Quantitative Analysis of Marker Substances of Paeonia lactiflora by Solid Fermentation

▒ 접수▸2009년 6월 13일 수정▸2009년 7월 22일 채택▸2009년 8월 24일

▒ 교신저자 마진열, 대전광역시 유성구 엑스포로 483 한국한의학연구원 신한방제제연구센터 Tel 042-868-9466 Fax 042-863-9573 E-mail [email protected]

작약의 고체발효에 따른 지표성분의 함량분석

이지혜, 엄영란, 박화용, 이재훈, 마진열 한국한의학연구원 신한방제제연구센터

Quantitative Analysis of Marker Substances of Paeonia lactiflora by Solid Fermentation

Jihye Lee, Youngran Um, Hwayong Park, Jaehoon Lee, Jinyeul Ma Center for Herbal Medicine Improvement Research, Korea Institute of Oriental Medicine

The purpose of this study was investigation of quantitative analysis of marker substances in Paeonia lactiflora extracts by solid fermentation. High performance liquid chromatography (HPLC) for the determination of albiflorin and paeoniflorin in P. lactiflora extracts by solid fermentation, the separation method was performed on C18 column (250

㎜ × 4.6 ㎜, 5 ㎛, RS tech) using gradient solvent mixtures of water-acetonitrile with photodiode array detector (230nm). The flow rate was 1.0 ㎖/min. Retention time of albiflorin and paeoniflorin was about 28.88, 31.92 min and linearity of calibration was showed good result(r2 = 0.9998, 0.9996), respectively. Content of albiflorin was 0.090

± 0.03% in P. lactiflora extract(control), 0.102 ± 0.00% in P. lactiflora extract fermented with Paecilomyces japonica, 0.056 ± 0.01% in P. lactiflora extract fermented with Ganoderma lucidum, 0.093 ± 0.00% in P. lactiflora extract fermented with honey and 0.046 ± 0.00% in P. lactiflora extract fermented with Nuruk. Content of paeoniflorin was 4.506 ± 0.13% in control, 2.599 ± 0.04% in P. lactiflora extract fermented with Paecilomyces japonica, 1.222 ± 0.03%

in P. lactiflora extract fermented with Ganoderma lucidum, 2.750 ± 0.05% in P. lactiflora extract fermented with honey and 0.847 ± 0.00% in P. lactiflora extract fermented with Nuruk, respectively. Content of the marker substances did not increase in all fermentation experiment group.

keywords : Paeonia lactiflora, Solid fermentation, Slbiflorin, Paeoniflorin

I. 서 론

작약(Paeoniae Radix)은 미나리아재비 과의 다년생 초 본인 P. lactiflora Pallas 또는 동속근연식물의 뿌리로 ¹⁾ 한 방에서 주로 진경, 진통작용, 월경불순, 염증치료 등의 목적 으로 사용되었다. ²⁾ 또한 작약은 어혈을 풀어주어 피를 원활 하게 하며 통증을 멈추게 하는 효능이 있으며 주성분으로는

paeoniflorin, albiflorin, paeonol, paeonin, tannin, β -sitosterol, triterpenoids 등이 함유되어 있다. ^3-4) 작약의 생리활성에 대한 연구로는 류마티스 관절염의 치료, 항염증

5) 과 항알러지 효과 ⁶⁾ 등이 보고된 바 있다.

최근 한의학계는 발효기법을 이용한 연구가 활발히 진행

되고 있으며 이에 따라 발효식품이나 발효한약의 개발에 대

한 관심도 꾸준히 증가되고 있는 추세이다. 발효한약이란

한약재를 적당한 조건에서 발효시켜 원래의 성질과 효능이

효소 등의 미생물에 의해 변화되어 증강되거나 새로운 효능

이 생겨 임상에서 辨證論으로 다스릴 때 사용하는 한약을

말한다. ⁷⁾ 즉 발효한약은 전통발효공법을 이용하여 한약재

를 미생물이 잘 이용할 수 있게 찌거나 삶은 다음, 공기 중 의 미생물 또는 유산균과 같은 순수 미생물을 이용하여 발 효한 한약을 말한다. 한약은 몸속으로 들어와 체내에 흡수 되려면 장내세균 총에 의해 다양한 대사체로 분해되는데 발 효과정을 거친 한약재는 유효성분이 저분자화 되면서 장내 세균에 의한 분해 과정이 줄어들 뿐만 아니라 한약의 유효 성분의 체내 흡수율과 생체이용률을 증가시킨다. ⁸⁾⁹⁾ 발효에 주로 사용되는 발효원으로는 영지버섯, 동충하초, 송이버섯, 차가버섯 등의 버섯균사체가 있으며 그 외에도 효모, 알코 올, 꿀, 누룩 등이 있다. ^10-16)

본 연구에서는 한약재 발효에 주로 사용되어지는 영지버 섯, 동충하초, 꿀, 누룩을 발효원으로 사용하여 작약을 발효 시킨 후 발효원에 따라 달라지는 약재의 지표성분 변화를 HPLC를 이용하여 분석하고자 하였다. 이를 위하여 대한약 전의 9개정판 정량법 ¹⁷⁾ 에 고시되어 있는 작약의 주성분인 albiflorin과 paeoniflorin에 대하여 발효 전․후의 함량분 석을 통해 발효된 작약의 지표성분 변화에 대한 결과를 보 고하고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료

1) 약재

본 실험에 사용한 작약 (P. lactiflora)은 식약청 지정 검 사기관에서 품질검사가 완료된 약재로써 경북영천에서 생 산되었으며 영천현대약업사에서 구입하여 사용하였으며 추출수율의 향상을 위해 잘게 분쇄한 후 사용하였다.

2) 발효균주 및 발효물

작약의 발효에 사용된 균주는 (주)바이온에서 직접 동충 하초(Paecilomyces japonica)와 영지버섯(Ganoderma lucidum)품종을 자실체에서 분리하여 사용하였다. 꿀은 강 원도 양구 방산꿀(잡꿀)을 사용하였으며 누룩은 부산시 금 정구 산성누룩을 사용하였다.

2. 시약 및 기기

시료의 추출에 사용한 유기용매는 대정화금주식회사에서 생산한 특급 시약을 사용하였으며 기기분석을 위한 HPLC

용매는 J.T Baker사의 특별시약을 사용하였다. 그 외는 모 두 특급 시약을 사용하였다. HPLC 분석기기는 Shimadzu Cp. (Japan)의 system controller(SCL-10A vp), solvent delivery system(LC-6AD), photodiode array detector (SPD-M10A vp), auto sample injector(SIL-10AF), degasser(DGU-14A)를 사용하였으며 HPLC column은 RStech사의 C18 Optimapak(4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛)을 사용 하였다.

동충하초, 영지버섯 균주 보관용 배지는 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco사)를 이용하였으며 액체종균 생산 용 배지는 PDB(Potato Dextrose Broth, Difco 사)를 사용 하였다. 균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다. 꿀, 누룩 발 효를 위해 dry oven(JSOF-150, Korea)을 이용하였다.

3. 고체발효

1) 동충하초, 영지버섯 균주 배양

균주는 PDA 평판배지에서 4℃에서 보존하면서 30일 간 격으로 계대배양 하였다. 균사 생장을 위해 PDA 평판배지 를 이용하여 항온 배양기에서 25℃, 20일간 배양하였다.

2) 동충하초, 영지버섯 액체종균의 생산

PDB 배지는 삼각플라스크(500 ㎖)에 200 ㎖씩 각각 넣 어 121℃에서 15분간 살균한 다음 냉각시켜 사용하였다.

PDA 평판배지에서 20일간 배양된 균사의 가장자리 부위 를 직경 5 ㎜ 코르크보러를 사용하여 각각 4조각을 채취 한 후 PDB 액체 배지에 접종한 후 25℃에서 7일간 진탕배 양(120 rpm)하여 액체 종균을 생산하였다.

3) 동충하초, 영지버섯 고체발효

작약가루에 동충하초, 영지버섯 액체종균 현탁액을 각각 10%(v/v) 수준으로 접종하여 생육온도 25℃, 상대습도 80%를 유지하면서 30일간 고체발효를 실시하였다.

4) 꿀, 누룩 고체발효

꿀 발효는 당귀가루 500 g에 희석한 꿀(꿀 150 ㎖ + 생수 150 ㎖)300 ㎖를, 누룩발효는 당귀가루 500 g에 누룩발효 액(누룩 50 g에 고두밥 500 g를 넣어 섞은 후 발효시킴)300

㎖를 넣은 후 각각의 시료를 dry oven에서 37℃를 유지하

면서 22일간 고체발효를 실시하였다.

4. 건조감량 시험 ¹⁸⁾

무게를 단 칭량병에 시료 3.0 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 6시간 건조하고, 데시케이터에서 방냉 한 후 그 무게를 항량이 되었을 때의 감량을 건조감량(%) 으로 하였으며 검액의 조제시 이를 감안하여 검체무게를 측 정하였다.

5. 검액의 조제

이 약의 가루 약 0.5 g을 정밀하게 달아 50% 메탄올 50

㎖를 넣어 환류냉각기를 달고 수욕에서 30분간 가열하여 식힌 다음 여과하였다. 잔류물에 50% 메탄올 30 ㎖를 넣어 같은 방법으로 조작하였다. 여액을 모두 합하여 50% 메탄 올을 넣어 정확하게 100 ㎖로 하여 0.45 ㎛ syringe filter 로 여과한 여액을 검액으로 사용하였으며 HPLC로 분석하 여 얻은 chromatogram의 면적을 구하여 표준품의 회귀직 선 방정식으로부터 각각의 albiflorin과 paeoniflorin의 함 량을 구하였고 시료에 대해 3회 반복하여 지표성분의 함량 (%)을 산출하였다.

6. 표준액의 조제

실험에 사용한 지표물질인 albiflorin과 paeoniflorin은 식품의약품안전청에서 분양 받았으며 지표물질을 메탄올 에 녹인 후 albiflorin은 0.05, 0.03, 0.01, 0.005 mg/mL 의 농도로, paeoniflorin은 0.5, 0.3, 0.1, 0.05 mg/mL 의 농도 로 희석하여 검량선을 작성하였다.

O O OH

HO

HO OH

COO C

H

OH

O

O

albiflorin

O

O H O

O OH

HO

HO OH

COO

paeoniflorin

<Figure 1> Chemical structure of albiflorin and paeoniflorin

7. 기기 분석조건

작약의 지표성분 분석에 대한 조건은 <Table 1>과 같다.

Table 1. Conditions of HPLC analysis

Column C18 (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛, Optimapak, RS tech)

Flow rate 1.0 ㎖/min

Detector UV 230 nm

Injection Volume 20.0 uL Column Temp. Room temp.

Mobile Phase H2O(A), CH3CN(B)

Analytical condition 0min(90:10, A:B), 15-30min(10→20, B), 30.01-45min(20→35, B), 45.01-48min(35→50, B), 48.01-55min(50, B)

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 건조감량

건조감량 시험을 통하여 작약 가루에 함유되어 있는 수분 의 양을 측정하였다. 작약의 건조감량 시험법에 따라 3회 반복 실시한 결과는 <Table 2>와 같다. 모든 발효된 작약 은 발효하지 않은 control에 비하여 건조감량이 높게 나타났 으며, 발효하지 않은 control을 포함하여 모든 발효된 작약 시료에서 발효 후 수분 함량이 증가하는 결과를 나타내었다.

Sample Mean ± SD

Con 7.997 ± 0.03

SYT 54.643 ± 0.17

SDT 44.326 ± 0.03

SST 18.254 ± 0.09

SNT 21.861 ± 0.02

Con: control(P. lactiflora extract), SDT; P. lactiflora extract fermented with Paecilomyces japonica, SYT; P. lactiflora extract fermented with Ganoderma lucidum, SST; P. lactiflora extract fermented with honey, SNT; P. lactiflora extract fermented with Nuruk

Table 2. The results of Loss of Drying for P. lactiflora extract

according to fermentation (n=3) (unit : %)

2. 작약의 HPLC 분석

작약의 지표성분인 albiflorin의 검량선은 y = 12787x ― 11783 (r ² = 0.9996), paeoniflorin의 검량선은 y = 25343x + 43208 (r ² = 0.9998)로 매우 양호한 직선성을 나타내었다 (Figure 2).

y = 12787x - 11783 R

= 0.9996

0 100 200 300 400 500 600 700

0 10 20 30 40 50 60

천

Concentraion (mg/L)

P ea k a re a( m A U )

(A)

y = 25343x + 43208 R

= 0.9998

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

0 100 200 300 400 500 600

천

Concentration(mg/L)

P e a k a re a (m A U )

(B)

<Figure 2> Calibration curve of standard solution. A; Albiflorin calibration, B; Peaoniflorin calibration

HPLC chromatogram에서 retention time은 각각의 peak가 약 28.88, 31.92분대에서 검출되었으며 작약 control 추출물과 작약 발효 추출물에 대한 HPLC 그래프는

<Figure 3>에서와 같이 나타났다. Control과 작약 발효 추출물의 HPLC chromatogram에서 작약의 2가지 지표성 분이 비교적 잘 분리되었음을 알 수 있었으며 이들의 함량은

<Table 3>에 나타내었다.

작약 발효 추출물에 함유된 지표성분의 함량은 albiflorin 의 경우, 영지버섯과 누룩발효 추출물은 발효후 control에 비해 함량이 감소하는 것을 알 수 있었으며 동충하초와 꿀 발효추출물의 경우 albiflorin의 함량이 control 대비 각각 13.02, 3.37% 증가하는 것을 알 수 있었다. Paeoniflorin의 경우 지표성분의 함량은 모든 실험군에서 감소하는 것을 확 인 할 수 있었다. 영지버섯 발효추출물의 경우 albiflorin과

<Figure 3> HPLC chromatogram of albiflorin and paeoniflorin standard and P. lactiflora extract according to fermentation.

Standard; albiflorin, paeoniflorin, Con; control(P. lactiflora extract), SYT; P.

lactiflora extract fermented with Ganoderma lucidum, SDT; P. lactiflora extract fermented with Paecilomyces japonica, SST; P. lactiflora extract fermented with honey, SNT; P. lactiflora extract fermented with Nuruk

Maker substance Sample Content ± SD

Albiflorin

Con 0.090 ± 0.03

SYT 0.056 ± 0.01

SDT 0.102 ± 0.00

SST 0.093 ± 0.00

SNT 0.046 ± 0.00

Paeoniflorin

Con 4.506 ± 0.13

SYT 1.222 ± 0.03

SDT 2.599 ± 0.04

SST 2.750 ± 0.05

SNT 0.847 ± 0.00

Con; control(P. lactiflora extract), SYT; P. lactiflora extract fermented with Ganoderma lucidum, SDT; P. lactiflora extract fermented with Paecilomyces japonica, SST; P. lactiflora extract fermented with honey, SNT; P. lactiflora extract fermented with Nuruk

<Table 3> Content of albiflorin and peaoniflorin standard in P.

lactiflora extract according to fermentation (n=3) (unit : %)

paeoniflorin의 함량이 모두 감소하였고 그 이외의 peak도

전체적으로 감소하는 경향을 보였으며 새로운 peak도 검출

되지 않았다. 동충하초와 꿀 발효추출물의 경우 albiflorin

의 peak는 증가하고, paeoniflorin의 peak는 감소하는 경

향을 보이면서 9분대에서 새로운 peak가 검출됨을 알 수

있었다. 누룩발효 추출물의 경우 albiflorin과 paeoniflorin

의 peak가 모두 감소하면서 동시에 9분대에서 새로운 peak

가 크게 검출됨을 확인 할 수 있었다. 위의 결과를 살펴보면

영지버섯 발효추출물은 발효 후 지표성분 뿐만 아니라 전체

적으로 모든 peak가 감소되는 경향을 보였으며, 동충하초,

꿀, 및 누룩 발효추출물은 발효 후 지표성분의 일부가 9분

대에서 새로 검출된 물질로 전환된 것으로 생각되며 이 성

분에 대한 정확한 규명과 더불어 작약의 발효 전․후의 다

양한 효능 평가를 통한 비교분석이 이루어진다면 향후 발효

를 통한 생약의 신소재로의 활용가치가 높아질 것으로 사료 된다.

IV. 결 론

작약을 영지버섯, 동충하초 균사체, 꿀, 누룩을 이용하여 발효시킨 후 변화되는 지표성분 albiflorin과 paeoniflorin 의 함량을 분석하였다.

1. Albiflorin의 함량은 SYT, SNT 실험군에서 감소하 였으며 SDT, SST 실험군에서 증가하였다.

2. Paeoniflorin의 함량은 모든 실험군에서 control 보다 감소하였다.

3. SDT, SST, SNT 크로마토그램에서 9분대에 새로운 peak가 검출되었다.

이상의 결과로 작약의 발효와 지표성분 albiflorin과 paeoniflorin의 함량증가와는 정비례하지 않는 것으로 사 료되며, 또한 발효 후의 보다 정확한 지표성분 변화 매커니 즘 규명을 위해서는 지표성분이 발효에 따라 전환, 생성되 는 새로운 물질의 동정과 함께 발효 전․후에 따른 다양한 효능연구가 병행되어야 할 것으로 사료된다.

Ⅴ. 감사의 글

본 연구는 2009년 한국한의학연구원 연구지원(P09020) 에 의해 수행되었으며 이에 감사드린다.

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