바위꽃탱자나무지의류 추출물의 항산화 활성 및 염모제 소재 탐색
문 승 재†
†전남도립대학교 뷰티아트과
Screening of Antioxidant Activity and Hair-dye Material from Ramalina yasudae Rasanen Extracts
Seung-Jae Moon
††Department of Beauty Art, Jeonnam State University, Damyang, Korea (Received : Oct. 31, 2020, Revised : Nov. 23, 2020, Accepted : Dec. 21, 2020)
Abstract : Lichen refers to a group of organisms in which two organisms, an alga and a fungus, live together as a single organism. Algae photosynthesize and supply sugars to fungi, and fungi provide a place to live and inorganic nutrients for the algae. In this study, antioxidant activity, polyphenol content, and flavonoid content were investigated to determine the possibility of using extracts of Ramalina yasudae Rasanen as a hair cosmetic material. DPPH and ABTS radical antioxidant assays were performed and the results showed a range of 50-500 μ g/mL (IC50). In the ABTS assay results for R. yasudae the IC50 values were confirmed to be 399 μg/mL for the water extract, 371 μg/mL for the methanol extract, and 250 μg/mL for the alkali extract. In an MTT assay, the R. yasudae alkali extract showed no cytotoxicity up to a concentration of 500 μg/mL. Accordingly, the R. yasudae extracts have the potential to be useful material for cosmetics and edible food.
Keywords: Lichen, antioxidative activity, color-difference meter, Cosmetic material.
1. 서 론1)
지의류는 조류와 균류의 공생체로 형태적으로는 두 생물과 전혀 다른 행태를 나타내며, 바위, 토양, 수피 등에 자생하고 있다[1]. 세계적으로는 약 23,000 종 이상 있는 것으로 보고되고 있으며, 우리나라에는 약 200종이 분포하고 있는 것으로 알려져 있다[2-4].
지의류는 대기 오염에 민감하여 환경 지표 생물로 알 려져 있으며, 지의류에 존재하는 균류의 신진대사물이 다양하여 여러 가지 작용을 하는 것으로 알려져 있다 [5-7]. 이러한 지의류는 의약품, 향료, 염료 등 다양 하게 이용되고 있다[8-10].
지의류에서 추출된 추출액을 사용하여 염색을 하는
†Corresponding Author 성명 : 문 승 재
소속 : 전남도립대학교 뷰티아트과
주소 : 전라남도 담양군 담양읍 죽녹원로 152 전화 ; 061-380-8567
E-mail : [email protected]
것을 고대 그리스 시대부터 사용되어 왔다[11,12].
지의류에서 추출된 추출액은 지의류에 함유된 여러 성분들 중 화학적으로 변화하여 색을 발색시키거나 불용성인 성분이 수용성으로 변화되어 물이나 용매에 용해되어 염색물질과 결합하여 염색되는 것으로 알려 져 있다[1]. 지의류 및 다른 식물염료들은 합성염료에 밀려 거의 이용되고 있지 않지만 최근 천연 추출물 및 천연 화장품에 관심이 급증하면서 천연 추출물을 함유한 천염 염모제에 대한 요구가 증가하고 있다[13-16].
국내에 자생하는 지의류는 노란매화나무지의(Flavop armelia caperata (L.) Hale), 흰배면그리마지의(Het erodermia hypoleuca (Muhl.) Trevis.), 너덜너덜노 란속매화나무지의(Myelochroa entotheiochroa (Hue) Elix & Hale), 담색국화잎지의(Xanthoparmelia mex icana (Gyeln.) Hale), 바위꽃탱자나무지의(Ramalina yasudae Rasanen) 등이 있는 것으로 알려져 있다.
이중 바위꽃탱자나무지의는 평지 또는 산지 바위에 생장하는 수지상지의체이다. 백두대간, 남해와 서해 일대에 자생하며 관목처럼 총생하고 직립생장을 한다.
바위꽃탱자나무지의가 섬유 염색하는 천연 염료로써의 연구가 진행되어 있으나 염모제 및 화장품 소재로서의
연구는 미미한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 바위꽃탱자나무지의 항산화 활 성과 염모제로서의 효과를 확인하고 염료제 이외의 천연 매염제 소재로써의 가능성에 대해서 알아보고자 하였다.
2. 실험방법
2.1. 실험재료
본 실험에 사용한 지의류는 채취하여 수세 후 세절 하고 건조하였다. 건조한 지의류 20 g을 증류수 200 mL에 침지한 뒤 auto clave 121℃, 90분 동안 추출 하였고, 지의류 20 g을 100% MeOH 200 mL에 7일 동안 25℃ 실온 추출로 진행하였다. 지의류 20 g을 암모니아수 200 mL (1:3 v/v)에 침지하여 추출하였다 [17]. 추출된 추출물들은 필터 후 감압 농축하였고 암모니아수 추출물은 1N HCl을 사용하여 pH 7.00 으로 중화한 뒤 농축하여 활성 분석 실험을 진행하였다.
3가지 방법으로 추출된 지의류 추출물은 열수 추출물 은 RYW, 유기용매 추출물은 RYM, 알칼리추출물은 RYA로 명명하였다.
Figure 1. Morphology of Ramalina yasudae Rasanen used in this experiment.
2.2. 항산화 활성 분석
2.2.1 DPPH radical scavenging activity
0.25 mM DPPH를 100% MeOH에 용해하여 DPPH solution을 제조하였다. DPPH solution 800 μL에 시료 200 μL를 가하여 15 분동안 암실에서 반 응한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다[18]. 양 성대조군로 gallic acid를 사용하였고, 실험농도의 범 위는 100-2,500 μg/mL로 항산화 활성은 아래 식으 로 계산하였다.
2.2.2 ABTS radical scavenging activity
증류수에 7 mM의 ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 용해한 후 1:1로 혼합하여 18시간 동안
암소에 방치하여 radical stock 용액을 제조하였다[1 9], 이 용액을 PBS (pH 7.4)로 흡광값이 1.00±0.02이 되도록 희석하였다. Radical 용액 1,000 μL에 시료 200 μL를 가하여 15분 동안 방치 후 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 gallic acid를 사용하였고, 지의류 추출물은 100-2000 μg/mL 농도 로, 계산식은 아래와 같다.
2.3. 세포배양
대식세포인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 10% fetal bovine serum (FB S)와 1% 항생제가 포함된 Dulbecco’s modified eag le’s medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% C O2 조건에서 배양하였다.
2.4. 세포독성평가
세포 생존율은 MTT assay 방법을 사용하였다.
세표를 well 당 1 × 105 농도가 되도록 12 well pl ate에 분주하고 24시간 동안 배양하여 안정화시킨 후 추출물을 25-500 μg/mL 농도로 처리하였다. Vistica의 방법[20]에 따라 0.2 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazo l-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액을 well당 500 L씩 넣어 1시간 동안 배양기에 방치하였다. 이후 상등액을 제거하고 DMSO를 well당 300 L씩 가하고 formazan을 완전히 용해시켜 ELIS A Bio-Tek (Winooski, VT, USA)을 사용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다[20].
2.5. NO assay
세포를 well 당 1 × 105이 되도록 12 well plate에 분주 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 안정화 시켰다[21]. 안정화시킨 세포에 LPS 1 μg/mL 와 시료 100-500 μg/mL로 처리하고 16시간 동안 배양한다.
배양된 상층액 100 L와 Griess 시약 100 L를 섞어 흡광도 540 nm에서 측정하였다.
2.6. 모발 표면색 변화 측정 2.6.1. 매염제에 따른 모발 염색
모발염색은 AlK(SO)2, MnSO4 2종류의 매염제를 사용하여 동시매염(Simultaneous mordanting) 방법 으로 실험하였다. 미리 온도를 유지시킨 인큐베이터 에서 염색을 실시한 후 수세한 다음 건조하였다[22].
염액을 1 g의 모발에 처리농도 100%, 처리온도 40℃, 처리시간은 40분으로 처리한 후 염색성을 측정하였다.
2.6.2. 염색성 및 색차 측정
추출염색을 이용한 염색 조건별 염색모발의 염색성 측정은 색차계(Color Meter TES 135A, Taiwan)를 사용하여 각 모발시료에 대한 CIE LAB 표색계의 L*, a*, b* 값을 측정하였다. Munsell의 삼속성인 색상
(H), 명도(V), 채도(C) 값도 측정하였다[22]. CIE LAB 표색계에서 L*는 색의 밝기인 명도지수(lightness)를 나타낸다, ±a*와 ±b*는 색상을 표현하며, 각 색상 방 향의 색을 나타낸다(+a*: 적색(redness), -a*: 녹색 (green), +b*: 황색(yellowness), -b*: 청색 (blue))[23].
2.7. 통계처리
모든 실험 결과 값은 세 번 반복 진행 후 통계처리 하였으며, 실험에서 얻어진 값은 평균으로 나타내었다.
통계학적 유의성 검증은 SPSS 24 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 t-Test를 실시하였고, p<0.05 이하 일때 유의하다고 판정하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 항산화 활성 분석 결과
바위꽃탱자나무지의를 3가지 방법(hot water, 100%
Methanol, 100% Alkali)으로 추출하였다. 추출된 추출물들의 DPPH radical scavenging 실험결과 활성이 가장 높은 추출물은 RYA이었으며, 활성이 가장 낮게 측정된 추출물은 RYW이었다. 각 추출물의 DPP H IC50 범위는 1417.90-1739.45 μg/mL으로 확인 되었다(Table 1, Fig. 2).
Figure 2. DPPH radical scavenging activity from Ramalina yasudae Rasanenextracts.
ABTS radical scavenging 실험결과 RYA의 항산 화 활성이 가장 높게 확인되었다(Table 1, Fig. 3). I C50 범위는 250.56-399.60 μg/mL으로 확인되었다.
ABTS 활성은 DPPH 활성에 비해서 약 4배 높게 측 정되었다. 그리고 양성대조군인 gallic acid보다는 낮 은 항산화 활성으로 확인되었다.
Figure 3. ABTS radical scavenging activity from Ramalina yasudae Rasanen extracts.
기존의 연구에서 담색국화잎지의를 다양한 용매로 추출하여 진행하였는데 알칼리 추출물의 항산화 활성 이 가장 높다고 보고하였다[17]. 또한 북극 이끼종 으로 알려져 있는 Cladonia sp, Sterocaulon sp, U mbilicaria sp. Cetraria sp을 다양한 용매로 추출한 기존의 연구에서는 메탄올 추출물의 항산화 활성이 높다고 보고되었다[24]. 본 실험결과 alkali 추출방법 으로 지의류는 추출하였을 때 항산화 활성이 가장 높 게 확인되었다. 이는 추출이 진행될 때 리그닌 같은 폴 리페놀류 단량체가 다량으로 추출되어 항산화능이 높 은 것으로 알려져있다[16]. 또한 지의류의 생장 장소, 종류, 채취 시기, 추출방법, 추출용매의 종류에 따라 항산화 활성을 나타내는 성분들의 종류와 함량이 달라 질 것으로 판단된다.
Table 1. Antioxidant activity results a of RYW, RYM and RYA
Sample DPPH IC50(μg/mL) ABTS IC50(μg/mL) RYW 1739.45 ± 68.09 399.60 ± 2.66 RYM 1588.64 ± 70.70 371.48 ± 14.18 RYA 1417.90 ± 74.79 250.56 ± 2.51 Gallic acid 85.63 ± 6.91 19.69 ± 2.56
3.2. 세포 독성 실험 결과
RYA의 세포 독성을 측정하기 위하여 시료를 25-50 0 μg/mL 농도 범위에서 세포 독성을 측정하였다. 24 시간 이후 세포독성이 확인되지 않았다(Fig. 5). 기존 의 연구에서는 알칼리 용매에서 추출한 담색국화잎지 의류의 세포독성을 확인하였는데 250 μg/mL 이하의 농도에서 확인되었으며, 본 실험결과와 유사한 수준의 실험 결과로 확인되었다[25].
Figure 5. Results of MTT assay from Ramalina yasudae Rasanen alkali extracts.
3.3. NO assay 결과
RAW 264.7 대식세포에 RYA 100-500 μg/mL를 처리한 후 염증 매개 물질인 lipopolysaccharide (LPS) 1 μg/mL를 처리하여 NO의 생성 저해능을 확인하였다 (Fig. 5). 실험결과 LPS 처리군과 RYA + LPS 처리군 을 비교하여 NO 생성이 감소된 것으로 확인되었다.
RYA 500 μg/mL + LPS 1 μg/mL 처리군의 NO 저해능은 LPS 1 μg/mL 처리군에 비해 50% 이상 저해하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 기존의 천연 추출물들의 NO 억제능과 유사한 결과로 바위꽃 탱자나무지의 알칼리 추출물이 NO 억제 활성이 높다 는 것을 나타낸다. 추후 효소를 이용한 추출방법이나 steam explosion을 이용한 추출 등의 추출방법을 변경하여 기존의 연구와 비교해 볼 필요가 있는 것으로 판단된다.
Table 2. Color difference value of lichen extract according to mordant type
Hair type Chromaticity L* a* b* dyed
Artificial white hair
Before dyeing hair 86.61 -1.462 10.69
RYA 65.39 3.369 12.36
MnSO₄ 62.21 5.158 16.29
Human hair
Before dyeing hair 64.68 0.007 15.76
RYA 56.81 6.803 18.84
MnSO₄ 45.15 11.98 19.65
L*, lightness (0 100); a*, CIE Lab-redness (±a); b*, CIE Lab-yellowness (±b)
Figure 5. Results of NO assay from Ramalina yasudae Rasanen alkali extracts.
3.4. 모발 표면색 측정 결과
탈색된 인조 백모와 인모에 바위꽃탱자나무지의 알칼리 추출물처리 전, 후, 일반적으로 사용되는 매염제 성분인 MnSO₄ 처리 후의 모발의 표면색을 측정하였다.
색차계 실험결과 결과 바위꽃탱자나무지의류 알칼리 추출물은 인조 백모 및 인모 모두 염색성이 매우 뛰어 났으며, 매염제의 종류와 처리 시간에 따라 염색성이 다르게 나타나는 것을 확인하였다. 기존의 연구에서도 매염제 처리시 Al 매염의 색차가 높게 났다[22,23].
바위꽃탱자나무지의 알칼리 추출물의 색차 결과와 동일한 것으로 알카리 처리를 통한 추출물에 대한 염료의 다양성이 확보된 것으로 판단된다.
4. 결론
본 실험에서는 바위꽃탱자나무지의를 3가지 방법 (water, 100% methanol, 100% alkali)으로 추출하 고 추출된 추출물의 항산화 활성, NO 생정 저해능 및 염색 효과를 측정하였다. 추출물의 독성평가를 통해 화 장품 원료써의 사용 가능성에 대해 확인하였다. 추출방 법 중 alkali 처리로 추출된 추출물의 항산화 활성이 가장 높게 확인되었다. DPPH, ABTS 실험 모두 양성 대조군인 gallic acid 보다는 낮은 활성이였지만 다른 천연 추출물들과 비교하였을 때 높은 수준이였다. 바위 꽃탱자나무지의 alkali 추출물의 ABTS IC50 값은 250.56 μg/mL으로 확인되었다. 바위꽃탱자나무지의 alkali 추출물의 세포독성은 Raw 264.7 세포에서 확 인하였는데 500 μg/mL 이하의 농도에서 독성이 확인 되지 않았으며, NO 생성을 저해하는 것으로 확인되었 다. 바위꽃탱자나무지의 alkali 추출물은 모발 천연염 색제로 활용될 수 있으며, 화장품 원료에 적용 시 매 우 안전할 것으로 판단된다.
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