한 潮熱盜汗과 痰喘心荒 등을 다스리는 처방으로 消渴치료에 응용되어 본 연구에 적합할 것으로 생각 되어진다^5-7. 현재까지 淸离滋坎湯에 대한 연구로는 면역활성⁸ 과 항암효 과⁹가 보고되어 있으나 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 대한 연구는 없었다.

따라서 본 연구에서는 淸离滋坎湯이 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 streptozotocin(STZ)으로 당뇨병을 유발한 흰쥐에 50, 100 및 200 mg/kg 淸离滋坎湯 물 추출물을 투

여한 후 체중, 혈당, 장기 중량, 혈청 성분의 변화, 췌장, 간 및 신장내 malondialdehyde, glutathione 함량을 측정하였으며 이를 통하여 유의성 있는 결 과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재 료 1) 실험동물

실험동물은 6주령의 암컷 Sprague-Dawely(SD) rat(SLC, Japan) 96마리를 실험실 환경에 7일간 순화시킨 다음 실험에 사용하였으며, 온도는 20-2 5℃, 습도는 30-35%, 명암주기는 12시간 주기로 조 절된 환경에서 사육하였다. 사료(Samyang, Korea) 와 음수는 자유롭게 공급하였고, STZ 투여일과 약 물 투여시작일 및 최종 희생일에는 18시간 정도 절 식시켰으며, picric acid로 개체를 식별하였다. 본 실험에 사용된 모든 실험동물은 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals¹⁰에 준하여 취급하였다.

2) 실험약재

본 실험에 사용된 약재는 대구한의대학교 의료 원 약제과에서 구입한 것을 현미경하에서 관능검 사를 통하여 선정하여 사용하였으며, 본 실험에 사 용된 淸离滋坎湯 1첩의 조성은 <Table 1>과 같다.

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Korean name Scientific name Herbs Amounts (g) Sukjihwang Rehmannia glutinosa var. purpureaMakino Rehmanniae Radix Preparata 3 Saenggeonjihwang Rehmannia glutinosa var. purpureaMakino Rehmanniae Radix 3 cheonmundong Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr. Asparagi Tuber 3 maekmundong Liriope platyphyllaWang et Tang Liriopis Tuber 3 Danggwi Angelica gigas Nakai Angelicae Gigantis Radix 3 Baekjakyak Paeonia japonica var. pilosa NaKai Paeoniae Radix 3 Sansuyu Cornus officinalis Siebold et Zucc. Cornus Fructus 3 Sanyak Dioscorea batatas Decaisne Dioscoreae Rhizoma 3

Baekbokryeong Poria cocos Wolf Hoelen 3

Baekchul Atractylodes macrocephala Koidzumi Atractylodes Macrocephale

Rhizoma 3

Mokdanpi Paeonia suffruticosaAndr. Moutan Cortex Radicis 2 Taeksa Alisma canaliculatum A.Br. & Bouche Alismatis Rhizoma 2 Hwangbaek Phellodendron amurense Rupr Phellodendri Cortex 2

Jimo Anemarrhena asphodeloides Bunge Anemarrhenae Rhizoma 2

gamcho Glycyrrhiza uralensis Fischer et. De Candolle Glycyrrhizae Radix 2

Total 15 types 40

Table 1. Composition ofChunglijagam-tang(CLJCT) Used in This Study

2. 방 법

1) 淸离滋坎湯 추출물 제조

선정된 약제 2첩 분량 (80g)을 정제수 2,000 ml 로 가열 추출한 후 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(N-N type; LAB Camp, Dajeon, Korea)로 감압 농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 programmable freeze dryer(PVTFD10A; ilShin Lab., Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 총 19.04 g(수율 약 23.80%)의 진갈색의 물 추출물을 얻어 실험에 사용하였다.

2) 당뇨병 및 당뇨병합병증의 유발

총 96마리의 실험동물 중 80마리는 STZ(Sigma, MO, USA) 60 mg/kg을 50 mM citrate buffer에 용 해시켜5 ml/kg의 농도로 1회 복강투여하였으며, 정 상 대조군에서는 STZ 대신 50 mM Citrate buffer 만 동일한 방법으로 투여하였다. Streptozotocin은 실험물질 투여 3주전에 투여하였다.

3) 실험군 분리 및 약물의 투여

실험동물은 각 군당 8마리씩 배치하였으며 당뇨

를 유발하지 않은 정상대조군, STZ 투여로 당뇨를 유발한 후 멸균 증류수를 투여한 STZ 대조군, 당 뇨 유발 후 silymarin(Sigma, MO, USA) 100 mg/kg 을 투여한 silymarin 투여군, 당뇨 유발 후 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100, 200 mg/kg을 투여한 CLJGT 50, CLJGT 100, CLJGT 200의 6군으로 구분 하였으며<Table 2>, 淸离滋坎湯 추출물 및 silymarin 은 멸균 증류수에 용해시켜 5 ml/kg의 용량으로 매일 1회 28일간 경구 투여하였다.

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Groups Streptozotocin/Test article/Dose(mg/kg/day)

Control

Intact 50mM Citrate buffer and DW treated

(5 ml/kg) Streptozotocin Streptozotocin

60 mg/kg and DW treated Reference Silymarin Streptozotocin and

Silymarin 100 mg/kg treated

CLJGT

CLJGT 50 Streptozotocin and CLJGT 50 mg/kg treated CLJGT 100 Streptozotocin and

CLJGT 100 mg/kg treated CLJGT 200 Streptozotocin and

CLJGT 200 mg/kg treated CLJGT,Chunglijagam-tangaqueous extracts; CLJGT, silymarin or vehicle (distilled water; DW) were dosed at 5 ml/kg volume, once a day for 28 days from 3 weeks after STZ treatment; 8 rats per group, total 6 groups were used this study; Diabetes and related complications were induced by single intraperitoneal injection of STZ All animals were sacrificed after 28 days of test article treatment, at 7 weeks after STZ treatment.

Table 2. Experimental Design Used in Single Dose Toxicity Test

4) 체중 측정

STZ 투여일, 약물 투여 시작일, 투여 7, 14, 21, 27일 및 최종 희생일에 각각 체중을 측정하였으며, 개체 차이에 의한 체중 변화를 최소화하기 위해 약 물 투여 전후의 체중변화량인 증체량(body weight gains)을 측정하였다.

5) 장기 중량 측정

최종 희생일에 모든 실험동물의 좌측 신장과 간 을 적출하여 각각 중량을 측정하여 절대중량으로 하였으며, 체중 변화에 따른 이차적 변화를 최소화 하기 위해 체중에 대한 각 장기 의 절대중량 비율

인 상대중량을 산출하였다.

6) 혈중 Glucose 함량의 측정

STZ 투여 21일 후 및 최종 희생일에 안와정맥 총(orbital plexus)에서 NaF glucose vacuum tube (Becton Dickinson, USA)에서 약 0.3 ml의 혈액을 채취하여 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈장을 분리 한 후 자동혈액분석장치(Toshiba 200 FR, Japan) 를 이용하여 혈중 glucose 함량을 측정하였다.

7) 혈중 BUN(blood urea nitrogen), creatinine, AST(aspartate transaminase) 및 ALT(alanine aminotransferase) 함량의 측정

STZ 투여 21일 후 및 최종 희생일에 안와정맥 총과 후대정맥(vena cava)에서 각각 약 0.5 및 6 ml의 혈액을 채취하여 상온에서 1시간 정도 방치 한 다음 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 분리 한 후 자동혈액분석장치(Toshiba 200 FR, Japan) 를 이용하여 혈중 BUN, creatinine, AST 및 ALT 함량을 측정하였다.

8) 혈중 HDL(high-density lipoprotein), LDL (low-density lipoprotein), total cholesterol 및 triglyceride 함량의 측정

STZ 투여 21일 후 및 최종 희생일에 안와정맥 총과 후대정맥에서 각각 약 0.5 및 6 ml의 혈액을 채취하여 상온에서 1시간 정도 방치한 다음 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 분리한 후 자동혈액 분석장치(Toshiba 200 FR, Japan)를 이용하여 혈 중 HDL, LDL, total cholesterol 및 triglyceride 함 량을 각각 측정하였다.

9) 조직 내 malondialdehyde 및 glutathione 함량 의 측정

최종 희생일에 모든 실험동물의 췌장, 간 및 신 장을 적출하여 멸균 생리 식염수로 세척하고 주변 지방조직을 제거한 후 in 9 vols ice-cold 0.15 M/L KCl 및 1.9 mM/L ethylenediaminetetraacetic acid 가 함유된 용액에서 homogenize 후 상층액을 분리 하여 malondialdehyde 및 glutathione 측정하였다¹¹. 조직내 단백질 함량은 bovine serum albumin을

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standard로 이용하여 측정하였으며¹², 지질 과산화 정도(lipid peroxidation)는 2-thiobarbituric acid를 이용하여 malondialdehyde (nmole)/g protein 단위 로 측정하였다¹³. 또한 항산화 정도를 판단하기 위해 microplate reader에 적응시킨 enzymatic recycling procedure를 이용하여 glutathione (μmole)/g protein 단위로 측정하였다¹⁴.

3. 통계처리

모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하였다.

등분산일 경우 one way ANOVA test를 실시한 다 음 least-significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비 등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W를 실시 하여 군간의 유의성을 검증하였다. 모든 통계처리 는 SPSS for Windows(Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용하여 평가하였으며, p<0.05 인 경우 통계적 유의성을 인정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 체중의 변화

정상 대조군에 비해 streptozotocin대조군에서는 유의 성 있는(p<0.01) 현저한 체중의 감소가 streptozotocin 투여 3주 후부터인 투여 시작일부터 인정되었으며, 따라서 당뇨병 유발기간, 약물투여 후 및 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 각각 정상 대조군에 비 해 유의성 있는(p<0.01) 현저한 감소를 나타내었 다. 한편 silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 streptozotocin 대 조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중 의 증가가 투여 21일 또는 27일 후부터 각각 인정 되었으며, 약물투여 후 및 실험 전 기간 동안의 증 체량 역시 각각 streptozotocin 대조군에 비해 유의 성 있는(p<0.01) 증가를 나타내었다. 한편 silymarin 및 모든 세 가지 용량의 淸离滋坎湯 물 추출물 투 여군에서도streptozotocin 대조군 유사한 당뇨병 유 발기간 동안의 증체량을 각각 나타내었다<Table 3, Fig. 1>.

Groups

Body weight gains during Diabetes and related complications

induce periods, before start of test article treatment (3 weeks)

After test article treatments

(4 weeks) Total experimental periods (7 weeks) Controls

Intact 62.25±2.12 27.00±8.47 89.25±9.35

Streptozotocin 8.13±4.12** -33.00±9.10** -24.88±7.30**

Silymarin

100 mg/kg 7.50±2.39** -5.63±13.82**^,## 1.88±12.92**^,##

CLJGT extracts

50 mg/kg 8.50±4.69** -15.38±6.97**^,## -6.88±8.58**^,##

100 mg/kg 8.00±3.25** -5.25±12.41**^,## 2.75±14.40**^,##

200 mg/kg 8.00±4.00** 2.13±11.41 10.13±12.78**^,##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (g); **p<0.01 compared with intact control; ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 3. Changes on the Body Weight Gains after Streptozotocin and Test Article Administration

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Groups Liver weights

Absolute (g) Relative (%) ofbody weights Controls

Intact 5.073±0.934 1.929±0.404 Streptozotocin 8.550±0.640** 5.685±0.335**

Silymarin

100 mg/kg 7.090±0.952**^,## 4.004±0.377**^,##

CLJGT extracts

50 mg/kg 7.440±0.741**^,## 4.434±0.552**^,##

100 mg/kg 7.183±0.865**^,## 4.088±0.699**^,##

200 mg/kg 6.472±0.546**^,## 3.490±0.320**^,##

Values are expressed Mean±SD of eight rats; **p<0.01 compared with intact control; ##p<0.01 compared with STZ control

Table 5. Changes on the Liver Weights after

Streptozotocin and Test Article Administration 3. 혈중 glucose 함량의 변화

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 glucose 함량 은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 각 각 110.50±13.46, 426.75±21.01, 344.13±11.36, 368.25±

33.29, 343.25±15.72 및 296.25±39.25 mg/dl로 관찰되 었다. 혈중 glucose 함량은 약물 투여 후 STZ 대조 군에서는 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였 으며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대조군 에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01). 한편 모든 투여군에서 약물 투여 전 혈중 glucose 함량은 STZ 대조군과 유사하게 관찰되었다<Table 6>.

Groups Blood glucose levels

At 3 weeks after STZ

treatment (A) At sacrifice, end of 28 days

of test article treatment (B) Changes after test article treatment (B-A) Controls

Intact 105.00±13.61 110.50±13.46 5.50±5.24

Streptozotocin 342.50±19.84** 426.75±21.01** 84.25±18.74**

Silymarin

100 mg/kg 343.38±12.56** 344.13±11.36**^,## 0.75±17.72^##

CLJGT extracts

50 mg/kg 344.88±20.27** 368.25±33.29**^,## 23.38±41.06**^,##

100 mg/kg 343.50±12.58** 343.25±15.72**^,## -0.25±19.77^##

200 mg/kg 344.50±14.94** 296.25±39.25**^,## - 48.25±40.28**^,##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); **p<0.01 compared with intact control; ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 6. Changes on the Blood Glucose Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

4. 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 변화

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 BUN 함량은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 각각 20.83±1.89, 81.39±6.71, 65.55±4.25, 71.89±6.15, 65.21

±5.74 및 53.88±6.56 mg/dl로 관찰되었다. 혈중 BUN 함량은 약물 투여 후 STZ 대조군에서는 정상 대조

군에 비해 유의하게 증가하였으며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여 군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 유의하게 감소 하였다(p<0.01)<Table 7>.

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 creatinine 함 량은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서

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각각 0.61±0.04, 1.31±0.27, 0.90±0.07, 1.06±0.08, 0.91±

0.11 및 0.77±0.13 mg/dl로 관찰되었다. 혈중 creatinine 함량은 약물 투여 후 STZ 대조군에서는 정상 대조 군에 비해 유의하게 증가하였으며(p<0.01), silymarin,

淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여 군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 유의하게 감소 하였다(p<0.01 또는 p<0.05)<Table 8>.

Groups Serum blood urea nitrogen levels At 3 weeks after STZ

treatment (A) At sacrifice, end of 28 days of

test article treatment (B) Changes after test article treatment (B-A) Controls

Intact 20.14±1.50 20.83±1.89 0.69±1.15

Streptozotocin 61.80±4.35** 81.39±6.71** 19.59±4.83**

Silymarin

100 mg/kg 61.89±4.97** 65.55±4.25**^,## 3.66±5.48^##

CLJGT extracts

50 mg/kg 61.79±4.84** 71.89±6.15**^,## 10.10±7.17*^,##

100 mg/kg 61.29±4.22** 65.21±5.74**^,## 3.93±7.05**^,##

200 mg/kg 62.44±3.62** 53.88±6.56**^,## -8.56±8.11**^,##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); *p<0.05 and **p<0.01 compared with intact control; ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 7. Changes on the Serum Blood Urea Nitrogen Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

Groups Serum creatinine levels

Intact 0.60±0.04 0.61±0.04 0.02±0.03

Streptozotocin 0.82±0.10** 1.31±0.27** 0.49±0.20**

Silymarin

100 mg/kg 0.82±0.06** 0.90±0.07**^,## 0.08±0.12^##

CLJGT extracts

50 mg/kg 0.83±0.14** 1.06±0.08**^,# 0.23±0.18**^,##

100 mg/kg 0.83±0.15** 0.91±0.11**^,## 0.08±0.15^##

200 mg/kg 0.83±0.05** 0.77±0.13*^,## - 0.06±0.16^##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); *p<0.05 and **p<0.01 compared with intact control; #p<0.05 and ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 8. Changes on the Serum Creatinine Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

5. 혈중 AST 및 ALT 함량의 변화

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 AST 함량은

정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 각각

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125.00±12.36, 975.13±146.59, 560.63±148.59, 725.75±

194.11, 551.63±225.80 및 404.38±89.79 IU/l로 관찰 되었다. 혈중 AST 함량은 약물 투여 후 STZ 대조 군에서는 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였 으며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대조군 에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01 또는 p<0.05)

<Table 9>.

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 ALT 함량은

정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 각각 30.38±2.33, 429.88±35.20, 279.75±101.05, 343.63±51.37, 277.38±64.99 및 182.36±65.47 IU/l로 관찰되었다.

혈중 ALT 함량은 약물 투여 후 STZ 대조군에서 는 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며 (p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01)<Table 10>.

Groups Serum AST levels

Intact 122.13±12.45 125.00±12.36 2.88±8.04

Streptozotocin 431.25±16.22** 975.13±146.59** 543.88±142.54**

Silymarin

100 mg/kg 428.00±29.73** 560.63±148.59**^,## 132.63±143.72*^,##

CLJGT extracts

50 mg/kg 435.38±20.84** 725.75±194.11**^,# 290.38±192.12**^,#

100 mg/kg 431.38±22.37** 551.63±225.80**^,## 120.25±219.16^##

200 mg/kg 427.13±36.87** 404.38±89.79**^,## - 22.75±110.40^##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (IU/L); *p<0.05 and **p<0.01 compared with intact control; #p<0.05 and

##p<0.01 compared with STZ control.

Table 9. Changes on the AST Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

Groups Serum ALT levels

Intact 29.88±2.30 30.38±2.33 0.50±2.00

Streptozotocin 209.50±17.91** 429.88±35.20** 220.38±33.08**

Silymarin

100 mg/kg 208.50±17.10** 279.75±101.05**^,## 71.25±112.18^##

CLJGT extracts

50 mg/kg 210.63±16.11** 343.63±51.37**^,## 133.00±50.44**^,##

100 mg/kg 209.75±14.40** 277.38±64.99**^,## 67.63±76.52^##

200 mg/kg 208.13±14.51** 182.38±65.47**^,## - 25.75±56.00^##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (IU/L); **p<0.01 compared with intact control; ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 10. Changes on the ALT Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

(10)

640

6. 혈중 HDL cholesterol 및 LDL cholesterol 함량 의 변화

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 HDL cholesterol 함량은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에 서 각각 69.25±14.99, 17.50±2.51, 34.75±3.85, 25.88

±6.15, 34.63±6.59 및 44.50±12.24 mg/dl로 관찰되었 다. 혈중 HDL cholesterol 함량은 약물 투여 후 STZ 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의하게 감소 하였으며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대조

군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.01)<Table 11>.

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 LDL cholesterol 함량은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에 서 각각 7.75±2.31, 24.63±2.83, 19.13±3.64, 21.50±2.33, 18.75±2.49 및 15.63±3.81 mg/dl로 관찰되었다. 혈중 LDL cholesterol 함량은 약물 투여 후 STZ 대조군 에서는 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였으 며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대조군 에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01)<Table 12>.

Groups Serum HDL levels

Intact 71.63±14.69 69.25±14.99 -2.38±4.14

Streptozotocin 36.75±8.24** 17.50±2.51** -19.25±7.48**

Silymarin

100 mg/kg 36.88±4.82** 34.75±3.85**^,## -2.13±5.96^##

CLJGT extracts

50 mg/kg 37.00±8.60** 25.88±6.15**^,## -11.13±8.71*

100 mg/kg 36.88±9.11** 34.63±6.59**^,## -2.25±13.11^# 200 mg/kg 37.00±9.40** 44.50±12.24**^,## 7.50±15.82^##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); *p<0.05 and **p<0.01 compared with intact control; #p<0.05 and

Table 11. Changes on the HDL Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

Groups Serum LDL levels

Intact 7.25±2.05 7.75±2.31 0.50±0.93

Streptozotocin 12.88±2.23** 24.63±2.83** 11.75±2.87**

Silymarin

100 mg/kg 12.88±1.55** 19.13±3.64**^,## 6.25±4.23**^,##

CLJGT extracts

50 mg/kg 13.00±2.27** 21.50±2.33**^,# 8.50±3.12**

100 mg/kg 12.75±2.31** 18.75±2.49**^,## 6.00±4.44**^,##

200 mg/kg 12.88±1.25** 15.63±3.81**^,## 2.75±4.33^##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); **p<0.01 compared with intact control; #p<0.05 and ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 12. Changes on the LDL levels after Streptozotocin and Test Article Administration

(11)

7. 혈중 triglyceride 및 total cholesterol 함량의 변화 약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 triglyceride 함량은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에 서 각각 37.88±7.38, 567.50±99.57, 396.75±50.09, 447.13

±36.45, 387.13±68.21 및 294.63±84.31 mg/dl로 관찰 되었다. 혈중 triglyceride함량은 약물 투여 후 STZ 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의하게 증가 하였으며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대 조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01 또는 p<0.05)

<Table 13>.

약물 투여 후, 최종 희생일의 혈중 total cholesterol 함량은 정상 대조군, STZ 대조군, silymarin, 淸离滋坎湯 물 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에 서 각각 78.13±8.98, 196.88±12.69, 146.00±13.54, 164.50

±20.06, 144.88±8.71 및 103.75±11.18 mg/dl로 관찰 되었다. 혈중 total cholesterol 함량은 약물 투여 후 STZ 대조군에서는 정상 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며(p<0.01), silymarin, 淸离滋坎湯 물 추 출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.01)

<Table 14>.

Groups Serum triglyceride levels

Intact 35.25±7.21 37.88±7.38 2.63±2.20

Streptozotocin 311.25±19.59** 576.50±99.57** 265.25±92.75**

Silymarin

100 mg/kg 312.88±20.43** 396.75±50.09**^,## 83.88±60.26*^,#

CLJGT extracts

50 mg/kg 310.75±17.47** 447.13±36.45**^,# 136.38±50.58**^,#

100 mg/kg 312.63±27.46** 387.13±68.21**^,## 74.50±40.96**^,##

200 mg/kg 311.38±21.59** 294.63±84.31**^,## - 16.75±84.51^##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); *p<0.05 and **p<0.01 compared with intact control; #p<0.05 and

Table 13. Changes on the Triglyceride Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

Groups Serum total cholesterol levels At 3 weeks after STZ

treatment (A) At sacrifice, end of 28 days

of test article treatment (B) Changes after test article treatment (B-A) Controls

Intact 73.88±8.46 78.13±8.98 4.25±3.37

Streptozotocin 130.75±15.32** 196.88±12.69** 66.13±16.37**

Silymarin

100 mg/kg 131.50±5.88** 146.00±13.54**^,## 14.50±14.20^##

CLJGT extracts

50 mg/kg 130.88±10.49** 164.50±20.06**^,# 33.63±22.70*^,##

100 mg/kg 131.63±16.00** 144.88±8.71**^,## 13.25±17.92^##

200 mg/kg 129.88±14.17** 103.75±11.18**^,## - 26.13±16.83**^,##

Values are expressed Mean±SD of eight rats (mg/dl); *p<0.05 and **p<0.01 compared with intact control; #p<0.05 and ##p<0.01 compared with STZ control.

Table 14. Changes on the Total Cholesterol Levels after Streptozotocin and Test Article Administration

(12)

(13)

(14)

(15)

silymarin 100 mg/kg 투여군과 비교하였다.

STZ 유발 당뇨병 모델은 당뇨병 치료제를 개발 하는데 있어서 가장 기본적인 실험 모델로서, 당뇨 병 및 합병증 치료를 위한 치료제 개발에 다양하 게 이용되고 있다^10,15. 대조약물로 사용된 Silymarin 은 엉겅퀴 추출물에서 유래된 flavonoid로 강력한 항산화 작용으로 당뇨병과 당뇨병 합병증 예방 및 치료에 효과적인 것으로 알려져 있으며, 당뇨병 치료 제 개발에 있어 흔히 사용되는 대조 약물(reference) 중 하나이다^16-21.

혈당의 상승은 당뇨병의 가장 기본적인 증후 중 하나로, 혈당의 감소는 당뇨병 치료 시 당연한 목 표가 되어왔다¹⁰. 본 실험의 결과, 세 가지 용량의 淸离滋坎湯 추출물 투여군에서 STZ 대조군에 비 해 현저한 혈당 감소가 관찰된 점은 淸离滋坎湯의 당뇨병에 대한 치료효과를 직접적으로 나타내는 증거로 판단된다.

Streptozotocin 투여 후 인정된 체중 및 증체량 의 감소는 STZ 자체의 직접적인 독성 또는 STZ에 의해 유발된 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 수반된 이차적인 변화로 판단되며, 현재까지 이러한 체중 의 변화는 대사성 질환에 효과가 있는 활성 물질 의 탐색에 있어 가장 기본적인 지표로 사용되어 왔다^22,23. 淸离滋坎湯 50, 100 및 200 mg/kg 투여군 에서 STZ 대조군에 비해 현저한 체중 감소 억제 효과가 관찰된 점은 淸离滋坎湯의 당뇨병 및 당뇨 병 합병증에 대한 치료효과를 간접적으로 나타내 는 증거로 판단된다.

당뇨병이 진행됨에 따라 혈중 BUN 및 creatinine 의 상승과 동반하여 신장의 종창, 염증 및 괴사에 의 한 신장 중량의 증가가 초래되며^24,25, 이러한 신장병증 을 총칭하여 당뇨병증 신병증(diabetic nephropathy) 이라 한다^26,27. 또한 BUN은 단백질 분해 산물인 요 소질소(urea nitrogen)의 혈중 함량을 나타내는 지 표로, 혈중 BUN의 상승은 일반적으로 신장질환의 존재를 의미하며²⁸, creatinine은 근육 대사에 의해 형성되는 질소산물(nitrogenous product)로 BUN과

함께 혈중 creatinine 함량의 증가는 사구체 여과률 의 감소를 의미한다²⁸. 현재까지 이러한 신장 중량 의 증가, 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가 억 제는 당뇨병증 신병증을 완화시키는 주요 증거로 사용되어 왔으며^26-30, 본 실험의 결과에서도 28 일 간의 연속적인 淸离滋坎湯 50, 100 및 200 mg/kg 투여는 STZ에 의한 신장 중량의 증가, 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가를 현저히 억제하였다.

당뇨병성 신병증과 함께 STZ로 인해 간손상이 유발되어 간중량의 증가와 혈중 AST 및 ALT의 현저한 증가가 초래된다. SGOT로 알려진 AST는 미토콘드리아 결합 효소(mitochondria-bound enzyme) 로 주로 간과 골격근 세포에서 관찰된다. 혈중 AST 함량의 증가는 간세포 또는 골격근 세포의 괴사 (necrosis)를 의미하며²⁸, SGPT로 알려진 ALT 역 시 간세포에 고농도로 존재하며, 간세포 파괴 시 혈중으로 유리되는 것으로 알려져 있어, AST 함량 과 함께 간세포 파괴에 대한 가장 기본적인 혈액 화학적 지표로 이용된다²⁸. 따라서 이러한 간중량의 증가 및 혈중 AST, ALT 함량의 증가 억제는 당뇨 병성 간병증을 주요 증거로 사용되어 왔으며¹⁵, 본 실험의 결과에서도 28일간의 연속적인 淸离滋坎湯 50, 100 및 200 mg/kg 투여는 STZ에 의한 간중량 의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가를 현저히 억제하였다.

고지혈증 역시 전형적인 당뇨병 합병증의 하나 로³¹, 당뇨병 시 현저한 혈중 LDL, triglyceride 및 total cholesterol 함량의 증가가 혈중 HDL 함량의 감소와 함께 초래되며, 이들의 변화 억제는 당뇨병 에 의한 고지혈증 억제를 나타내는 직접적인 증거로 활용되어 왔다³². 일반적으로 혈중 LDL, triglyceride 및 total cholesterol 함량의 증가에 수반된 혈중 HDL 함량의 감소가 가장 심각한 문제로 받아들여 지고 있으며^33-35, 이러한 변화를 억제하는 방향으로 고지혈증 치료제가 개발되어 왔다^36-38. 본 실험의 결과, 28일간의 연속적인 淸离滋坎湯 50, 100 및 200 mg/kg 투여는 STZ에 의한 혈중 LDL, triglyceride

(16)

646

및 total cholesterol 함량의 증가와 혈중 HDL 함량 의 감소를 현저히 억제하였다.

최근에 연구에 따르면, 당뇨병의 유발에 free radical에 의한 항산화 방어기전의 변화가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, oxidative stress 가 여러 가지 당뇨병 합병증의 유발에 관여한다고 알려져 있다³⁹. 특히, 항산화 효과의 억제와 함께 oxidative stress의 증가는 당뇨병 시 더 많은 free radical을 형성하고, 이렇게 형성된 free radical 들 은 당뇨병 합병증의 원인이 된다⁴⁰.

본 실험의 결과, STZ 투여에 의해 현저한 체중 의 감소, 신장 및 간중량의 증가, 혈당의 증가, 혈 중 BUN 및 creatinine 함량의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가, 혈중 LDL, triglyceride 및 total cholesterol 함량의 증가과 함께 혈중 HDL 함량의 감소가 초래되어 이전의 보고들^10,15에서와 같이 STZ에 의해 당뇨병 및 당뇨병성 신병증, 간병증 및 고지혈증과 같은 합병증이 초래된 것으로 판단 되며, 췌장, 간 및 신장 내 malondialdehyde 함량의 증가와 glutathione 함량의 감소가 인정되어 이전 의 보고들^41,42과 유사하게 지질과산화에 의한 항산 화 억제에 의해 당뇨병 및 당뇨병 합병증이 초래 된 것으로 판단된다. 한편 본 실험에 사용한 세 가 지 용량의 淸离滋坎湯 물 추출물 투여에 의해 이러 한 STZ 유발 당뇨병 및 당뇨병 합병증이 경감되어 淸离滋坎湯이 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 매우 유 효할 것으로 판단된다. 또한 淸离滋坎湯 50 mg/kg 투여군부터 비교적 우수한 효과가 인정되어 淸离滋坎湯의 유효농도는 50 mg/kg 전후로 판단되며, 본 실험의 결과 淸离滋坎湯은 동일한 용량의 silymarin 투여군과 유사한 효과를 나타내었다. 한편 silymarin 및 淸离滋坎湯 물 추출물 투여에 의해 췌장, 간 및 신장 내 malondialdehyde 함량의 증가와 glutathione 함량의 감소가 매우 효과적으로 억제되어 淸离滋坎湯의 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 대한 효과가 지질 과산화 억제에 의한 항산화에 의해 유발되는 것으로 판단된다.

이상의 결과에서 淸离滋坎湯은 동일한 용량의 silymarin 투여군과 유사한 정도로 항산화 효과에 의한 지질 과산화를 억제하여 STZ 유발 당뇨병 및 당뇨병성 신병증, 간병증 및 고지혈증에 유효한 효 과를 나타내는 것으로 판단된다. 그러나 항염 작용 등의 다른 작용 기전에 의해 STZ 유발 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 유효한 효과를 나타낼 가능성 역 시 배제 할 수 없어, 구성 약재 각각에 대한 효능 및 생리활성을 나타내는 화학성분의 검색과 더불 어 금후 다양한 방면으로 기전적인 연구를 더 수 행해야 할 것으로 판단된다.

V. 결 론

淸离滋坎湯의 당뇨병 및 당뇨병 합병증에 대한 효과를 규명하기 위하여, STZ으로 당뇨병을 유발 한 흰쥐에 50, 100 및 200 mg/kg 淸离滋坎湯 물 추 출물을 투여한 후 체중, 혈당, 장기 중량, 혈청 성 분의 변화, 췌장, 간 및 신장내 malondialdehyde, glutathione 함량을 측정한 결과 다음과 같은 결론 을 얻었다.

1. 淸离滋坎湯 물 추출물은 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 STZ 대조군에 비해 체중 및 증체량 의 감소를 유의하게 억제하였고, 혈중 glucose 함량을 유의하게 감소시켰다.

2. 淸离滋坎湯 물 추출물은 50, 100및 200 mg/kg 투여군에서 STZ대조군에 비해 신장 및 간 중량 을 유의하게 감소시켰고, 혈중 BUN, creatinine, AST 및 ALT 함량을 유의하게 감소시켰다.

3. 淸离滋坎湯 물 추출물은 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 STZ 대조군에 비해 혈중 HDL 함 량을 유의하게 증가시키고, 혈중 LDL, triglyceride 및 total cholesterol 함량을 유의하게 감소시켰다.

4. 淸离滋坎湯 물 추출물은 50, 100 및 200 mg/kg 투여군에서 STZ대조군에 비해 췌장, 간 및 신장 내 malondialdehyde 함량을 유의하게 감소시키

(17)

고, GSH 함량을 유의하게 증가시켰다.

이상의 결과에서 淸离滋坎湯은 STZ으로 유발한 당뇨병 흰쥐에서 체중감소, 고혈당, 신증, 간병증, 고지혈증 및 췌장, 간, 신장의 산화적 손상 등에 유 의한 효과를 나타내었다.

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