74 책임저자：조은주
609-735, 부산시 금정구 장전동 산 30번지 부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2837, Fax: 051-583-3648 E-mail: [email protected]
정태영
609-735, 부산시 금정구 장전동 산 30번지 부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2840, Fax: 051-583-3648 E-mail: [email protected]
접수일：2013년 1월 9일, 1차 수정일：2013년 1월 15일, 2차 수정일：2013년 1월 18일, 게재승인일：2013년 1월 22일
*These authors contributed equally to this study.
Correspondence to：Eun Ju Cho
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, 30, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: ＋82-51-510-2837, Fax: ＋82-51-583-3648 E-mail: [email protected]
Co-corresponding author：Tae Yung Chung
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, 30, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: ＋82-51-510-2840, Fax: ＋82-51-583-3648 E-mail: [email protected]
원추리 지상부의 최적추출조건 확립 및 추출물의 항산화 활성
부산대학교 식품영양학과 임지애ㆍ정태영*ㆍ조은주*
Determination of Optimum Extraction Solvent and Antioxidative Properties of Solvent Extract from Hemerocallis fulva Leaves
Jee Ae Lim, Tae Yung Chung* and Eun Ju Cho*
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
This study was performed to investigate the possible utilization of Hemerocallis fulva (H. fulva) leaves as either functional food or natural antioxidants. To determine the optimum extraction solvent, the dried H. fulva was extracted with 7 solvents, and yield, total flavonoid content and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging activity of each extract were compared. Among the extracts, 80% ethanol extract showed the highest yield, total flavonoid content and DPPH scavenging activity. The 80% ethanol extract was further fractionated subsequently by n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol and water. Among five fractions from 80% ethanol extract, the ethyl acetate fraction showed the highest total flavonoid content (322.99 mg Que/g) among five fractions, and also exhibited an excellent DPPH scavenging activity (89.09∼93.79 at 100∼500 μg/ml). Metal-ion (10−3 M FeCl3) chelating effect of the ethyl acetate fraction at the concentration of 100 μg/ml showed 75.46%. The present study indicated that the ethyl acetate fraction exerted the highest total flavonoid content and the strongest antioxidative activity, suggesting that ethyl acetate fraction contains the bioactive compounds with antioxidative activity. (Cancer Prev Res 18, 74-79, 2013)
Key Words: Hemerocallis fulva, Total flavonoid content, DPPH scavanging activity, Metal chelating effect
서 론
인체의 모든 세포에서는 생명유지에 필요한 에너지를 생산하기 위해 끊임없이 산소를 이용하는 산화적 대사
과정이 이루어지고, 이러한 과정에서 미량의 산소들은 불완전 환원되어 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 을 생성한다. 또한 ROS는 NADPH oxidase에 의한 매개대 사반응이나 외인성물질의 cytochrome P-450 의존성 대사 반응, xanthine oxidase 등에 의한 효소반응, 오존, 자외선,
Fig. 1. Flow chart for extraction and fractionation of dried H.
fulva leaves.
방사선, 흡연 등에 의해 새로 생성되는데, 정상적인 대사 과정에서는 생체 내 자기방어체제인 항산화효소(super- oxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase 등), 생물학 적 항산화제(transferrin, ceruloplasmin, urate 등) 그리고 항 산화물질(ascorbic acid, α-tocopherol, glutathione 등) 등에 의해 제거되지만, 생체방어기구 이상과 각종 물리적, 화 학적 요인들에 의한 생체 내 활성산소들의 과도한 생성 이 생체방어기구의 용량을 초과하게 될 경우 산화적 스 트레스(oxidative stress)를 야기시킬 수 있다. 그 결과 효소 의 불안정화, 세포막과 조직 훼손, DNA 변성 및 세포노 화 등을 초래하여 암, 뇌질환, 심장질환, 동맥경화, 염증, 자가면역질환 등의 심각한 장애를 일으키는 원인으로 지목되고 있다.1,2) 따라서 vitamin C, E, flavonoids, poly- phenol 그리고 phenolic acid와 같은 항산화성분을 섭취하 거나 항산화 효소 활성 증가 등으로 체내 항산화효능을 증진시키는 것이 산화적 스트레스 감소에 중요한 것으 로 보고되고 있으며, 이와 함께 항산화물질을 함유하는 천연자원에 대한 관심 또한 증가되고 있다.3)
백합과 다년초 숙근초인 원추리(Hemerocallis fulva)는 넘 나물로 불리는 우리나라 대표적인 봄나물이다. 식용, 한 방 및 민간요법으로 애용되어져 온 원추리류는 마음을 안정시키고 stress와 우울증을 치료하는 약초로 알려져 있으며, 폐결핵, 빈혈, 황달, 변비, 소변불통 등의 치료를 위해 민간요법으로 많이 사용되어왔다.4) 뿌리는 훤초근 (萱草根)이라 하여 이뇨, 지혈 및 소염제로 사용되어 왔 고, 꽃은 금침채(金針菜)라 하여 소변이 붉고 찔끔찔끔 나오는 병(小便短赤), 황달, 가슴이 답답하고 열이 나는 증상(胸膈煩熱), 밤에 숙면을 취하지 못하는 증상, 치질 로 인한 빈혈을 치료하는데 사용하였으며, 봄철 어린순 은 청열이습(淸熱利濕)의 효능이 있어 흉격번열(胸膈煩 熱), 황달(黃疸), 소변단적(小便短赤)의 치료에 사용해 왔 다.5)
원추리의 생리활성에 관한 연구로는 뿌리와 줄기의 혈압강하효과, 꽃잎과 잎의 항산화효과,6∼8) 뿌리의 진정 효과,9) 패혈증치료 효과,10,11) 항종양작용12) 및 에너지증 강효과13) 등과 같은 다양한 약리작용을 가지고 있음이 밝혀지고 있다. 그러나 대부분의 연구는 약용으로 사용 되는 부위인 뿌리와 꽃에 대한 연구들이 많은 반면, 봄에 식용으로 이용되는 원추리 지상부에 대한 연구가 부족 한 실정이다.
따라서 본 연구는 원추리 지상부의 생리효능을 체계 적으로 밝히기 위한 기초자료를 얻고자, 우선 최적 추출 조건 확립과 추출조건에 따른 추출물의 특성을 살펴보 기 위해 에탄올과 메탄올의 계통적 용매추출물을 조제
한 후 총 플라보노이드 함량, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거활성과 Fe3+에 대한 금속봉쇄작용을 측정함 으로써 항산화효능을 검토하였다.
재료 및 방법
1. 시료의 제조
1) 재료: 원추리는 2008∼2010년 3∼4월 경 경주 산내
지역의 불국사 말사인 보광암 일대에서 채취한 지상부 를 수세하고 상온에서 일부 수분을 제거한 것을 동결건 조시켜 −20oC에 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다.
추출용매는 특급(Carlo Erba Reagenti, Milan, Italy) 및 일급 시약(Dae Jung Chemicals & Metal Co., Siheung, Korea)을, 항 산화 활성실험에 사용된 quercetin, linoleic acid, α-toco- pherol, L-ascorbic acid, butylated hydroxyanisole (BHA), DPPH 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사 용하였다.
2) 계통적 용매추출물 및 조추출물 조제: 원추리분말 10
g에 15배의 용매(distilled water, ethanol, 80% ethanol, 70%
ethanol, methanol, 80% methanol and 70% methanol)를 첨가 하여 실온에서 5시간동안 3회 반복 추출하였고, 선정된 용매의 조추출물은 원추리분말 100 g당 시료중량의 15 배에 용매를 가한 후 상온에서 24시간 동안 3회 반복 추 출하였다. 추출이 끝난 후 모든 추출물은 Adventec Filter
Table 1. Properties of dried H. fulva leaves extracts prepared with various solvents
Solvent Yield (%) Total flavonoids (mg Que/g extract) Scavenging effect (%)*
Distilled water 45.18 14.53±0.66d 11.26±0.37e
Methanol 40.42 22.12±0.36bc 17.41±0.78d
Ethanol 19.82 20.22±0.35c 11.97±0.61e
80% Methanol 49.14 25.54±0.66abc 19.22±0.50bc
80% Ethanol 51.32 29.71±1.21a 20.73±0.49a
70% Methanol 50.30 26.68±1.14ab 19.64±0.45ab
70% Ethanol 52.94 29.33±0.78a 17.81±0.39cd
Values are mean±SD.
Quercetin (Que) was used as a standard for measuring of the total flavonoid content.
*Final concentration of each sample in reaction mixture was 100 μg/ml.
a∼eMeans with the different letters among fractions are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
paper No. 2 (185 mm)를 사용하여 여과하였으며 회전식 농축기(Buchi Rotavapor R-114, Tokyo, Japan)로 40oC 이하 에서 건고시키고 −20oC 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
3) 극성별 용매 분획: 80% 원추리 에탄올 추출물을 Fig.
1과 같은 순서로 분획여두를 이용하여 용매별로 분획하 였다. 우선, 300 ml의 증류수에 녹인 후 n-hexane (Hx), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc) 및 n-butanol (BuOH)로 순차적으로 300 ml씩 3회 반복 분획하였고, 나 머지 잔사는 물(H2O) 분획물로 하였다. 각 분획물은 감 압농축한 후, 동결건조시켜 Table 1과 같이 수율을 계산 하였고, −20oC 냉동고에 보관하면서 항산화활성 측정용 시료로 사용하였다.
2. 총 플라보노이드 함량 분석
총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법14)을 변형하 여 측정하였다. 1.0 mg/ml의 농도로 희석한 시료액 0.1 ml에 10% aluminum nitrate 0.1 ml와 1 M potassium acetate 0.1 ml 그리고 80% 에탄올 4.7 ml를 가하여 25oC에서 40 분간 반응시킨 후 UV-spectrophotometer를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 quercetin 을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 시료 용매 분획 물의 총 플라보노이드 함량을 산출하였다. Blank로는 각 추출 분획물을 용해시킨 용매를 사용하였다.
3. 항산화 효과 측정
1) DPPH 소거활성: 원추리 추출물의 free radical 소거효 과는 Blois의 방법15)에 준하여 free radical인 DPPH에 대한 소거능으로 측정하였다. 실험에 사용된 DPPH 용액은 빛 을 차단시킨 용기를 사용하여 99.9% 에탄올에 녹여 1.5×
10−4 M의 농도가 되도록 조제한 후 여과하여 준비하였
다. 농도별로 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 시료 100 μl와 DPPH 용액 100 μl를 96-well plate에 넣고 암소에 서 30분간 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 소거활성은 대조군과 실험군의 흡광도차를 대조 군의 흡광도로 나눈 값을 백분율(%)로 하여 나타내었다.
2) FeCl3에 대한 금속이온봉쇄효과: 시료를 linoleic acid- phosphate buffer system 중에서 일정농도가 유지되도록 조 제한 후 Haraguchi 등이 사용한 ferrithiocyanate 법16)을 변 형하여 실험하였다. 99.9%의 에탄올에 녹인 2.51% lino- leic acid 2.88 ml, 0.04 M phosphate buffer 9 ml, 반응액 중에 서 10−4 M과 10−3 M 농도가 되게 조제한 FeCl3 120 μl, 최종 농도 100 μg/ml가 되도록 조제한 시료액 120 μl를 합하여 총 12 ml가 되게 하였다. 이 반응액을 암소(40oC incubator)에 보관하면서 반응 3일 후 1.0 ml를 취하여 75%
에탄올 9.7 ml와 30% ammonium thiocyanate 0.1 ml를 혼합 한 다음 3.5% HCl에 녹인 0.02 M ferrus chloride를 0.1 ml 가하고 3분 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 금속이온봉쇄효과는 대조군과 실험군의 흡광도차를 대 조군의 흡광도로 나눈 값을 백분율(%)로 하여 나타내었 다.
4. 통계처리
본 실험은 독립적으로 3회 이상 반복 실시하여 실험결 과를 mean±SD로 나타내었다. 각 실험군간의 유의성은 SAS version 9.1.3 Program을 이용하여 p＜0.05 수준에서 one way ANOVA test 후 Duncan's multiple range test로 검증 하였다.
Table 2. Yield and total flavonoid contents of solvent fractions from dried H. fulva leaves
Sample Yield
(g/100 g)
Ratio (%)*
Total flavonoid (mg Que/g fraction)
Hx fr. 6.56 13.12 16.92±0.81c
CHCl3 fr. 0.09 0.17 36.49±1.66c EtOAc fr. 0.30 0.60 322.99±2.50a BuOH fr. 6.94 13.88 66.72±3.73b H2O fr. 33.11 66.23 28.75±0.95c Values are mean±SD.
*Percentage of solvent fractions to 80% ethanol extract content (49.2 g) obtained from 100 g of dried H. fulva leaves.
Quercetin (Que) was used as a standard for measuring of the total flavonoid content.
a∼cMeans with the different letters among fractions are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
Table 3. DPPH scavenging activity of solvent fractions from dried H. fulva leaves
Sample Concentration (μg/ml)
100 250 500
Hx fr. 11.27±0.64a 32.01±1.63b 62.03±0.64b CHCl3 fr. 42.68±0.65c 58.50±2.73c 74.83±1.89c EtOAc fr. 89.09±0.64e 91.44±0.55e 93.79±0.58e BuOH fr. 51.54±0.94d 73.36±1.10d 75.59±0.48d H2O fr. 13.95±1.02b 19.90±0.85a 32.82±0.17a Vitamin C 97.56±0.43f
Values are mean±SD.
a∼fMeans with the different letters among fractions are sig- nificantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
결과 및 고찰
1. 계통적 용매 추출물의 수율, 총 플라보노이드 함량 및 DPPH 소거활성
원추리 추출 시 추출액의 수율, 총 플라보노이드 함량 및 항산화성이 높은 용매의 선정을 위해, 추출용으로 주 로 사용되고 있는 용매구성을 이용하여 추출한 후 수율, 총 플라보노이드함량 및 DPPH 소거활성의 결과를 비교 하였다(Table 1). 각 용매 추출물의 수율은 물, 메탄올 및 에탄올을 비교했을 때 물 추출물의 수율이 가장 높았고, 각 유기용매에 20%, 30%의 물을 첨가했을 때는 물의 첨 가비율이 높은 쪽이 각각 수율이 더 높게 나타났다. 또한 총 플라보노이드 함량은 물 추출물이 가장 낮았고, 80%
에탄올 추출물이 가장 높게 나타났다. DPPH 소거활성에 있어서 각 추출물의 활성은 큰 차이를 보이지는 않았지 만, 80% 에탄올 추출물이 가장 우수하였다. 따라서 수율, 총 플라보노이드 함량 및 DPPH 활성을 고려하여 80%
에탄올을 본 실험의 조추출용매로 선정하였다.
2. 80% 에탄올 추출물의 용매별 분획의 수율과 총 플 라보노이드 함량
동결 건조한 원추리 분말 100 g으로부터 얻어진 80%
에탄올 추출물(49.2 g)을 다시 극성이 다른 용매인 Hx, CHCl3, EtOAc 및 BuOH로 분획했을 때 얻어진 각 분획물 의 수율은 Table 2와 같다. 80% 에탄올 추출물에 대한 비율로 환산했을 때 H2O 분획이 66.23%로 가장 수율이 높았으며, BuOH 분획과 Hx 분획은 각각 13.88%와
13.12%, EtOAc 분획과 CHCl3 분획은 0.60%와 0.17%로 가장 낮은 수율을 보였다. 본 실험에서 원추리의 경우 Hx 분획을 제외하고는 용매의 극성이 낮을수록 수율이 낮게 나타났는데 Hx 분획의 수율이 높게 나타난 것은 지질성분의 대부분이 Hx 분획에 이행되어 나타난 결과 로 생각된다. 또한 원추리 추출물의 각 용매 분획물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 EtOAc＞BuOH
＞CHCl3＞H2O＞Hx 분획 순으로 각각 322.99＞66.72＞
36.49＞28.75＞16.90 mg Que/g의 함량을 나타내어 EtOAc 분획물이 가장 높은 함량을 나타내었다(Table 2). 플라보 노이드는 C6-C3-C6를 기본골격으로 가지는 담황색 내지 노란색을 띠는 페놀계 화합물로,17) 채소류와 유관속 식 물의 잎, 꽃, 과실, 줄기, 뿌리 등 거의 모든 부위에 존재 하고 있다.18) 이러한 플라보노이드 함량과 생리활성에 대한 연구결과에서 그 함량이 많을수록 항산화, 항균 및 항염작용이 높은 것으로 확인되었고, 다양한 종류의 종 양 세포의 성장 및 분화를 저해시키는 효과가 있는 것으 로 보고되고 있다.19) 따라서 원추리 EtOAc 분획에 다량 함유되어 있는 플라보노이드계 항산화 물질이 다양한 생리활성 부분에 기여도가 클 것으로 생각된다.
3. DPPH 소거활성
원추리 80% 에탄올 추출물의 각 용매 분획물의 DPPH 소거활성은 Table 3과 같다. 각 용매 분획물 중 EtOAc 분 획물이 가장 우수한 DPPH 소거활성을 나타내어, 250 μg/
ml의 농도에서도 90% 이상의 높은 활성을 보였다. 그 다 음으로 BuOH＞CHCl3＞Hx＞H2O 분획의 순서로 활성을 보였고, 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 DPPH 소거 활성도 증가하였다. 이러한 결과는 총 플라보노이드 함 량과 DPPH 소거활성이 양의 상관관계를 가지는 것을
Table 4. Metal-ion chelating effects of solvent fractions from H. fulva leaves on 10−3 M and 10−4 M FeCl3
Sample FeCl3 concentration
10−3 M 10−4 M
Hx fr. 34.90±0.22d 77.53±0.27a
CHCl3 fr. 67.92±0.28bc 74.80±0.29b
EtOAc fr. 75.46±1.07a 66.15±0.14d
BuOH fr. 68.49±0.62b 77.86±0.28a
H2O fr. 12.73±1.17f 30.21±0.99e
α-tocopherol 23.69±0.71e 29.20±0.88f
BHA 66.89±0.53c 69.21±0.35c
Values are mean±SD.
Data was analyzed by ferrithiocyanate method on 4th of incubation at 40oC and final concentration of each sample in reaction mixture was 100 μg/ml.
a∼fMeans with the different letters among fractions are signi- ficantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
알 수 있는 결과이다. 따라서 본 실험에 사용된 원추리 잎의 EtOAc 분획물에 항산화활성이 우수한 활성성분이 가장 많이 함유되어 있을 것으로 사료된다.
4. FeCl3에 대한 금속이온봉쇄효과
원추리 용매 분획물의 금속이온에 대한 봉쇄작용을 검토한 결과는 Table 4와 같다. 10−4 M FeCl3 첨가구에서 는 BuOH, Hx, CHCl3 그리고 EtOAc 분획물 100 μg/ml를 처리한 결과 각각 77.86, 77.53, 74.80 그리고 66.15%로 65% 이상의 금속이온봉쇄효과를 보여 양성 대조군인 α- tocopherol (29.20%)보다 2배 이상의 우수한 효과를 보였 고, BHA (69.21%)와는 약간 낮거나 높은 효과를 보임을 알 수 있었다. 10−3 M 첨가구에서는 EtOAc 분획이 75.46%로 다른 분획들에 비해 높은 봉쇄효과를 나타냈 고, BHA (66.89%)보다 더 효과적임을 알 수 있었다. 금속 은 radical의 주요원천인 과산화물의 분해를 촉매하여 아 주 미량의 금속이온도 radical 생성에 효과적으로 작용한 다고 알려져 있고, 특히 산화, 환원 전위로 3가 내지 다 가 상태의 금속이온은 유도기간을 감소시켜 지질산화의 속도를 최대한 증가시키는 것으로 보고되고 있다.20) 또 한 식품 성분에 의한 금속이온의 봉쇄는 이들 이온의 작 용효과를 감소시켜 개시반응의 활성화에너지를 상승시 키며 식품중의 금속봉쇄활성물질은 금속과 시그마 결합 을 형성하여 산화환원전위를 감소시킴으로서 금속이온 의 산화된 유형을 안정화시킨다고 한다.21) 따라서 이러 한 금속이온에 대한 원추리 용매 분획물들의 봉쇄효과 는 지질산화 개시단계의 진행을 차단함으로써 항산화력
을 증강시키는 데 기여할 수 있으리라 생각된다.
결 론
원추리(Hemerocallis fulva) 지상부의 생리효능을 체계적 으로 밝히기 위한 기초자료로, 우선 항산화성분의 추출 에 적합한 용매 선정을 위해 증류수로 극성을 달리한 에 탄올과 메탄올로 추출한 후 각각의 수율, 총 플라보노이 드 함량 그리고 DPPH 소거활성을 측정 비교하였다. 그 중 80% 에탄올 추출물이 가장 높은 수율 및 총 플라보노 이드 함량을 나타내었고, DPPH 소거활성도 우수하였다.
80% 에탄올 추출물을 Hx, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 그리고 H2O로 분획한 후의 수율은 H2O 분획물이 가장 높았고 그 다음으로 BuOH, Hx 분획물 순이었다. 원추리 에탄올 추출물의 EtOAc 분획물의 총 플라보노이드 함량은 322.99 mg Que/g으로 그 함량이 가장 높았고, 100∼500 μg/ml 에서 89.09∼93.79%로 뛰어난 DPPH 소거활성을 가지고 있었다. Fe3+에 대한 금속이온봉쇄효과는 FeCl3 10−3 M에 서 100 μg/ml의 EtOAc 분획물이 75.46%의 봉쇄효과를 나타냈는데 이는 천연항산화제인 α-tocopherol (23.69%) 과 합성항산화제인 BHA의 봉쇄효과(66.89%)보다 높은 결과를 나타냈다. 이러한 결과로부터 총 플라보노이드 함량이 가장 높았던 EtOAc 분획이 항산화활성에서도 다 른 분획들에 비해 높은 결과를 보여 플라보노이드를 비 롯한 다양한 활성물질들이 EtOAc 분획에 함유되어 있음 을 확인할 수 있었다.
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