칠면초 순 추출물의 항산화 활성

(1)

48(1), 40～48(2019) https://doi.org/10.3746/jkfn.2019.48.1.040

서 론

산소를 이용하는 모든 생명체는 에너지를 생산하는 대사 과정에서 산소 부산물인 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 형성한다(1). ROS는 NADPH oxidases, xan- thine oxidase 등의 효소 작용에 의해 생성되는데, 세균이나 이물질로부터 인체를 방어하는 역할을 하거나 자기방어기 구인 생체 내 기작에 의해 제거되기도 한다(2). 하지만 ROS 의 생성이 과도해지면 산화스트레스를 초래하고, 이에 세포 막 분해, DNA 변성, 단백질 분해 등을 일으켜 피부 노화, 심혈 관 질환, 암 등 만성질환을 유발시키는 주요 원인으로 보고되 고 있다(3).

ROS는 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GPx), glutathione reductase(GR) 와 같은 항산화 효소에 의해 제거된다(4). 최근 환경오염, 고령화에 따른 각종 만성질환 발생의 증가로 항산화 작용과 같은 생리활성을 갖는 천연 생리활성 물질에 대한 관심이 높아지고 있다(5,6). 또한 여러 생리활성 소재에 대한 연구 가 지속되면서, 정화능력 등의 다양한 생리활성을 갖는 염생 식물(鹽生植物)에 관한 관심도 높아지고 있다(7).

염생식물은 염분 농도가 높은 토양에서도 잘 생육하며 다 양한 환경 변화에도 적응할 수 있다(8). 염생식물인 칠면초 (Suaeda japonica Makino)는 순천만지역에서 가장 넓게 분 포하고 있으며, 천연 미네랄의 다량 함유 및 해열 효과가 있어 약재로 사용하고 있고(9), 그중 식용 가능한 부위는 순 으로 주로 나물로 섭취한다(10). 또한 인슐린 저항성의 개선 효과와 항산화 성분이 확인되었다(11). 칠면초는 자생력과 생산성이 높아 항산화 작용의 천연소재로 이용 가능하지만 (12) 칠면초에 대한 연구는 현재 미미한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 칠면초 순(S. japonica Makino sprout)을 이용한 항산화 효능을 분석하고자 한다. 추출조

칠면초 순 추출물의 항산화 활성

김인용¹*․지석근¹*․정윤화^1,2

1단국대학교 천연물식의약소재산업화연구센터

2단국대학교 식품영양학과

Antioxidant Activity of Suaeda japonica Makino Sprout Extracts

Inyong Kim¹^*, Seokgeun Ji¹^*, and Yoonhwa Jeong^1,2

1Research Center for Industrialization of Natural Neutralization and

2Department of Food Science and Nutrition, Dankook University

ABSTRACT This study examined the antioxidant activities of Suaeda japonica Makino sprouts against oxidatively stressed HepG2 cells. S. japonica Makino sprouts were extracted using a water extract (WE), 50% ethanol extract (50EE), and 100% ethanol extract (100EE). The antioxidant activities in the extracts were measured using a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging assay, ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay, and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. The antioxidant and protective effects for hydrogen peroxide-treated HepG2 cells were evaluated based on the cell viability, intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging activity, and antioxidant enzyme activities, such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), and glutathione reductase (GR) in oxidatively stressed HepG2 cells. The highest total flavonoid and phenol contents were 6.68 mg quercetin equivalent/g and 16.67 mg gallic acid equivalent/g, respectively. The DPPH, ABTS, FRAP, and ORAC results also were highest using the 100EE. The DPPH and ABTS using the 100EE were 90.34% and 91.96% at 1,000 µg/mL, respectively.

The FRAP using the 100EE was 571.5 µmol FeSO4/g while its ORAC was 1,307.8 µmol Trolox equivalent/g. The results showed that the cell viability was increased by all the extracts. The intracellular ROS scavenging activity was increased 60.4% using 500 µg/mL of the 100EE, respectively. The SOD, CAT, GPx, and GR activities increased to 41.7%, 69.2%, 14.2%, and 31.6%, respectively, using 100EE.

Key words: Suaeda japonica Makino sprout, oxidative stress, antioxidant activity, HepG2 cell

Received 11 December 2018; Accepted 10 January 2019 Corresponding author: Yoonhwa Jeong, Department of Food Science and Nutrition, Dankook University, Cheonan, Chungnam 31116, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-41-550-3477

*These authors contributed equally to this work.

Author information: Inyong Kim (Researcher), Seokgeun Ji (Student), Yoonhwa Jeong (Professor)

(2)

건에 따른 항산화 효능의 차이를 확인하기 위하여 물과 에탄 올(50%, 100%)을 용매로 사용하였다. 이 추출물들을 이용 하여 전자공여능, 수소공여능의 측정과 인간 간암세포인 HepG2 세포에 hydrogen peroxide를 처리해 유도된 산화 적 스트레스에 대한 항산화 활성을 분석하여, 천연 생리활성 물질로 칠면초의 이용 가능성을 알아보고자 한다.

재료 및 방법

재료

본 연구에 사용된 칠면초 순은 인천광역시 중구 운염도 갯 벌에서 2015년 8월에 채취한 것으로 운염도 영농 조합에서 제공받아 시료로 사용하였다. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) radical, L-ascorbic acid, 2,2-azobis dihydrochloride, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), 2,4,6-tris(2- pyridyl)-s-triazine(TPTZ), 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate, gallic acid는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서, potassium persulfate, aluminum chloride hexahydrate, iron(Ⅲ) chloride hexahydrate는 대정화금(시 흥, 한국)에서 구매하였다.

추출물 제조

칠면초 순을 암소에서 건조한 후 그라인더를 사용하여 분 말로 만들어 물과 에탄올로 추출하였다. 물 추출물은 건조된 시료 150 g에 증류수 1.5 L를 넣고 98°C에서 4시간 환류 추출하고, 에탄올 추출물은 동일한 시료량에 50%와 100%

에탄올을 이용하여 78°C에서 4시간 환류 추출하였다. 추출 된 샘플들은 감압 여과하여 농축기(R-3000, BuCHI Labor- technik, Flawil, Switzerland)로 농축한 후 동결건조기(FD 8505, Ilshin Lab Co., Dongducheon, Korea)로 건조하여 분말 시료로 사용하였다.

항산화 성분 측정

칠면초 순의 총 플라보노이드 함량은 건강기능식품공전 시험법 해설서의 방법을 응용하여 측정하였다(13). 50 mg/

mL의 각 추출액 40 μL에 증류수 24 μL와 에탄올 120 μL를 넣고 희석하였다. 10% aluminum nitrate와 1 M potassium acetate를 각각 8 μL씩 첨가하고 40분 동안 빛을 차단한 상태로 방치하였다. 샘플들은 Microplate reader(Spectra max M2, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용 하여 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin(0~200 µg/mL)을 이용해 표준 검량선을 작성한 후, 추출물의 총 플라보노이드 함량을 1 g당 mg quercetin equivalent(mg QE/g)로 나타내었다.

총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 Singleton 등(14) 의 방법에 따라 측정하였다. 50 mg/mL의 각 추출액 2 μL에

증류수 158 μL를 넣고 희석한 후 2 N의 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent를 10 μL 첨가하였다. 20% Na₂CO₃ 용액 30 μL를 가한 후 빛을 차단하여 2시간 동안 방치하였다.

샘플들은 microplate reader(Spectra max M2, Molecular Devices)를 이용하여 765 nm 파장에서 흡광도를 측정하였 다. 표준물질로 gallic acid(0~1,000 μg/mL)를 이용해 표준 검량선을 작성한 후 추출물의 총 페놀 함량을 시료 1 g당 mg gallic acid equivalent(mg GAE/g)로 나타내었다.

항산화 활성 측정

칠면초 순의 항산화 활성을 in vitro에서 측정하기 위하여 DPPH와 ABTS의 라디칼 소거능과 ferric reducing antioxidant power(FRAP), oxygen radical absorbance capacity(ORAC)를 통한 항산화 능력을 분석하였다. DPPH 라 디칼 소거 활성은 Blois의 방법을 응용하여 측정하였다(15, 16). 0.15 mM DPPH 용액 160 μL에 시료 40 μL를 넣고 30분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성은 Re 등(17)의 방법을 응용하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate 용액을 섞어 빛을 차단한 상태로 16시간 동안 방치 하여 라디칼을 형성시켰다. 실험 직전에 ABTS 라디칼 용액 을 734 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 될 때까지 증류수 로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 200 μL와 시료 50 μL를 혼합하여 3분 동안 방치한 후 microplate reader(Spectra max M2, Molecular Devices)를 이용하여 734 nm에서 흡 광도를 측정하였다.

FRAP는 Benzie와 Strain(18)의 방법을 응용하여 측정하 였다. 0.3 M sodium acetate buffer(pH 3.6), 증류수에 녹 여 만든 20 mM FeCl₃･6H₂O, 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ를 혼합하여 37°C에서 15분간 활성화시켜 FRAP reagent으로 사용하였다. FRAP reagent 290 μL와 시료 10 μL를 혼합하여 37°C에서 15분간 빛을 차단시켜 반응시 킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ORAC법은 형광물질을 이용하여 과산화기의 소거 활성 을 측정하는 것으로, Ou 등(19)의 방법으로 측정하였다. 10 µg/mL 농도의 시료 50 µL와 75 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 녹인 78 nm fluorescein 용액 50 μL를 섞어 37°C에 서 10분간 방치하였다. 방치 후 221 mM 2,2’-azobis(2- methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH) 25 μL 를 첨가하여 excitation 485 nm, emission 535 nm 파장에 서 2분마다 연속적으로 형광도를 측정하였다.

산화스트레스 억제 활성 측정

HepG2 세포배양: HepG2 세포는 Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 10% fe- tal bovine serum(FBS)과 1% penicillin-streptomycin, 4 mM L-glutamine, 4,500 mg/L glucose, sodium pyruvate

(3)

가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 in- cubator에서 37°C로 배양하였다.

MTT assay에 의한 세포생존율 분석: 3-(4,5-Dimeth- yl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)를 이용하는 방법으로 칠면초 추출물이 과산화수소 로 산화스트레스를 유발시킨 HepG2 세포의 생존율에 미치는 영향을 측정하였다. 96-well plate에 세포를 2×10⁴cells/

well이 되도록 분주하고 24시간 동안 37°C에서 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 10%(v/v) FBS를 포함한 DMEM 배지 198 μL와 시료 2 μL를 넣어 시료의 최종 농도가 50~

500 μg/mL가 되도록 하였다. 그리고 최종 농도가 1 mM H₂O₂가 되도록 처리하여 24시간 동안 배양하면서 산화스트 레스를 유도하였다. 배지를 제거하고 PBS에 MTT를 넣어 50 μg/mL로 각 well에 200 μL를 넣은 뒤 4시간 동안 배양 하였다. MTT 용액을 제거하고 200 μL DMSO를 넣어 for- mazan crystal이 완전히 용해되면 550 nm에서 흡광도를 측정하였다(20).

세포 내 활성산소종(ROS) 소거 활성: 세포 내 ROS 소거 활성은 2,7-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA) 방법 을 이용하여 측정하였다. HepG2 세포를 96-well plate에 2×10⁴cells/well이 되도록 분주하고 37°C에서 24시간 동 안 5% CO₂ incubator를 이용하여 배양하였다. 배양 후 배지 를 제거하고 DMEM 배지 198 μL와 시료 2 μL를 넣어 시료 의 최종 농도가 50~500 μg/mL가 되도록 한 후, 1 mM 농도 로 H₂O₂를 처리하여 1시간 동안 산화스트레스를 유도하였 다. 그 후 20 μM DCFH-DA 용액을 처리한 후 45분 동안 방치하여 fluorescence microplate reader(Spectra max M2, Molecular Devices)를 이용하여 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광도를 측정하였다.

항산화 효소 활성 측정: HepG2 세포에서의 항산화 지표 효소인 SOD, CAT, GPx, GR을 대상으로 활성을 측정하였 다. HepG2 세포를 96-well plate에 2×10⁴cells/well이 되도록 분주하여 배양하였고, 시료 50~500 μg/mL와 1 mM H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 주고 enzyme assay kit (BioVision, San Francisco, CA, USA)을 이용하여 측정하 였다. CAT와 SOD 활성을 측정하기 위해서 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) buffer로 용해한 세포를 14,000×g로 5분 동안 원 심분리 한 후 상층액을 시료로 사용하였다. 96-well plate 에 시료 20 μL, WST working solution 200 μL, dilution buffer 20 μL, enzyme working solution 20 μL를 넣고 37°C에서 20분간 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정 하였다. GR activity와 GPx activity는 HepG2 세포에서 GPx 활성을 측정하기 위해서 assay buffer로 용해한 세포 를 10,000×g로 15분 동안 원심분리 한 후 상층액을 시료로 사용하였다. 96-well plate에 시료 40 μL, assay buffer 10 μL, reaction mix 40 μL를 넣고 15분 동안 반응시킨 후 cumene hydroperoxide solution 10 μL를 넣고 혼합하였 다. 혼합된 용액은 340 nm에서 흡광도를 측정하였고, 25°C

에서 30분간 반응시킨 후 다시 측정하였다.

통계처리

측정값은 모두 3회 반복하여 평균±표준편차로 나타내었 고, Minitab 16(Minitab Inc., State College, PA, USA)을 이용하여 통계처리 하였다. 실험 결과는 일원분산분석으로 비교하였고 Fisher’s 비교검정법을 통해 유의차(P<0.05)를 검정하였다.

결과 및 고찰

항산화 성분 함량

칠면초 순의 추출수율은 Table 1과 같다. 물 추출물(WE) 이 30.9%로 가장 높고, 50% 에탄올 추출물(50EE)이 23.8

%, 100% 에탄올 추출물(100EE)이 17.6% 순으로 측정되었 다. 두릅 순 추출물의 수율은 물 추출물이 에탄올 추출물과 비교하였을 때 2.5% 높게 측정된 결과와 유사하였다(21).

칠면초 순 추출물 동결건조 분말 시료의 총 플라보노이드 및 페놀 함량은 Table 2와 같다. 시료 1 g당 quercetin mg 상당량으로 나타낸 총 플라보노이드의 함량은 3.20~6.68 mg QE/g으로, 100% 에탄올 추출물(100EE)이 6.68 mg QE/g으로 가장 높았으며, 50% 에탄올 추출물(50EE)이 6.08 mg QE/g, 물 추출물(WE)이 3.20 mg QE/g을 나타내었다 (Table 2). Lee 등(12)의 연구에 의하면 칠면초의 성분 분석 에 관한 연구에서는 칠면초 전초를 70% 에탄올로 3시간 동 안 추출한 결과 상압가열 건조한 칠면초 추출물 고형분의

Table 1. Extraction yields of Suaeda japonica Makino sprout by water and ethanol

Samples¹⁾ Yield (%)²⁾ WE

50EE 100EE

30.9 23.8 17.6

1)WE: distilled water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50%

ethanol extract of S. japonica Makino; 100EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino.

2)The values are percent (w/w) from the raw material (100%).

Table 2. Contents of total flavonoid and total phenol of S. japon- ica Makino sprout extracts

Samples¹⁾ Total flavonoid content (mg QE/g)²⁾

Total phenol content (mg GAE/g)³⁾ WE

50EE 100EE

3.20±0.14^c 6.08±0.15^b 6.68±0.27^a

7.15±0.26^c 9.47±0.11^b 16.67±0.27^a

2)mg QE/g: mg quercetin equivalent per sample 1 g.

3)mg GAE/g: mg gallic acid equivalent per sample 1 g.

Values are mean±SD (n>3 independent experiments).

Means with different letters (a-c) in the same column are sig- nificantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(4)

총 플라보노이드 함량이 2.69 mg QE/g으로 보고하였다.

이는 본 연구에서 가장 낮은 함량을 나타낸 WE(3.20 mg QE/g)보다도 낮은 함량을 나타내는데, 본 연구와 비교해 볼 때 추출시간(3시간, 4시간)과 추출 부위(전초, 순)의 차이로 보인다. 칠면초 순 추출물 분말 시료의 총 페놀 함량은 시료 1 g당 gallic acid mg 상당량으로 표기하였고, 총 페놀 함량 은 7.15~16.67 mg GAE/g이었다. 100EE가 16.67 mg GAE/g으로 가장 높았으며, 50EE가 9.47 mg GAE/g, WE 가 7.15 mg GAE/g을 나타내었다(Table 2).

총 플라보노이드 및 페놀 함량 모두 100EE, 50EE, WE 순으로 높게 나타났으며, Wijekoon 등(22)의 보고에 의하 면 페놀 화합물의 추출 수율은 용매의 극성에 따라 달라진다 고 보고하였다. Ballesteros 등(23)의 연구에서는 추출용매 에 따른 커피열매 silverskin의 페놀 화합물 함량이 물(7.00 mg GAE/g)에 비해서 에탄올(12.81 mg GAE/g), 이소프로 판올(13.20 mg GAE/g)의 유기용매에서 페놀 화합물의 추 출 수율이 높았다고 보고하였다. 염생식물 중 하나인 퉁퉁마 디의 총 페놀 함량에 관한 연구에서는 퉁퉁마디 에탄올 추출 물을 동결건조 한 분말 시료의 총 페놀 함량이 11.40 mg GAE/g이었고(24), 다양한 염생 식물의 메탄올 추출물에 대 한 생리활성 연구에서는 해홍나물(16.7 mg GAE/g), 갯완 두(15.8 mg GAE/g), 갯개미취(14.0 mg GAE/g), 갯그령 (19.1 mg GAE/g) 등이 칠면초(19.8 mg GAE/g)보다 총 페놀 함량이 낮았으나 갯질경(117.5 mg GAE/g), 해당화 (145.6 mg GAE/g), 갯능쟁이(129.5 mg GAE/g) 등은 칠면 초보다 총 페놀 함량이 높다고 보고되었다(25).

대부분 식물들의 항산화 활성은 플라보노이드와 같은 페 놀 화합물에 의해서 기인된다. 페놀 화합물은 방향족 고리에 결합된 hydroxyl 그룹에 따라 다양한 항산화 활성이 나타난 다(26). 식물의 플라보노이드 성분 섭취로 심혈관 질환 위험 을 줄일 수 있고, 활성산소종 소거로 세포 내 산화스트레스 를 억제할 수 있으므로 식물에 함유된 페놀 화합물은 항산화 작용에 중요한 역할을 할 것이다.

항산화 활성

칠면초 순의 항산화 활성을 in vitro에서 측정하기 위하여

DPPH와 ABTS의 라디칼 소거능과 FRAP, ORAC를 통한 항산화 능력을 분석하였다. 칠면초 순의 DPPH 라디칼 소거 활성은 100EE 1,000 µg/mL 농도에서 90.34%로 가장 높았 고, 50EE에서는 76.39%, WE에서는 53.96%로 가장 낮았 다(Table 3). EC₅₀값은 DPPH 라디칼 소거 활성과 반비례 관계로 값이 적을수록 높은 활성을 의미하는데, WE의 EC50

값이 910.5 µg/mL를 나타내었으나 100EE에서는 206.8 µg/mL로 가장 높은 활성을 나타냈다.

Cho 등(27)의 연구에서 칠면초로부터 18가지의 항산화 물질을 분리 정제하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 20 µM 농도일 때 luteolin, quercetin의 활성이 약 80%로 18가지 물질 중에서 가장 높았고, 칠면초 추출물 분 말 1 kg 중 luteolin의 함량은 8.4 mg이며 quercetin의 함량 은 16.6 mg이었다. Luteolin과 quercetin은 모두 플라보노 이드의 일종으로 ascorbic acid 표준물질보다 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈고, 그 외에도 isorhamnetin, kaempferol, syringic acid 등의 항산화 물질이 칠면초에 함유되어 있다. 본 연구에서도 플라보노이드 함량이 가장 많은 100EE에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 높았고, luteo- lin과 quercetin 등이 영향을 준 것으로 판단된다.

칠면초 순의 ABTS 라디칼 소거 활성은 100EE 1,000 µg/

mL 농도에서 91.96%로 가장 높았고, 50EE에서는 78.84

%, WE에서는 66.86%로 가장 낮았다(Table 4). Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)가 높을수록 시료 1 g에 상당하는 Trolox의 양이 많기 때문에 ABTS 라디칼 소거 활성이 높다는 것으로 의미하는데, WE의 TEAC 값이 35.25 µmol TE/g을 나타낸 반면에 100EE에서는 56.59 µmol TE/g으로 가장 높은 활성을 보였다(Table 4). ABTS 라디칼 소거 활성도 DPPH 라디칼 소거 활성과 마찬가지로 100EE, 50EE, WE 순으로 높았고, 가장 활성이 높은 100 EE(56.59 µmol TE/g)와 ascorbic acid 표준시료(929.15 µmol TE/g)의 TEAC 값을 비교해보았을 때 100EE가 ascorbic acid 표준시료보다 약 1/16의 활성을 나타내었다.

ABTS와 DPPH 라디칼 소거능으로 본 칠면초 추출물의 전 자공여능은 100EE가 가장 높았다.

FRAP와 ORAC 방법에 의한 라디칼 소거 활성은 Table Table 3. DPPH radical scavenging activity of S. japonica Makino sprout extracts (%)

Samples¹⁾ Concentration (µg/mL)

EC50 (µg/mL)²⁾

125 250 500 1,000

WE 50EE 100EE

5.95±0.71^Dd 10.58±1.94^Cd 44.09±0.38^Bd

14.32±0.71^Dc 21.63±1.51^Cc 53.86±0.18^Bc

28.96±0.27^Db 40.76±1.45^Cb 65.65±0.10^Bb

53.96±0.71^Da 76.39±1.30^Ca 90.34±0.54^Ba

910.5±10.9Â 642.1±14.6^B 206.8±10.2^C Ascorbic acid 94.30±0.01Âa 95.53±0.03Âa 94.50±0.01Âa 94.33±0.02Âa 27.6±0.2^D

1)WE: distilled water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino.

2)EC50 means the concentration of compound that gives 50% of its maximal effect.

Means with different small letters (a-d) in the same row are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

Means with different capital letters (A-D) in the same column are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(5)

5와 같다. FRAP 측정에서는 100EE가 571.5 µmol FeSO₄/ g으로 가장 높았고, 50EE에서는 340.8 µmol FeSO₄/g, WE 에서는 253.5 µmol FeSO₄/g으로 가장 낮았다. Ascorbic acid 표준물질의 FRAP 값은 18,356.9 µmol FeSO₄/g으로 100EE(571.5 µmol FeSO4/g)보다 약 32배 이상 높았다.

Choi 등(9)의 연구보고에 의하면 칠면초의 메탄올 추출물 (124.0 µmol FeSO₄/g), 에틸아세테이트 추출물(398.0 µmol FeSO₄/g), 부탄올 추출물(484 µmol FeSO₄/g) 등 유기용매 추출물에서 무기용매인 물 추출물(54.0 µmol FeSO4/g)보 다 FRAP 활성이 높다고 보고하였다. Choi 등(28)의 수확계 절에 따른 칠면초 추출물의 생리활성 연구에서는 핵산 추출 물의 분말 시료에서 FRAP 활성이 약 500~800 µmol FeSO₄/ g이었고, 물 추출물 시료에서는 200 µmol FeSO₄/g 이하였 다. 본 연구에서도 WE에 비해서 50EE, 100EE가 FRAP 활 성이 높았고, 유기용매 추출물이 무기용매 추출물보다 전자 환원력을 갖는 항산화 성분의 함량이 높을 것으로 생각된다.

칠면초 순의 ORAC 측정에서는 100EE가 1,307.8 µmol TE/g으로 가장 높았고, 50EE에서는 1,220.5 µmol TE/g, WE에서는 1,159.9 µmol TE/g으로 가장 낮았다. Ascorbic acid 표준물질의 ORAC값은 14,264.0 µmol TE/g으로 100 EE(1,307.8 µmol TE/g)보다 약 10배 이상 높았다. Perez- Jimenez와 Saura-Calixto(29)의 연구에 의하면 페놀 화합

물인 catechin과 gallic acid 혼합물의 용매에 따른 ORAC 측정 결과 100% 메탄올(20,836.6 µmol TE/g), 50% 메탄 올(18,284.6 µmol TE/g), 물(13,543.6 µmol TE/g) 순으로 높았고, 극성이 적은 용매일수록 ORAC 활성이 높다고 보고 하였다. 또한 Villano 등(30)의 연구에서는 와인에 함유된 페놀 화합물과 대사물질의 항산화 활성을 비교한 결과, ORAC는 quercetin, (-)-epicatechin 등과 같이 hydroxyl 그룹을 포함하고 있는 샘플에서 플라보노이드 성분들이 높 았다고 보고하였는데, 본 연구에서도 quercetin 상당량으로 나타낸 총 플라보노이드 함량이 가장 많았던 100EE에서 ORAC 활성이 가장 높았다.

HepG2 세포에서의 산화스트레스 억제 활성

HepG2 세포생존율: 본 실험에서는 칠면초 순 추출물에 의한 세포 보호 효과를 알아보기 위해 MTT 측정방법을 이 용하여 세포생존율을 확인하였다. Fig. 1과 같이 HepG2 세 포에 과산화수소를 처리하여 산화스트레스를 유도하였을 때 약 30%의 세포가 사멸하였다. 같은 조건의 세포에 다양 한 농도의 칠면초 순 추출물 동결건조 분말 시료를 처리하였 을 때의 세포사멸 억제능력을 측정하기 위해 시료의 농도는 세포독성 평가를 통해서 세포에 독성이 나타나지 않은 500 µg/mL 이하의 범위로 정하였다. 100EE, 50EE, WE 모두 500 µg/mL 이하의 농도 범위에서 농도 의존적으로 과산화 수소에 의해 유발된 세포사멸을 억제시켰고, 그중 100EE에 서 세포사멸 억제 활성이 가장 높았다(Fig. 1). 과산화수소 에 의해 유발된 세포사멸 억제 활성은 100EE, 50EE, WE 순이었고 이 결과는 in vitro 항산화 활성의 결과와 같은 경 향성을 나타내었다.

세포 내 활성산소종 억제 활성: 세포 내 활성산소종(ROS) 는 호흡 등의 대사과정에서 자연스럽게 생기지만, 노화 및 산화스트레스로 밸런스가 불안정화되면 ROS의 양이 많아 져 DNA의 손상, 단백질의 변성, 세포막 지질의 산화 등을 일으켜 염증 유발 인자의 발현 촉진과 세포호흡에 관한 산화 환원효소의 반응 억제 등의 작용을 일으켜 세포사멸을 유도 한다(3). 세포사멸을 예방하기 위해서는 세포 내 ROS 형성 을 억제하는 것이 중요하다.

Table 4. ABTS radical scavenging activity of S. japonica Makino sprout extracts

Samples¹⁾ Concentration (µg/mL) TEAC

(µmol TE/g)²⁾

125 250 500 1,000

WE 50EE 100EE

18.69±0.67^Dd 23.76±0.16^Cd 32.41±0.24^Bd

26.49±0.30^Dc 34.13±0.17^Cc 42.39±0.37^Bc

42.28±0.32^Db 52.97±0.06^Cb 63.00±0.46^Bb

66.86±0.31^Da 78.84±0.42^Ca 91.96±0.26^Ba

35.25±0.40^D 45.51±0.22^C 56.59±0.50^B Ascorbic acid 94.16±0.02Âa 94.15±0.06Âa 94.10±0.10Âa 94.10±0.07Âa 929.15±10.32Â

1)WE: distilled water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino.

2)TEAC: µmol Trolox equivalent capacity per sample 1 g.

Means with different small letters (a-d) in the same row are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

Means with different capital letters (A-D) in the same column are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

Table 5. FRAP and ORAC of S. japonica Makino sprout extracts Samples¹⁾ FRAP

(µmol FeSO4/g)²⁾

ORAC (µmol TE/g)³⁾ WE

50EE 100EE

253.5±7.7^c 340.8±7.3^c 571.5±9.4^b

1,159.9±45.6^c 1,220.5±18.8^bc 1,307.8±15.9^b Ascorbic acid 18,356.9±234.2^a 14,264.0±145.2^a

2)µmol FeSO4/g: µmol iron sulfate (Ⅱ) equivalent per sample 1 g.

3)µmol TE/g: µmol Trolox equivalent per sample 1 g.

Means with different letters (a-c) in the same column are sig- nificantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(6)

세포 내 산화스트레스에 의해 발생하는 ROS 생성에 대한 칠면초 순 추출물의 억제 활성을 알아보았다. HepG2 세포에 과산화수소로 산화스트레스를 유도한 후 DCF-DA probe 를 이용하여 ROS에 따른 형광 발색 정도를 측정하였다. Fig.

2에 나타낸 것과 같이 100EE, 50EE, WE 모두 500 µg/mL 이하의 농도 범위에서 농도 의존적으로 ROS 억제 활성을

나타냈고, 500 µg/mL의 100EE에서 활성이 가장 높았다.

과산화수소와 시료의 비처리군인 control을 100%로 볼 때 과산화수소 처리군의 ROS 형성 정도는 167.6%였고, 500 µg/mL 농도의 시료 처리에 의한 ROS 소거 활성은 100EE가 107.2%, 50EE가 132.7%, WE가 140.4%를 나타내었다. 과 산화수소로부터 유도된 ROS의 소거 활성은 100EE, 50EE, WE 순이었고 이는 세포생존율의 결과값과도 같은 경향을 나타내었다.

세포 내에서 생성된 과산화수소는 ROS를 형성시켜서 세 포에 산화스트레스를 유발하는데 ROS는 superoxide radical, peroxyl radical, peroxynitrite 등 다양한 형태로 존재 한다(3). Lee 등(31)의 연구에 의하면 염생식물의 peroxynitrite 소거 활성은 칠면초 메탄올 추출물에서 73.23%의 소거 활성을 나타냈고, Hayakawa와 Agarie(32)의 연구에 서는 칠면초에서 추출한 베타시아닌(betacyanin) 성분이 과 산화수소에 의한 산화작용을 억제한다고 보고하였다. 본 연 구에서도 ORAC 측정을 통해 ROS의 일종인 peroxyl radi- cal에 대한 칠면초 순 추출물의 소거 활성을 확인하였고, HepG2 세포 내에서 발생한 ROS에 대한 소거 활성의 결과 ROS의 감소로 세포생존율 또한 증가하였다고 생각된다.

항산화 효소 활성: HepG2 세포에 과산화수소로 산화스 트레스를 유도했을 때 이에 대응하는 항산화 효소의 활성을 알아보기 위해 SOD, CAT, GPx, GR의 활성을 측정하였다.

칠면초 추출물은 세포생존율이 가장 높았던 500 µg/mL 농 도의 시료로 사용하였다. 추출물로 전 처리한 세포에 과산화 수소에 의한 산화스트레스를 유도한 결과, SOD의 활성은 100EE, 50EE, WE 순으로 높은 활성을 나타냈다(Fig. 3).

과산화수소와 시료 비처리군인 control을 100%로 볼 때 과 산화수소 처리군의 SOD 활성은 63.9%로 감소하였으나, 100EE에서 105.6%, 50EE에서 92.3%, WE에서 83.3%로

0 20 40 60 80 100 120

Control H2O2 WE 50EE 100EE

Suaeda japonica Makino extract (500 μg/mL)

SOD activity (% of control) .

H2O2

b a

c d

e

Fig. 3. Effect of S. japonica Makino sprout extracts on super- oxide dismutase (SOD) activity in H2O2-treated HepG2 cells.

Control, group of non-treated samples; H2O2, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; WE, water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100 EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-e) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

0 20 40 60 80 100 120

Control -

H2O2 +

WE +

50EE +

100EE + Cell viability (% of control) . ^{50 μg/mL} ^{125 μg/mL}

250 μg/mL 500 μg/mL

Control H2O2 WE 50EE 100EE H2O2 (1 mM) - + + + +

a

c b cd b d cbc de bcb cdebc e

Fig. 1. Cytotoxic effects of S. japonica Makino sprout extracts against H2O2-induced oxidative stress in HepG2 cells. HepG2 cells were exposed to various concentrations of S. japonica Makino extracts and hydrogen peroxide (1 mM H2O2) for 24 h. The cell viability was determined by MTT assay. Control, group of non-treated samples; H2O2, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; WE, water extract of S. japonica Makino;

50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100EE, 100%

ethanol extract of S. japonica Makino. Values are mean±SD (n>

3 independent experiments). Statistically significantly different letters (a-e) when compared with each extract included control and H2O2 (P<0.05, one-way ANOVA followed by Fisher’s LSD).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Control -

H2O2 +

WE +

50EE +

100EE + ROS formation (% of control) . 50 μg/mL 125 μg/mL

250 μg/mL 500 μg/mL

Control H2O2 WE 50EE 100EE H2O2 (1 mM) - + + + +

d bcbcdcd

c b bcbc c b abbc ab a

Fig. 2. Intracellular ROS scavenging activity of S. japonica Makino sprout extracts. The intracellular ROS was detected by the DCF-DA method. Fluorescence of DCF produced by ROS in H2O2 treated HepG2 cells were compared to the control and the cells treated with various concentration of S. japonica Makino extracts in presence of H2O2. Control, group of non-treated samples; H2O2, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide;

WE, water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Statistically significantly different letters (a-d) when compared with each extract included control and H2O2

(P<0.05, one-way ANOVA followed by Fisher’s LSD).

(7)

증가하였다. 시료를 처리한 HepG2 세포의 SOD 활성이 과산 화수소 처리군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(P<0.05).

CAT 활성은 과산화수소 처리군에서는 산화스트레스 유 발로 CAT 활성이 41.1%로 감소하였으나, 500 µg/mL 농도 의 100EE에서 110.3% 증가하였고, 50EE에서는 66.9%, WE에서는 42.3%의 활성을 보였다(Fig. 4). 100EE와 50EE 를 처리한 HepG2 세포의 CAT 활성은 과산화수소 처리군 과 비교하여 유의적으로 증가하였지만, WE를 처리한 군에 서는 유의한 차이를 보이지 않았다(P<0.05). Alia 등(33)의 연구에서는 플라보노이드 성분인 quercetin이 산화스트레 스가 유발된 HepG2 세포의 CAT 활성에 영향을 미친다고 보고하였다. 칠면초는 quercetin, luteolin, kaempferol 등 의 플라보노이드 성분을 함유하고 있기 때문에 산화스트레 스에 의한 효소 활성 저해 효과가 있을 것으로 생각된다(27).

GPx 활성은 과산화수소 처리군에서는 54.2%로 감소하 였으나, 500 µg/mL 농도의 100EE에서 68.4%, 50EE에서 68.3%, WE에서 65.7%로 증가하였다(Fig. 5). 100EE, 50 EE, WE를 처리한 HepG2 세포의 GPx 활성은 과산화수소 처리군과 비교하여 모두 유의적으로 증가했지만, 100EE, 50EE, WE 간에는 유의한 차이를 보이지 않았다(P<0.05).

Jin 등(34)의 연구에서도 잣피 추출물의 GPx 활성이 물 추 출물과 20% 에탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물과 비교하였 을 때 20% 추출물이 가장 높게 측정되어 추출용매 및 농도 와 무관하게 나타나는 결과도 존재하였다.

GR 활성은 과산화수소 처리군에서는 56.7%로 감소하였 으나, 500 µg/mL 농도의 100EE에서는 88.3%, 50EE에서 91.3%, WE에서 94.6%로 증가하였다(Fig. 6). 100EE, 50 EE, WE를 처리한 HepG2 세포의 GR 활성은 과산화수소 처 리군과 비교하여 모두 유의적으로 증가했지만, 100EE, 50

EE, WE 추출물 간의 GR 활성은 유의한 차이가 없었다(P<

0.05). GR은 산화형 glutathione(GSSG)을 환원형 glutathione(GSH)으로 환원시켜 세포의 항산화 작용을 도와주고 낮은 비율의 GSH/GSSG는 질병과도 연관되어 있다(35).

Samiec 등(36)의 연구에 의하면 당뇨병과 황반변성증과 같 은 질병 보유자의 혈액에 있는 GSH/GSSG의 비율이 비보유 자보다 낮았고, 60세 이하인 사람들보다 60세 이상인 사람 들에게서 GSH/GSSG 비율이 더 낮다고 보고되었다. 또한, 세포 내 낮은 비율의 GSH/GSSG는 알츠하이머병, 암, 파킨 슨병, 간 질환 등의 질병들과 연관되어 있다(37). 본 연구에 서는 과산화수소로부터 산화스트레스가 유발된 HepG2 세

0 20 40 60 80 100 120

Suaeda japonica Makino extract (500 μg/mL) H2O2

Catalase activity (% of control) .

b

a

c

d d

Fig. 4. Effect of S. japonica Makino sprout extracts on catalase (CAT) activity in H2O2-treated HepG2 cells. Control, group of non-treated samples; H2O2, group of treatment with 1 mM hy- drogen peroxide; WE, water extract of S. japonica Makino; 50 EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100EE, 100%

ethanol extract of S. japonica Makino. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

0 20 40 60 80 100 120

GPx activity (% of control) .

H2O2

a

b b b

c

Fig. 5. Effect of S. japonica Makino sprout extracts on gluta- thione peroxidase (GPx) activity in H2O2-treated HepG2 cells.

Control, group of non-treated samples; H2O2, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; WE, water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100 EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

0 20 40 60 80 100 120

GR activity (% of control) .

H2O2

a

b b ab

c

Fig. 6. Effect of S. japonica Makino sprout extracts on gluta- thione reductase (GR) activity in H2O2-treated HepG2 cells.

Control, group of non-treated samples; H2O2, group of treatment with 1 mM hydrogen peroxide; WE, water extract of S. japonica Makino; 50EE, 50% ethanol extract of S. japonica Makino; 100 EE, 100% ethanol extract of S. japonica Makino. Values are mean±SD (n>3 independent experiments). Means with different letters (a-c) above the bars are significantly different at P<0.05 (Fisher’s LSD).

(8)

포에서 칠면초 순 추출물에 의해 GR 활성이 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 칠면초 순 추출물이 GR 활성에 영향을 미쳐서 적정비율의 GSH/GSSG를 유지하는 데 도움이 되고, 세포의 산화스트레스에 대한 저항 능력이 증가되어 세포생존율이 증가한 것으로 예상된다.

요 약

본 연구는 칠면초 순을 물(WE), 50% 에탄올(50EE), 100%

에탄올(100EE)로 추출하여 각 시료의 전자공여능과 수소공 여능 측정을 통한 항산화 활성 및 인간 간암세포인 HepG2 세포를 이용하여 활성산소종의 억제 활성과 항산화 효소 활 성을 조사하였다. 칠면초 순 추출물의 총 플라보노이드 및 총 페놀 함량은 100EE에서 가장 많았고, hydrogen atom transfer와 electron transfer에 의한 항산화 활성도 모두 100EE, 50EE, WE 순으로 높았다. 칠면초 순 추출물은 과 산화수소에 의해 산화스트레스를 유발시킨 HepG2 세포의 세포생존율을 증가시켰고, 100EE에서 가장 높은 세포생존 율을 나타내었다. 세포 내 활성산소종 소거 활성과 항산화 효소 중 SOD, CAT 활성이 100EE 추출물을 처리 HepG2 세포에서 가장 높게 증가하였고, GPx와 GR 활성은 100EE, 50EE, WE 간에 유의적 차이가 없었지만 모두 효소 활성을 증가시켰다. 칠면초 순 추출물의 전자공여능, 수소공여능과 과산화수소를 처리한 HepG2 세포를 이용하여 항산화 활성 을 확인하였고, 이러한 항산화 작용을 통해서 간세포의 산화 스트레스에 대한 보호 효과가 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구는 농림축산식품부 농림축산식품연구센터지원사업 (과제번호 714001-07-5-SB110)에 의해 수행되었으며 이 에 감사드립니다.

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