Lactobacillus plantarum BHN-LAB 33에 의한 천궁 발효 추출물의 항산화 활성 증대 효과 평가
정수진1․김병혁1․이준형1,2․박예은1․김중규1,2․권기석2․이중복1
1(주)비에이치앤바이오 생물산업소재개발연구소
2국립안동대학교 원예･생약융합학부
Increased Antioxidant Activity of the Fermented Cnidium officinale Extract by Lactobacillus plantarum BHN-LAB 33
Su Jin Jeong1, Byung-Hyuk Kim1, Jun-Hyeong Lee1,2, YeEun Park1, Jung-Gyu Kim1,2, Gi-Seok Kwon2, and Jung-Bok Lee1
1Institute for Development of Bio-industrial Materials, BHNBIO Co., LTD.
2Division of Horticulture & Medicinal Plant, Andong National University
ABSTRACT Cnidium officinale Makino (Umbelliferae) is an endemic species in China that has been cultivated in Korea, China, and Japan. C. officinale is used as traditional medicine in Asia because of its effects on pain, inflammation, menstrual disturbance, blood pressure depressant, and anti-vitamin deficiency disease. This study compared the anti- oxidant activity, total polyphenol, and total flavonoid content of fermented C. officinale with lactic acid bacteria and non-fermented C. officinale. The activity of the fermented C. officinale was increased, as illustrated by the 1.7 fold increase in 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activity. In addition, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazo- line-6-sulfonic acid) radical scavenging activity, and superoxide dismutase, total polyphenol, and total flavonoid contents were increased slightly. These results provide the basic data needed to understand the biological activities of fermented C. officinale for the development of functional foods and biological materials.
Key words: antioxidant, bioconversion, fermentation, lactic acid bacteria, Cnidium officinale Makino
Received 19 June 2019; Accepted 2 September 2019
Corresponding author: Jung-Bok Lee, Institute for Development of Bio-industrial Materials, BHNBIO Co., LTD., Jincheon-gun, Chung- buk 27850, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-54-822-8972 Author information: Gi-Seok Kwon (Professor)
서 론
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 정상적 인 세포 내 대사과정에서 생성되는 산소 부산물이며, 세포반 응을 조절할 수 있는 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있어 ROS의 항상성을 유지하는 것은 세포 성장과 생존에 매우 중요하다(Beckman과 Ames, 1998; Lee 등, 2008). 산화스 트레스는 세포 내의 ROS 증가로 DNA나 단백질, 지질 등과 반응하여 세포를 손상시키는 현상이며, 치명적인 산소 독성 을 일으키고 노화나 심장, 암, 뇌질환 등 질병의 핵심 원인으 로 알려져 있다(Rhee, 2006; Ozben, 2007; Valko 등, 2007).
이러한 산화 스트레스로 인한 건강 문제를 해결할 수 있는 소재와 항산화제에 대한 관심이 높아지고 있으며 항산화 물 질 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 초기에는 인위적 결 합에 의한 합성 항산화제가 높은 항산화 활성과 경제성으로
인해 사용되었지만, 생물학적 활동 억제와 발암성 논란이 되면서 보다 안전하고 산화스트레스에 의한 질병의 예방과 억제에 대한 방어 기능이 우수한 천연물을 이용한 항산화제 개발에 관심이 집중되고 있다(Branen, 1975; Omaye 등, 1977; Williams 등, 1999; Halliwell, 2006).
생물전환(biotransformation 또는 bioconversion)은 미 생물과 효소를 이용해 여러 가지 유용한 대사산물을 생산, 제조하는 것으로 최근 생물산업을 구성하는 핵심 기술 중 하나라고 할 수 있다. 생물전환은 생체 및 생촉매의 기능을 활용하여 원료물질을 고부가가치 물질로 전환시켜 천연 소 재 개발뿐 아니라 의약품, 의약품 원료물질, 비타민, 유용 아미노산, 인지질, 식품원료, 농업용 화학제품 등을 포함한 다양한 제품 생산에 활용할 수 있다(Na와 Moon, 2015).
생물전환의 대표적인 예는 미생물 효소를 이용한 유기물을 분해시키는 발효가 있다. 최신 발효공법은 미생물 기질특이 성을 이용한 보다 효율적인 생물전환에 집중되고 있다(Kim 등, 2019). 또한 합성화학공업의 제반 문제점인 고에너지 사용 및 환경문제의 해결법을 적극적으로 고려한 천연 항산 화 소재 개발의 일환으로 생물전환 기술이 주목받고 있으며, 첨단 유용물질에 관한 기술선진국을 중심으로 청정 산업의
핵심기술로 연구 및 개발이 진행되고 있다(Kang과 Lee, 2013). 발효에 사용되는 미생물로는 유산균, 효모, 일부 곰 팡이 등이 있으며, 유산균은 인간이 이용하는 가장 유익한 미생물의 한 종류로서 Lactobacilli 및 Bifidobacterium과 같은 유산균은 당류를 발효하여 젖산(lactic acid)을 생산한 다. 이를 이용한 발효는 부패를 방지하고 항균물질을 방출하 여 부패균에 의한 독성물질의 억제 및 분해, 장내 유해균 억제와 유익균 유지 및 증가를 유도하여 면역증강작용, 유당 분해 등의 효과를 주는 것으로 알려져 있다(Goldin, 1998;
Park 등, 2018).
천궁(Cnidium officinale Makino)은 산형과(Umbelli- ferae)에 속하는 중국산 다년초로 높이가 30~60 cm 정도 이며, 한방에서 중풍, 각종 통증질환 및 부인과 질환 등에 사 용되고 있는 약용식물자원이다(Lee, 2003; Seo 등, 2008).
여름철에 수확하여 줄기, 잎, 수근을 제거한 뿌리를 건조한 후 얇게 세절하여 약용으로 사용한다(Oh 등, 2010). 특히 천 궁의 뿌리는 수면, 진정, 항진균성, 항균성 및 비타민 E 부족 증 치료 등의 약리 효능이 있으며, 보혈, 소염 및 산통작용에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Choi 등, 2002; Baek 등, 2003; Jung과 Lee, 2017). 또한 천궁은 cnidilide, ligu- stilide, butylphthalide, cnidiumlactone, tetramethylpyr- azine 등이 주요성분으로 알려져 있으며, 이 중 cnidium- lactone과 tetramethylpyrazine은 뇌로 공급되는 미세혈관 의 혈류를 개선하여 뇌허혈을 치료할 수 있는 것으로 연구된 바 있다(Cho 등, 2000; Cho 등, 2001).
이에 본 연구에서는 미생물 발효공정을 통해 천궁의 항산 화 기능 증진 효과를 확인하고자 하였다. 새롭게 분리된 유 산균으로 천궁을 발효하였으며, 총 폴리페놀, 총 플라보노이 드 함량과 항산화 활성 변화를 확인하고 생물전환 된 발효천 궁 추출물의 건강기능 식품 소재로서 활용 가능성을 모색하 고자 한다.
재료 및 방법
원료 및 시약
천궁은 경상북도 안동시에서 2016년 수확한 것을 건조된 상태로 포장한 것을 구입하여 4°C에서 보관하며 사용하였 다. 총 페놀, 총 플라보노이드 함량과 항산화 활성 측정에 사 용된 시약은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH; Sig- ma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), Folin-Ciocalteu reagent(Junsei, Tokyo, Japan), sodium carbonate(Junsei), gallic acid(Sigma-Aldrich Co.), quercetin(Sigma-Aldrich Co.), 0.1 N-hydrogen chloride(HCl, Junsei), pyrogallol (Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다.
발효미생물 동정
본 연구에 사용된 미생물은 전통발효식품인 배추김치를 안동시장에서 구매하여 분리 및 동정한 후 연구에 사용하였
다. 분리 유산균의 미생물 동정은 16S rRNA gene 분석을 통해 수행하였으며, 배양액 1.5 mL를 취해 Fast DNA Spin kit for Soil(MP Bio, Santa Ana, CA, USA)을 이용하여 total DNA를 추출하였다. 추출된 total DNA의 농도와 순도 는 NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)을 이용하여 결정하였으며, 시료의 농도는 50 ng/
µL 이상, 순도는 1.8~2.0으로 본 연구를 수행하기에 적합하 였다. 16S rRNA gene 분석은 27F(5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)와 1541R(5’-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3’)을 사용하였다(Forney 등, 2004).
PCR 반응은 50 μL 반응액에 1×PCR buffer, 20 mM MgCl2, 40 mM dNTP mixture, 각 primer(1 μM), template DNA 와 0.5 U Taq polymerase를 첨가하여 PCR을 수행하였다.
반응조건은 94°C에서 5분 동안 DNA를 pre-denaturation 시켜, 94°C에서 1분 denaturation, 65°C에서 1분 anneal- ing, 72°C에서 1분 30초 extension 하고 72°C에서 5분 동 안 final extension을 수행하였다. PCR 증폭산물은 1.2%
agarose gel에 loading 한 후 약 1,500 bp 크기의 band를 확인한 다음, agarose gel을 회수하여 HiGeneTM Gel &
PCR Purification Solution Kit(Biofact, Daejeon, Korea) 으로 정제하여 cloning 하였다. Cloning은 All-in-one PCR cloning kit(Biofact)을 이용하였고, manufacturer’s pro- tocol을 따라 수행하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정 하였다. 결정된 염기서열은 CAP3 sequence assembly pro- gram(http://doua.prabi.fr/software/cap3)을 통해 assem- ble 하여 1,500 bp의 16S rRNA gene의 염기서열을 확인하 였으며, NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank data- base를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다. 또한 Phylogenetic tree는 ClusterX를 이용하여 미생물 간 상동 성을 분석하고, MEGA 5.0의 neighbor-joining method를 이용하여 유전적 계통분류를 분석하였다(Tamura 등, 2011).
발효 유산균 분리와 동정
발효 시간에 따른 미생물의 변화를 정량적으로 평가하기 위해 qPCR을 수행하였다. 유산균의 정량적 평가를 위해 Lacto-F(5’-GCA GCA GTA GGG AAT CTT CCA-3’)와 Lacto-R(5’-GCA TTY CAC CGC TAC ACA TG-3’) pri- mer를, Escherichia coil DH5α의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 350 bp의 PCR 산물을 얻었다(Castillo 등, 2005). PCR 산물은 All-in-one vector(Biofact)에 cloning 하였으며, plasmid DNA는 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Biofact)을 이용하여 추출하였다. 염기서열분석은 M13- 20F(All-in-one Vector Systems manual)를 이용하여 분 석하였고, BLAST search를 통해 확인하였다. 염기서열이 확인된 plasmid DNA는 Real-time PCR(CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 melting curve 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자(artificial standard clone)로 사용하였다.
정량 PCR을 위해 Real-time PCR과 iTaqTM SYBR® Green Super mix with ROX(Bio-Rad)를 이용하였다.
Lactobacillus sp. 16S rRNA gene 정량 PCR은 Lacto-F/
R을 이용하였고(Castillo 등, 2006), 반응조건은 95°C에서 15분 동안 pre-denaturation 시켜, 95°C에서 30초 dena- turation, 67°C에서 30초 annealing, 72°C에서 30초 ex- tension 후 fluorescence를 측정하고 45 cycles을 수행하 였으며, final extension은 72°C에서 5분 동안 수행하였다.
Melting curve 분석은 65°C부터 95°C까지 0.2°C씩 증가시 키면서 fluorescence를 측정하였다(Kim 등, 2017). 또한 유전자 정량을 위해서 표준 유전자를 serial dilutions 하여 Real-time PCR을 수행하였으며, 정량을 위한 표준곡선은 y=-4.073x+48.617(R2=0.9918)로 확인되어 유산균 정량 에 이용하였다. 또한 DNA 농도는 NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)을 이용하여 1 ng/μL 분석에 이용하였 다(Kim 등, 2017).
발효 조건
천궁은 homogenizer를 이용하여 분쇄한 후 0.2 cm mesh 로 여과하여 0.2 cm 이하의 원물을 사용하였다. 천궁발효 추출물에 사용된 균주는 김치로부터 분리된 유산균을 이용 하였으며, 천궁발효 추출물만을 넣은 배지에서 성장을 통해 선발하였다(data not shown). 유산균 발효공정에 이용하기 위해 MRS broth(Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 37°C, 8시간 배양하였으며, 접종 전 원심분리를 통해 미생 물만을 회수하여 물과 함께 천궁 200 g에 유산균 현탁액 75 mL를 접종하였다. 미생물 접종 후 37°C에서 4일간 배양 하였다.
추출용매 및 조건
건조된 천궁 10 g을 취해 70% 주정 500 mL와 혼합하여 autoclave로 80°C에서 60분간 추출하여 4°C에서 24시간 방치하였다.
총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량의 측정은 Folin-Denis 방법에 따라 진 행하였다(Smeriglio 등, 2016). 96-well plate에 시험물질 을 10 µL와 Na2CO3 시약 200 µL, 50% Folin 시약 10 µL를 넣고 잘 혼합한 후, foil로 빛을 차단시킨 상태에서 30분 동 안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 ELISA를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이때 시험물질의 총 폴리페 놀 함량은 gallic acid를 이용하여 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 µg/mL의 농도로 작성된 표준곡선을 통하여 분석하 였다.
총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 활 용하여 진행하였다. 96-well plate에 시험 물질 20 µL, 용매
제 80 µL, 5% NaNO2 6 µL를 넣고 5분간 상온에서 반응한 후 10% AlCl3･6H2O 12 µL를 상온에서 6분간 반응시키고 1 N NaOH 40 µL를 넣어 반응을 정지시키고 상온에서 11분 동안 반응시킨 다음 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 시험물질의 총 폴리페놀 함량은 rutin을 이용하여 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 µg/mL의 농도로 작성된 표준곡 선을 통하여 분석하였다.
DPPH 라디칼 소거능 측정
DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 일부 변형하여 수행하였다. 96-well plate에 시험 물질 20 µL, DPPH 180 µL를 각각 첨가한 후 37°C에서 30분간 반응시 키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 용액을 첨가한 실험군과 첨가하지 않는 군 사이 의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
Antioxidant activity (%)＝[(Absorbance of sample－
Absorbance of sample blank)/ (Absorbance of control－Absorbance of blank)]×100
ABTS 라디칼 소거능 측정
2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능 측정은 van den Berg(1999) 의 방법을 변형하여 측정하였다. 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate 용액을 혼합하고 24시간 차광 및 정 치하여 ABTS 용액을 제조하여 측정하였다. ABTS 용액 970 µL와 추출물 30 µL를 혼합하여 암소에서 30분간 방치 한 후, 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디 칼 소거 활성 측정은 시험 물질을 첨가한 실험군과 첨가하지 않은 군의 흡광도 감소율을 백분율로 나타내었다.
SOD 유사활성 측정
Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정은 과산화 수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생 성량을 측정하여 나타내었다(Marklund와 Marklund, 1974).
Tris-HCl buffer(50 mM tris-hydroxymethyl amino- methane in 10 mM EDTA, pH 8.5) 130 µL를 준비하여 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm 농도로 희석한 각 시험 물질을 10 µL 첨가한 후 7.2 mM pyrogallol 10 µL와 혼합 하여 10분간 상온에서 반응하였다. 1 N HCl 10 µL를 첨가 하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으 며, 활성도는 시험 물질을 첨가한 실험군과 첨가하지 않은 군의 흡광도 감소율을 백분율로 나타내었다.
통계학적 분석
본 연구의 모든 실험은 3회 이상 수행하고, mean(평 균)±standard(표준편차)로 나타내었다. 통계 분석은 SPSS (SPSS Inc., Armonk, NY, USA)를 이용하여 실험 그룹 간 유의성을 P<0.01, P<0.05 수준에서 Student’s t-test에 따
Table 1. Quantification of L. plantarum BHN-LAB 33 in the C. officinale fermentation process using the Lactobacillus sp.
16S rRNA gene by the real-time PCR
Time L. plantarum BHN-LAB 33
AVERAGE STDEV
0 5 12 17 25 48 72 96
6.88E+07 6.85E+07 1.01E+08 2.55E+08 8.96E+08 3.05E+09 3.67E+09 3.59E+09
2.53E+06 6.00E+06 1.25E+06 6.75E+07 1.51E+08 1.12E+08 1.70E+08 2.96E+08
Fig. 2. Quantitative analysis of L. plantarum BHN-LAB 33 in the Cnidium officinale fermentation process by the real-time PCR.
Fig. 1. Phylogenetic tree of the Lactobacillus plantarum BHN- LAB 33 and related bacteria of the Lactobacillus group based on 16S rRNA gene sequence comparisons. The sequences of isolated strains were compared with available from the GenBank database.
라 분석하였다.
결과 및 고찰
분리 미생물 동정
천궁의 기능성 성분의 효능 향상을 위해 사용된 생물전환 미생물은 김치에서 분리하였으며, 16S rRNA gene의 염기 서열을 확인하여 Lactobacillus plantarum과 99% 유사도 를 가지며, 분석된 16S rRNA gene sequence를 이용하여 유전적 계통도를 분석한 결과 Lactobacillaceae에 속하고, Lactobacillus amylotrophicus, Lactobacillus pontis, Lac- tobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactobacillus ceti 등의 species 수준에서 구별되는 것을 확인하고 L. plantarum BHN-LAB 33이라 명명하였다(Fig. 1).
생물전환 미생물의 성장 곡선
천궁의 생물전환을 위한 배양액 내에서 발효 시간에 따른 L. plantarum BHN-LAB 33의 성장을 Real-time PCR을 통해 확인하였으며, 초기 접종한 후 BHN-LAB 33은 6.88×
107±2.53×106 copy･molecul/mL로 확인되었다. 천궁의 발효를 위해 L. plantarum BHN-LAB 33을 접종한 후 5, 12, 17, 25, 48, 72, 96시간에 각각 시료를 채취하여 L.
plantarum BHN-LAB 33의 16S rRNA gene copy를 분석 한 결과, 각 채취 시간별로 6.85×107±6.00×106, 1.01×108
±1.25×106, 2.55×108±6.75×107, 8.96×108±1.51×108, 3.05×109±1.12×108, 3.67×109±1.70×108, 3.59×109± 2.96×108 copy･molecul/mL로 미생물 성장을 확인하였다 (Table 1, Fig. 2). BHN-LAB 33의 성장은 접종 후 17시까 지 lag phase 상태인 것을 확인하였으며, 접종 17시간 이후 exponential phase인 미생물 성장이 급격하게 증가하는 것 을 확인하였다. 또한 접종 48시간 이후 BHN-LAB 33의 성 장이 둔화되었으며, 72시간부터는 stationary phase가 시작 됨을 확인하였다. 그러나 BHN-LAB 33의 성장이 감소하는 death phase는 확인하지 못했다. 이는 L. plantarum BHN- LAB 33의 성장곡선은 일반적인 미생물의 성장곡선을 나타 내고 있으며, BHN-LAB 33의 성장을 통해 천궁의 생물전 환을 간접적으로 확인할 수 있었다. 또한 MRS 액체배양과 같은 폭발적인 성장을 보이지 않았으며, lag phase가 길어 BHN-LAB 33이 천연물에 적응하는 시간이 미생물 배지를 이용한 배양 시 나오는 성장패턴과 다른 것을 확인할 수 있 다. 이는 Lactobacillus brevis와 Pediococcus pentosa- ceus를 이용한 아마씨 고상발효, L. plantarum의 엉겅퀴 고
Table 2. Total polyphenol and total flavonoid contents of extracts from the fermented C. officinale extract with L. plantarum BHN- LAB 33
Concentration Total polyphenol contents (µg/100 g) Total flavonoid contents (µg/100 g) Before fermentation After fermentation Before fermentation After fermentation 250 ppm
500 ppm 1,000 ppm
3.78±1.60 16.39±0.75 36.06±2.12
6.89±1.00 21.44±2.15* 44.89±2.43**
1.25±0.04 2.45±0.24 3.04±0.74
2.21±0.12**
3.09±0.21* 8.51±0.21**
Total polyphenol contents (µg/100 g) of the fermented C. officinale based on gallic acid as standard.
*P<0.05, **P<0.01 vs NF.
Fig. 3. DPPH radical scavenging activities of 70% ethanol ex- tracts from fermented C. officinale (Korea) with L. plantarum BHN-LAB 33. DPPH radical activity based on ascorbic acid (1,000 ppm) as positive control and was measured at 517 nm.
NF, non-fermented C. officinale extracts; F, fermented C. offici- nale extracts by L. plantarum BHN-LAB 33. **P<0.01 vs NF.
상발효에서 낮은 미생물 성장률과 같이 유사한 성장패턴을 확인하였다(Park 등, 2018; Park 등, 2019). 그러나 생물전 환 미생물의 낮은 성장률에도 불구하고 천연물의 생물전환 과 그에 따른 효과가 유효하다는 것이 보고되어 방풍의 생물 전환에 따른 효능을 평가하기도 하였다(Park 등, 2018;
Park 등, 2019). 따라서 본 연구에서도 생물전환 된 천궁, 즉 발효된 천궁과 발효하지 않은 천궁의 효능을 비교하여 평가하고자 한다.
총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량
BHN-LAP 33으로 발효 전과 발효 후 천궁의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 gallic acid와 rutin을 기준으 로 측정하여 생물전환능을 확인하였다(Table 2). 폴리페놀 은 페놀성 화합물에 속하며 히드록실기(-OH)가 존재하여 단백질 등 여러 큰 분자의 화합물과 쉽게 결합하여 산소종의 발생과 작용을 억제하고 성인병을 예방하며 노화 방지와 지 연에 효과가 있다고 알려져 있다(Velioglu 등, 1998; Lu와 Foo, 2000). 플라보노이드 또한 폴리페놀의 일종이며, 일반 적으로 폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 등의 생리활성이 비례적으로 증가한다고 보고되고 있다(Imai 등, 1994;
Halliwell 등, 1995). 발효하지 않은 천궁과 발효한 천궁의 총 폴리페놀 함량은 각각 250 ppm 농도에서 3.78±1.60, 6.89±1.00 µg/100 g이었으며, 500 ppm에서 16.39±0.75, 21.44±2.15 µg/100 g, 1,000 ppm에서 36.06±2.12, 44.89
±2.43 µg/100 g으로 유의성 있는 증가를 보였다. 총 플라보 노이드 함량은 발효하지 않은 천궁과 발효한 천궁 각각 250 ppm 농도에서 1.25±0.04, 2.21±0.12 µg/100 g이었으며, 500 ppm에서 2.45±0.24, 3.09±0.21 µg/100 g, 1,000 ppm에서 3.04±0.74, 8.51±0.21 µg/100 g으로 유의성 있 는 증가를 보였다. 미생물에 의한 생물전환을 통해 총 폴리 페놀과 총 플라보노이드의 함량 변화에 영향을 줄 수 있으 며, Lactobacillus paracasei, L. rhamnosus 등을 이용하여 칡과 엉겅퀴의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드가 증가하는 것이 보고되었다(Kim 등, 2019; Park 등, 2019). 이와 같이 발효한 천궁과 발효하지 않은 천궁 모두 농도 의존적으로 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 증가함은 BHN- LAB 33의 대사과정을 통한 생물전환을 통해 이루어졌을 것으로 판단하였다.
DPPH 라디칼 소거능 측정
DPPH는 화학적으로 유도되는 비교적 안정한 라디칼로서 항산화 물질인 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류 등에서 전자를 공여 받아 hy- droxy radical 혹은 super-oxide 등을 제거하여 항산화 능 력을 평가할 때 사용되는 지표이다. 높은 값일수록 항산화능 이 우수한 것으로 판단하며, 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성능을 측정하여 나타낸 결과는 Fig. 3과 같다. 발효하지 않은 천궁 추출물 250, 500, 1,000 ppm에서 각각 9.22±
0.36, 10.78±1.61, 16.06±0.51%의 DPPH 라디칼 소거 활 성능을 나타냈다. BHN-LAP 33으로 발효한 천궁 추출물은 같은 농도에서 16.30±0.51, 21.30±1.43, 27.59±2.19%
의 DPPH 라디칼 소거 활성능을 나타내며, 전 구간의 DPPH 라디칼 소거능이 약 1.7배 이상 유의적으로 증가한 활성을 확인하였다. 특히 농도별 처리구 간 중 발효한 천궁 추출물의 최저 농도인 250 ppm의 DPPH 라디칼 소거 활성능이 발효 하지 않은 천궁 추출물의 최고 농도인 1,000 ppm의 소거능 보다 높은 활성을 나타내었다. 일반적으로 폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 등의 생리활성이 비례적으로 증가한다고 보고되고 있으며(Imai 등, 1994; Halliwell 등, 1995), 본 연구에서 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 높다고 확인 된 발효한 천궁에서의 DPPH 활성이 높은 것을 확인할 수
Fig. 4. ABTS scavenging activities of 70% ethanol extracts from fermented C. officinale (Korea) with L. plantarum BHN-LAB 33. ABTS scavenging activities based on ascorbic acid (1,000 ppm) as positive control and was measured at 517 nm. NF, non-fermented C. officinale extracts; F, fermented C. officinale extracts by L. plantarum BHN-LAB 33. *P<0.05, **P<0.01 vs NF.
Fig. 5. Superoxide dismutase like activity of 70% ethanol ex- tracts from fermented C. officinale (Korea) with L. plantarum BHN-LAB 33. SOD-like activity based on ascorbic acid (1,000 ppm) as positive control and was measured at 420 nm. NF, non- fermented C. officinale extracts; F, fermented C. officinale ex- tracts by L. plantarum BHN-LAB 33. **P<0.01 vs NF.
있었다.
ABTS 라디칼 소거능 측정
DPPH 라디칼 소거 활성능이 유리라디칼이 제거되는 원 리를 이용한다면, ABTS 라디칼 소거능은 양이온 라디칼이 제거되는 것을 이용하므로 두 종류의 라디칼 소거능 확인의 필요가 있을 것으로 사료되어 실험 진행하였고 결과는 Fig.
4와 같다. 발효하지 않은 천궁과 BHN-LAP 33으로 발효한 천궁 추출물을 각각 250, 500, 1,000 ppm 농도로 처리하였 을 때 ABTS 라디칼 소거능 활성은 시료의 농도에 의존적으 로 활성이 증가하였으며, 발효하지 않은 천궁 추출물 250, 500, 1,000 ppm의 ABTS 라디칼 소거 활성은 각각 11.64±
1.17, 22.75±0.94, 40.30±1.57%의 ABTS 라디칼 소거 활 성능을 보였고, BHN-LAB 33으로 발효한 천궁 추출물 250, 500, 1,000 ppm의 ABTS 라디칼 소거 활성능은 각각 12.99±1.13, 25.67±0.81, 47.49±1.23%의 ABTS 라디칼 소거 활성능을 확인하였다. 발효한 천궁은 발효하지 않은 천궁 대비 미미한 수준이지만 시험 전 구간에서 ABTS 라디 칼 소거능 증가를 보였다. 이러한 결과는 DPPH 라디칼 소거 활성의 농도 의존적으로 증가하는 결과와는 일치하나, 보다 활성도가 낮은 것으로 보아 ABTS 라디칼 소거 활성보다 DPPH 라디칼 소거 활성에 대해 더 높은 활성을 나타내는 것으로 사료된다.
SOD 유사활성 측정
SOD 유사활성 물질은 효소가 아닌 저분자 물질로 주로 phytochemical에 속하며 superoxide의 반응성을 억제하 여 항산화력을 나타내는 것으로 보고되어, 본 실험에서는 BHN-LAP 33으로 발효를 한 천궁과 발효하지 않은 천궁의 SOD 유사활성 분석 측정하여 항산화력을 비교 평가하였다.
그 결과 시험군 모두 농도 의존적으로 유사활성이 증가함을
확인하였다(Fig. 5). 1,000 ppm 농도에서 발효하지 않은 천 궁의 SOD 유사활성 분석은 22.48±3.63%를 보였으며, BHN -LAB 33으로 발효한 천궁에서 37.29±3.26%로 약 1.6배 이상의 활성 변화를 보이며 유의성 있는 증가를 보였으며, 저농도 250, 500 ppm에서도 유사한 결과를 확인하였다.
Positive control인 ascorbic acid보다 활성이 낮게 확인되 었지만, 생물전환을 통한 발효된 천궁은 발효하지 않은 칡 추출물에 비해 증가한 것을 확인하였다.
본 연구는 발효하지 않은 천궁과 발효된 천궁의 생물전환 을 통해 생리활성의 변화를 확인함으로써 건강기능식품 소 재개발의 기초자료로 제공하고자 하였다. 생물학 체계에서 항산화제의 보호능력은 주로 항산화제의 유리라디칼 소거 능, 금속촉매 chelating 능력, 항산화 효소의 활성, 산화 효 소의 억제 작용으로 판단한다고 보고되고 있다. Kang 등 (2013)은 전자공여능이 phenolic acid와 flavonoids 및 기 타 phenol성 물질에 대한 항산화의 지표라 하였으며 환원력 이 큰 물질일수록 전자공여능이 높다고 하였다. 시험에 사용 된 발효하지 않은 천궁과 발효된 천궁을 추출하여 각각의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량과 DPPH, ABTS radi- cal 소거 활성과 SOD 유사활성 측정을 통하여 항산화 활성 을 비교 확인하였다. 추출물을 각각 250, 500, 1,000 ppm 농도로 처리하였을 때 시험한 모든 실험에서 시료 농도에 따라 의존적으로 활성이 증가하였으며, BHN-LAP 33으로 발효하여 생물전환 된 천궁이 발효하지 않은 천궁 추출물보 다 높은 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량을 나타냈고 DPPH, ABTS radical 소거 활성능 측정 및 SOD 유사활성 측정을 통하여 높은 항산화력을 확인하였다. 또한 미생물에 의한 생물전환은 epimerization, hydration, hydroxylation 과 같은 부가적 반응이 작다는 장점이 있다. 이러한 생물전 환의 장점과 본 연구의 결과는 유산균 발효 천궁이 건강기능 식품 소재로서 개발 및 응용이 가능할 것으로 기대된다.
요 약
천궁(Cnidium officinale Makino, Umbelliferae)은 중국의 특산종으로 한국, 중국, 일본에서 재배되고 있다. 천궁은 한 국에서 전통의학으로 사용되어 왔으며, 통증, 염증, 생리 장 애, 혈압 저하제 및 항비타민 결핍 질환에 효과가 있다고 알려져 있다. 본 연구는 유산균 발효를 통한 천궁과 발효하 지 않은 천궁의 항산화 활성과 총 폴리페놀 및 총 플라보노이 드 함량을 비교하고자 하였다. 발효한 천궁의 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성에서 1.7배 증가하였다. 또한 ABTS 라디 칼 소거 활성, SOD 유사활성, 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량도 소폭 증가하였다. 이러한 결과는 기능성 식품 개발을 위한 유산균으로 발효한 천궁의 항산화능을 확인하고 기능 성 식품 또는 화장품 소재로의 개발에 필요한 기초 자료를 제공하고자 하였다.
감사의 글
본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원의 지역주 력산업육성사업(P006800996)과 농림축산식품부의 재원 으로 농림수산식품기술기획평가원의 2017년도 고부가가치 식품개발사업의 지원을 받아 연구되었습니다(117104-02- 2-SB010).
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