LC/MS/MS Method for the Determination of Lidocaine in Hairless Rat Plasma and Pharmacokinetic Applications of Lidocaine Patch

LC/MS/MS를 이용한 혈장 중 리도카인의 정량 및 리도카인 패치제의 약물동태학적 평가

황지연·김철준*·신영희^# 경성대학교 약학대학, *(주)티디에스팜

(Received May 8, 2012; Revised June 9, 2012; Accepted June 16, 2012)

LC/MS/MS Method for the Determination of Lidocaine in Hairless Rat Plasma and Pharmacokinetic Applications of Lidocaine Patch

Ji-yeon Hwang, Chul-Jun Kim* and Young-hee Shin^# College of Pharmacy, Kyungsung University, Busan 608-736, Korea

*TDS Pharm. Co. Ltd., Seoul 152-050, Korea

Abstract — Lidocaine has been studied for many chronic pain conditions, including postherpetic neuralgia (PHN) and recently it has also been increasingly used in transdermal drug delivery systems. In this study, pharmacokinetics of a lidocaine patch was studied in four hairless male rats. The plasma concentration was determined by a validated LC/MS/MS method after applying a 3×2 cm² (30 mg) patch for 12 hours. From the plasma lidocaine concentration vs time curves, AUC_0-20h, Cmax, and Tmax of lidocaine patch were 2,926.32±335.28 ng · h/ml, 256.86±29.63 ng/ml, and 6.00±2.31 h, respectively.

Keywords □ LC/MS/MS assay, lidocaine patch, pharmacokinetics, hairless rat

리도카인[2-(diethylamino)-N-(2,6-dimethylphenyl)acetamide]

은 최초의 amino amide계 국소마취제로서 1943년 스웨덴의 화 학자 Nils Lfgren에 의해 xylocaine이라는 이름으로 처음 합성되 었으며¹⁾국소 마취 및 부정맥 치료에 사용되고 있다. 일반적으 로 가장 많이 사용되고 있는 국소 마취제의 일종으로 수술 후 급 성 통증 완화에 정맥 주사요법으로 사람과 동물에서 40여 년 전 부터 사용되었다.²⁾정맥주사, 근육주사, 국소적용 등 여러 가지 경로를 통해 대상포진 후 신경통증을 비롯한 많은 만성통증 치 료를 위해 연구되어왔으며, 최근에는 경피 약물 전달시스템에 많 이 응용되고 있다.³⁾

리도카인 패치는 말초 진통효과를 목적으로 개발되었으며, 말 초 신경통증 완화에 사용되고 있다. 패치제제는 피부를 통해 리 도카인이 투과되는 것을 용이하게 하고, 피부를 통과한 리도카 인은 활동항진 상태 혹은 손상된 외상수용기에 비정상적으로 과 발현된 sodium channel과 결합한다. Sodium channel과 결합한 리도카인은 손상 되거나 기능 장애가 있는 말초신경으로부터 생

성된 비정상적인 이소성 방전을 감소시켜 통증을 완화시키는 작 용을 한다.⁴⁾

리도카인 패치는 약물 상호작용과 전신 부작용의 위험이 적어 안전하며 내약성이 좋아 대다수의 환자에게 약물 순응도와 만족 도가 높게 나타나고 있다.^5,6) Galer 등의⁵⁾연구에 따르면 리도카 인 패치를 사용하였을 경우 전신작용을 나타내는 최소한의 혈중 농도로 통증 조절에 효과를 나타내었는데 이는 심부정맥 치료에 사용되는 리도카인 용량의 약 1/10(130 ng/ml)에 해당하는 용량 이다.^4,7,8)

리도카인 패치는 최근 대상포진 후 신경통증에 적응증이 인정 되어 1차 치료제로 사용되고 있다. 대상포진 후 신경통증은 대 상포진 발병 후 가장 흔하게 나타나는 신경계통의 질환으로 작 열감 혹은 발작성 통증, 극심한 피부감수성, 비정상적인 통증인 식, 감각상실, 이질통증및 통각과민을 유발하며 이로 인해 환자 의 삶의 질을 현저하게 저하시키게 된다.^7,9,10)대상포진은 수두 를 일으키는 바이러스와 동일한 바이러스에 의해 발병하게 되는 데, 인체에 침입한 바이러스가 잠복기를 거친 후 신경을 따라 피 부로 이동해 수포를 발생하게 한다.¹¹⁾대상포진 발병환자의 약 20% 정도가 대상포진 후 신경통증으로 발전하게 되며, 나이는 대상포진 후 신경통증 발병의 중요한 위험 요소 중의 하나로 50

#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 051-663-4886 (팩스) 051-663-4809 (E-mail) [email protected]

종설

대 이상에서 50%, 80대 이상에서 80%의 환자가 대상포진 발병 후 대상포진 후 신경통증을 경험하게 된다.¹²⁾

Katz 등의¹³⁾연구에 따르면 대상포진 후 신경통증 환자에 리 도카인 패치를 하루에 12시간 동안 최대 3장까지 28일간 적용하 였을 경우 7일 이내에 66%의 환자가 통증 완화의 효과를 보였 고, 74%의 환자가 삶의 질이 개선되었다고 하였다. 또한 Devers 등의¹⁴⁾연구에서 리도카인 패치는 대상포진 후 신경통증 뿐만 아 니라 다양한 종류의 신경통증에서도 임상적으로 의미있는 효과 를 나타내는 것으로 보고되었다.

본 연구에서는 리도카인의 혈중 농도 변화 측정을 위한 분석 방법을 확립하고, 확립한 분석 조건을 검증하여 무모 흰쥐에서 리도카인 패치의 혈중 농도 변화를 측정하여 약물 동력학적 파 라미타를 구하고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물

실험동물로서는 무모 흰쥐(180∼230 g, male, Charles River Lab., U.S.A.)을 구입한 즉시 실험에 사용하였다.

시약 및 기구

리도카인 패치(제조번호 10001)는 (주)티디에스팜(서울, 한국) 에서 제공받아 사용하였다. 리도카인 표준물질은 Sigma Chem.

Co.(St Louis, Mo, U.S.A.)에서 구입하였으며, 내부표준물질로 사 용한 트리메타지딘은 Boehringer Ingelheim Korea Ltd.에서 기 증 받아 사용하였다. HPLC용 acetonitrile, methanol 및 methyl-

t-buthyl ether는 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하였으 며, 그 외 시약은 특급시약을 사용하였다. 분석기기는 Agilent Triple Quard LC/MS/MS System을 사용하였다.

LC/MS/MS 분석 조건 및 분석법 검증

LC/MS/MS 분석 조건 − 혈장중의 리도카인의 함량을 분석하 기 위하여¹⁵⁾다음의 조건으로 LC/MS/MS로 분석하였으며, 본 분 석에 사용한 mass 범위는 m/z 100~700이었다. 이동상으로는 acetonitrile : 10 mM ammonium acetate=80 : 20(v/v %)을 사용 하였으며, 유속은 0.25 ml/min, 칼럼은 Capcellpak C18 MG (Shiseido Japan, 2.0×150 mm)를 사용하였다.

분석법 검증 − 분석조건에서 설정된 분석방법에 대한 검증을 국립독성연구원 생체시료분석법 validation에 의하여 특이성, 직 선성, 정밀성, 정확성, 장기 및 냉해동 안정성을 평가하였다.

특이성 − 혈장 중 리도카인을 분석하기 위하여 turbo ion spray ionization과 triple-quadrupole LC/MS/MS를 이용하여 분석하였 다. 리도카인은 분자량이 234로 positive ion mode에서 molecular ion m/z 235가 검출되었으며, LC/MS/MS product ion spectrum에서는 m/z 86이 주요 fragment ion으로 검출되었 다. 내부표준물질로 사용한 트리메타지딘은 분자량이 266으로 positive ion mode에서 molecular ion m/z 267이 검출되었으며, LC/MS/MS product ion spectrum에서는 m/z 181이 주요 fragment ion으로 검출되었다. 따라서 peak 검출은 MRM mode 로, 리도카인의 molecular ion m/z 235/86을, 그리고 내부표준물 질은 molecular ion m/z 267/181을 monitoring하였다(Fig. 1).

상기 LC/MS/MS 조건에서의 리도카인과 내부표준물질은 각각의

Fig. 1− Typical LC/MS/MS spectra of lidocaine (A) and trimetazidine (internal standard) (B).

머무름 시간 2.2분과 1.5분 부근에서 검출되었고, 위의 검출조건 에서 타 물질에 의한 방해 peak는 전혀 나타나지 않았으며, 우 수한 selectivity를 나타내었다(Fig. 2).

검량선 작성 및 직선성 − 리도카인 표준품과 내부표준물질인 트리메타지딘을 각각 메탄올에 녹여 농도를 1 mg/ml로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 blank 혈장으로 희 석하여 리도카인의 혈장 중 농도가 각각 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/ml 농도가 되도록 혈장시료를 조제하고 내부표준용액은 용매로 희석하여 최종농도가 5 µg/ml로 조제하였다. 각각의 표준

혈장 100 µl에 내부표준용액(트리메타지딘 5 µg/ml) 50 µl를 가하 고 5 N NaOH 50 µl를 넣었다. 여기에 1.2 ml의 methyl-t-buthyl ether을 가한 후 10분 동안 vortexing하여 12,000 rpm에서 10분 간 원심 분리하였다. 유기용매층을 1 ml 취한 뒤 speed-vac에서 증발 건조 시킨 다음, 최종적으로 잔사에 10 mM ammonium acetate : acetonitrile(50 : 50) 100µl로 재용해하여 그 중 10 µl를 LC/MS/MS에 주입하였다.¹⁶⁾여기에서 얻은 내부표준물질의 피 크 넓이 비에 대한 리도카인의 피크 넓이 비로 검량선을 작성하 고 직선성을 검증하였다. 재현성을 구하기 위해 하루에 실험을 Fig. 2− Typical LC/MS/MS chromatogram of lidocaine in rat serum. (A) Chromatogram of blank serum spiked with lidocaine and trimetazidine

(Internal standard). (B) Typical chromatogram of drug-free rat serum.

5번 시행하여 일내 재현성을 구하고 연속하여 5일간 실험을 행 하여 일간 재현성을 구하였다.

시료의 전처리 − 무모 흰쥐로부터 각 시간별로 채취하여 -70^oC 에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 1분간 진탕 한 다음 이 혈장 100 µl를 취하여 시험관에 옮기고 여기에 내부 표준용액(트리메타지딘 5 µg/ml) 50 µl를 가한 후 검량선 작성 방 법과 동일한 방법으로 전 처리하여 LC/MS/MS에 주입하였다.

정밀성 및 정확성 − 검량선 작성 시와 동일한 농도를 작성하여 5일간 연속 실험하였으며, 일내 5회 연속 실험하여 얻어진 크로 마토그램으로부터 리도카인과 내부표준물질의 피크면적 비를 구 하였다.

이로부터 일간 및 일내 정밀성 및 정확성을 평가하였으며, 변 동계수는 최저정량한계농도에서는 ±20% 이내, 나머지 농도에서 는 ±15% 이내의 값을 나타내어야 한다.

안정성 실험

장기 안정성 실험 − 혈장 중 리도카인을 저농도(20 ng/ml), 고 농도(200 ng/ml)가 되도록 각각 6개씩 조제하고 동결하여 4주간 보존 후 분석하였다.

냉해동 안정성 실험 − 혈장 중 리도카인을 저농도(20 ng/ml), 고농도(200 ng/ml)의 검체를 준비한 뒤 분석하여 초기값으로 하 였다. 검체를 24시간 -70^oC에서 냉동한 후 실온에서 보조기구 없 이 해동하였다. 완전히 녹았으면, 전처리하여 LC/MS/MS용 검액 을 조제, 분석(1 cycle)하였다. 이와같은 과정을 2회 더 반복하여 2, 3 cycle 시의 각각의 잔존율을 측정하였다(n=3).

In vivo 경피흡수시험

무모 흰쥐(180∼230 g, male)을 ether로 마취시킨 후 패치 부 착전(0 hr)에 심장에서 혈액 0.3 ml를 채취하였다. 복부에 리도카 인 패치(3×2 cm², 리도카인 30 mg 상당량)을¹⁷⁾부착시킨 후 의 료용 종이 테이프로 움직이지 않도록 고정시켰다. 패치 부착 후 2, 4, 6, 8, 10, 12 hr 후에 혈액 0.3 ml를 동일한 방법으로 채취 하였다. 12 hr 경과 후 패치를 제거하고 계속하여 13, 14, 16, 18, 20 hr에 혈액 0.3 ml씩 채취 하였다. 각 시간별로 채취한 혈액은 원심분리하여 얻은 혈장을 분석시까지 -70^oC에서 냉동 보관하 였다.¹⁶⁾

혈장중 리도카인의 농도변화

무모 흰쥐로부터 일정 간격별로 채취하여 -70^oC에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 1분간 진탕한 다음 이 혈 장 100 µl를 취하여 시험관에 옮기고 여기에 내부표준용액(트리 메타지딘 5 µg/ml) 50 µl를 가한 후 검량선 작성 방법과 동일한 방법으로 전 처리한 후 LC/MS/MS에 주입하였다.

무모 흰쥐의 혈장 시료를 분석하여 얻어진 크로마토그램으로

부터 리도카인과 트리메타지딘의 피크면적 비를 구하여 미리 작 성한 검량선으로부터 혈장 중 리도카인의 농도를 구하였다.

약물동태학적 파라미타 산출

리도카인 패치를 무모 흰쥐에 부착시킨 후 얻은 혈장과 패치 제거 후 얻은 혈장중 약물농도-시간 곡선으로부터 최고혈장중농 도(Cmax)와 최고혈장중농도 도달시간(Tmax), 혈장중약물농도- 시간곡선하 면적(AUC), 소실속도정수(Ke), 및 소실반감기(t_1/2)는 식품의약품안전청이 제공한 K-BE test를 이용하여 산출하였다.¹⁸⁾ 모든 측정치는 평균±표준편차로 나타내었다.

실험결과 및 고찰

분석법 Validation

특이성의 검증 − 시험방법과 같이 검체를 처리하여 LC/MS/MS 로 분석하였을 때 얻어진 크로마토그램은 Fig. 2과 같았으며, 리 도카인의 피크의 유지시간은 약 2.2분, 내부표준물질 피크의 유 지시간은 약 1.5분으로 크로마토그램 상에서 나타난 바와 같이 신호 대 잡음 비(S/N ratio)를 10 이상으로 한 분석조건에서 리 도카인과 내부표준물질은 기타 혈장 성분들과 잘 분리되었다.

검량선 작성 및 직선성 − 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인 농도 범위를 포함하는 10~500 ng/ml에서 양호한 직선성을 나타내었 다. 이로부터 검량선 최소 농도인 10 ng/ml를 정량한계농도 (lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 리도카인 농도를 정 량 하였다. 본 실험에 사용한 검량선은 y=0.001106x+0.006367 (r²=0.983, 가중치 1/x²)(n=9)이었다(y: peak area ratio, x:

lidocaine concentration).

정밀성 및 정확성의 검증 − 10(정량한계 농도), 20, 50, 100, 200, 500 ng/ml 6단계 농도의 리도카인 혈장 표준액을 상기의 검 체처리방법으로 처리하여 분석한 결과는 Table I에 나타내었다.

정밀성은 리도카인의 피크면적 비의 표준편차를 피크면적 비의 평균값의 백분율(%)로서 구하였다. 본 분석방법의 정밀성 CV%

는 일내 정밀성, 일간 정밀성 모두 ±15% 이내였다. 또한 일내 정확성, 일간 정확성 모두 전 농도 범위에서 ±15% 이내이었으

Table I− Intra-day and inter-day precision and accuracy data for the LC/MS/MS analysis of lidocaine in hairless rat plasma

농도(ng/ml)

정밀성(CV%) 정확성 (Mean±S.D.) (n=5)일내 일간

(n=5) 일내

(n=5) 일간

(n=5) 10(정량한계농도) 3.98 11.83 093.04±3.70 097.99±11.61

020 2.93 04.77 103.68±3.03 105.02±5.03 050 0.72 07.58 0104.9±0.78 112.26±8.51 100 1.81 08.88 101.76±1.86 108.95±9.67 200 0.89 08.29 093.24±0.85 100.59±8.32 500 0.84 10.68 084.88±0.70 089.92±9.60

며, 최저정량한계농도는 10 ng/ml이었다.

이로부터 혈장 중 리도카인에 대한 상기의 LC/MS/MS 분석법 은 본 실험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확 성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.

안정성 실험 결과

장기 안정성 실험 결과 − 혈장 중 리도카인 저농도(20 ng/ml) 와 고농도(200 ng/ml)의 장기 안정성 시험 결과는 잔존율 89.57~

98.62%에 해당하여 안정한 것으로 사료되었다(Table II).

냉해동 안정성 실험 결과 − 혈장 중 리도카인 저농도(20 ng/ml) 와 고농도(200 ng/ml)의 검체의 분석 결과는 초기검체의 97.27~

108.77%에 해당하여 안정한 것으로 사료되었다(Table II).

In vivo 경피흡수시험

혈장 중 리도카인의 농도변화 − 상기에서 확립된 LC/MS/MS 분석 조건으로 무모 흰쥐의 혈장을 분석하여 얻어진 피크 면적 비를 검량선에 대입하여 계산함으로, 무모 흰쥐의 혈장 중 리도 카인의 농도 추이를 알 수 있었다. 12시간 리도카인 패치(리도카 인 30 mg)를 적용하였으며, 12시간째에 패치를 제거한 후 계속 하여 8시간 동안 즉, 총 20시간 동안 혈장 중 약물의 농도 변화 를 측정하였다. Fig. 3는 혈장 중 리도카인의 농도를 시간에 따 라 나타낸 것이다.

약물동태학적 파라미타 산출 − 무모 흰쥐의 혈장 중 리도카인 농도 분석 결과를 식약청에서 제공한 K-BE test로 분석하였다.

리도카인 패치를 12시간 적용 한 다음 패치를 제거한 후 계속하 여 8시간 동안 측정한 결과 즉, 0∼20시간의 약물동력학적 파라 미타 AUC_0-20h는 2,926.32±335.28 ng · h/ml, Cmax는 256.86±

29.63 ng/ml, Tmax는 6.00±2.31 h였다(Table III). 리도카인 patch 제거 후 즉 12시간 이후 소실에 관한 약물 동력학적 파라 미타 AUC_12-20h는 506.25±81.30 ng · h/ml, t_1/2 1.48±0.19 h, Ke 는 0.47±0.05 h^-1였다(Table IV). Weiland 등은¹⁶⁾실험동물에 처 음으로 리도카인 패치를 적용, 즉 비글 견에 12시간 패치를 적 용하여 약물동태학적 파라미타를 보고하였으며, 제모 방법에 따 라 비글 견의 Ke는 0.22±0.044 h^-1, 또는 0.27±0.048 h^-1, 그리 고 t_1/2 3.23±0.699 h, 또는 2.61±0.492 h였다. 또한 Ko 등에¹⁹⁾ 의하면 고양이에게 72시간 패치를 적용한 후 t_1/2 3.7±1.7 h으로 보고하였으며, 본 실험에 이용한 무모 흰쥐는 비글 견 및 고양이 보다 빠른 배설속도를 나타냄을 알 수 있었다. Tmax 는 비글 견 에서는 10.67 h, 또는 9.27 h였으나 무모 흰쥐에서는 6 h이었으며, 본 실험결과에 의하면 비글 견 또는 고양이보다 무모 흰쥐에서 빠른 피부 흡수 및 빠른 배설을 나타내는 것으로 해석되었다.

결 론

본 연구에서는 리도카인 패치를 무모 흰쥐에 적용한 후 리도 카인의 혈중 농도 변화 측정을 위한 분석 방법을 확립하고, 확립 한 분석 조건을 검증하였다. 확립한 분석 조건을 이용하여 혈중 농도 변화를 측정해 약물 동력학적 파라미타를 산출하였다.

분석법 validation 결과 혈장 중 리도카인에 대한 LC/MS/MS 분석법은 본 실험에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선 성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있었다. 혈장 중 리도카인의 장기 안정성 시험 결과 및 냉해동 안정성 시험 결과도 안정한 것으로 사료되었다. 검량선은 y=0.001106x+0.006367(r²=0.983, 가중 치 1/x²)이며, 10~500 ng/ml에서 양호한 직선성을 나타내었다.

Table II− Stability data for lidocaine (n=3 per test and each concentration)

Theoretical concentration (ng/ml) 20.0 200.0 Long-term stability

4 Weeks, -70^oC (%) 89.57±2.26 92.75±1.14 Freeze/thaw stability

1 Cycle (%) 101.46±2.15 100.47±0.35

2 Cycles (%) 101.82±2.61 100.40±0.74 3 Cycles (%) 097.27±4.05 108.77±8.60

Fig. 3− Lidocaine plasma concentrations-time profile after application of a lidocaine patch on hairless rat skin for 12 hours. Data points were expressed as the mean±S.D. (n=4).

Table III− Pharmacokinetic parameters of lidocaine following the application of 30 mg of lidocaine patch for 12 h to 4 hairless rats (0∼ 20 h).

Mean±S.D.

AUC_0-20 (ng · h/ml) 2926.32±335.28 C_max (ng/ml) 256.86±29.63

T_max (h) 06.00±2.31

Table IV− Pharmacokinetic parameters of lidocaine following the application of 30 mg of lidocaine patch for 12 h to 4 hairless rats (12~20 h)

Mean±S.D.

AUC_12-20 (ng · h/ml) 506.25±81.30

t_1/2 (h) 01.48±0.19

K_e (h^-1) 00.47±0.05

이로부터 검량선 최소 농도인 10 ng/ml를 정량한계농도(lower limit of quantification, LLOQ)로 설정하여 리도카인 농도를 정 량 하였다.

리도카인 패치를 무모 흰쥐에 12시간까지 부착하고 20시간까 지 혈중약물거동을 검토하고 약물동태학적 파라미타를 구한 결 과 AUC_0-20h는 2,926.32±335.28 ng · h/ml, Cmax는 256.86±

29.63 ng/ml, Tmax는 6.00±2.31 h였다. 또 리도카인 패치를 제 거 한 다음 소실에 관한 약물동태학적 파라미타 AUC_12-20h는 506.25±81.30 ng · h/ml, t_1/2 1.48±0.19 h, Ke는 0.47±0.05 h^-1 이었다.

감사의 말씀

본 연구는 중소기업청의 중소기업기술혁신개발사업 전략과제 (과제번호 S1070140)의 지원으로 수행되었다.

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