Ingredients of Antioxidant Activity from Calyx of Diospyros kaki Thunberg

(1)

Kor. J. Pharmacogn.

45(1) : 35∼ 40 (2014)

35

감꼭지의 항산화 활성 성분

차배천^*

상지대학교 보건과학대학 제약공학과

Ingredients of Antioxidant Activity from Calyx of Diospyros kaki Thunberg

Bae Cheon Cha*

Department of Pharmaceutical Engineering, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 220-702, Korea

Abstract − In this study, in order to search for new functional materials from natural products, was carried out the study of antioxidant active ingredients in persimmon calyx(calyx of Diospyros kaki Thunberg). I have experimented with the effect of antioxidant activity of five different extract(MeOH, n-hexane, EtOAc, n-BuOH and H₂O extract) obtained from persimmon calyx. As a result, the butanol extract, that is the main component fraction of antioxidant activity was found. Three compounds were isolated by silica gel column chromatography from the n-BuOH extract of persimmon calyx. Their structures of compound 1, 2 and 3 isolated from n-BuOH extract of persimmon calyx were identified as quercetin, (+)-catechin and gallic acid by using the TLC, ¹H-NMR and ¹³C-NMR.

Key words − Calyx of Diospyros kaki Thunberg, Antioxidant activity, Quercetin, (+)-Catechin, Gallic acid

인체는 생명유지에 필요한 에너지를 만들기 위해 끊임없 이 산소를 필요로 하며 에너지를 만드는 호흡과정에서 흡 입되어진 산소 중 일부분(약 2-3%)은 활성산소라고 불리어 지는 물질로 전환되어 생체에 특이한 반응을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾이러한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에는 체내 효소계, 환원대사 등에 의해 생성되는 일중 항산소(¹O₂)나 superoxide(O₂·)와 같은 free radical과 과산화 수소(H₂O₂)나 lipid peroxide (ROOH) 등으로서 이들은 분 자 구조적으로 매우 불안정하기 때문에 고분자의 생체내 세 포성분들을 공격하여 쉽게 산화적 스트레스의 환경을 조성 하기도 하며,^2,3) 다양한 성인병 질환의 유발과도 연관되어져 있는 것으로 알려져 있다.^4-7)따라서 생체내의 활성산소종을 제어하는 것이 질병 예방을 위한 중요한 대응책 중 하나이 며 이의 대표적 물질중의 하나가 항산화제이다. 항산화제는 크게 천연 항산화제와 합성 항산화제로 나누어지며, 천연 항산화제로는 식품의 가공 또는 저장 중 발생되는 산화를 방지하기 위하여 널리 사용되는 vitamin E, C 등으로서 이 들은 안전성은 높으나 단독으로는 산화반응 저지능이 약하 고 가격이 고가인 단점이 있다.⁸⁾반면에 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole(BHA)과 butylated hydroxytoluene

(BHT)은 효과는 우수하나 페놀계 합성 항산화제의 안전성 으로 인하여 그 사용이 점차 감소되고 있는 추세이다.^9-11)이 에 천연물질이나 약용식물로부터 합성 항산화제를 대체할 수 있는 부작용이 적고 항산화 활성이 우수한 새로운 천연 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다.^12-14)

감(Diospyros kaki Thunberg)은 예전부터 우리나라에서는 제사에 사용할 뿐만 아니라 다양한 용도로 이용되는 과일 로 알려져 있지만, 한국, 일본, 중국 등의 동아시아에서는 민간약으로도 사용해왔다. 예로부터 동의보감이나 향약집성 방에 의하면 감은 종기나 염증질환, 부스럼, 화상을 치료하 고 고혈압을 예방하고 동맥경화에 효능이 있다고 알려져 있 다. 감의 열매 꽃받침을 모아서 말린 것을 감꼭지 즉 생약 명 시체( )라고 하며, 감꼭지에는 betulinic acid, oleanolic acid, ursolic acid, 포도당 등이 함유되어 있고 민간에서는 딸국질, 야뇨증 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾이 외에 감꼭지의 효능에 대해서는 혈액응고 억제 효과¹⁶⁾와 미 백과 항염증 효과가 보고되어져 있으며,¹⁷⁾ 항산화와 항염증 활성 연구도 알려져 있으나¹⁸⁾ 항산화 활성 주성분에 대한 상세한 연구는 보고되어져 있지 않다.

이에 본 연구에서는 보다 안전하고 우수한 활성을 나타내 는 항산화제를 천연물로부터 개발하고자 하는 연구의 하나 로 감꼭지의 다양한 극성별 용매 분획물에 대하여 DPPH법

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-33-730-0554

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에 의한 free radical 소거 작용과 총페놀법에 의한 항산화 활성 물질의 함량 검색을 통해 우수한 항산화 활성을 나타 내는 활성 분획물을 확인하고, 활성 분획물로부터 column chromatography에 의해 활성 주성분을 분리한 후 분리되어 진 화합물에 대하여 NMR 등의 기기분석을 통해 감꼭지의 항산화 활성 주성분을 다음과 같이 확인하였으므로 이를 보 고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 실험에 사용한 감꼭지는 강원도 원주시 우 산동에 소재한 천일약업사에서 구입하여 음건하고 세절하 여 실험 재료로 사용하였고, 상지대학교 제약공학과 의약화 학 실험실에 보관중이다.

기기 및 시약 − 성분 분리를 위한 순상 column chromato- graphy용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck)을 사용하였고, 성분 확인용 TLC plate는 Kiesel gel 60F₂₅₄(ART.5715, Merck)를 사용하였다. Free radical 소거 효과 측정용 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였으며, 표준품인 α- tocopherol 및 BHA(butylated hydroxyanisole)는 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였다. 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV 분광계를 사용하여 측정하였고, FT-NMR은 Varian Mercury 300 MHz를, 융점은 Mettler FP-5 융점측정 기를 사용하였으며 보정은 하지 않았다.

추출 및 분리 − 음건한 감꼭지 510 g을 MeOH 1,500 ml 를 가하여 수욕상에서 3회 반복 추출하여 여과 후 농축하 여 감꼭지 MeOH extract(16.5 g)를 얻었다. 얻어진 MeOH extract의 일부를 증류수에 현탁시켜 n-hexane, EtOAc, n- BuOH 및 H₂O 순으로 분획 후 농축하여 각 분획물 n-hexane 분획물(1.2 g), EtOAc 분획물(5.4 g), n-BuOH 분획물(2.6 g), 및 H₂O 분획물(6.2 g)을 각각 얻었다. 분획물 중 가장 우수 한 항산화 효과를 나타낸 n-BuOH 분획물(2.5 g)을 CHCl₃: MeOH = 20:1부터 단계적으로 극성을 높인 전개용매를 이 용하여 silica gel column chromatography를 실시하여 6개의 활성 소분획인 fraction 1(0.1 g), fraction 2(0.1 g), fraction 3(0.07 g), fraction 4(0.03 g), fraction 5(0.1 g) 및 fraction 6(1.5 g)로 나누었으며, 가장 높은 항산화 효과를 나타낸 fraction 4와 fraction 5 및 fraction 6으로부터 재차 silica gel column chromatography와 Sephadex-LH 20을 실시하여 각 각 화합물 1(10.2 mg)과 2(30.5 mg) 및 3(120.3 mg)을 분리 하였다.

Compound 1 − Light yellow powder; m.p: 313-314^o; UV: λ max (MeOH): 267, 371; IR (KBr)cm^-1: 3380 (OH), 1676 (C=O), 1608, 1516, 1235 (aromatic C-O); ¹H-NMR

(300 MHz, CD₃OD) δ: 6.19 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.40 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.89 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5'), 7.64 (1H, dd, J=2.3, 8.5 Hz, H-6'), 7.74 (1H, d, J=2.3 Hz, H-2'); ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 176.1 (C-4), 164.4 (C-7), 161.3 (C-5), 157.0 (C-9), 147.6 (C-2), 146.7 (C-4'), 145.0 (C-3'), 136.0 (C-3), 122.9 (C-1'), 120.4 (C- 6'), 115.0 (C-5'), 114.8 (C-2'), 103.3 (C-10), 98.0 (C-6), 93.2 (C-8); EI-MS: m/z 302 [M]⁺

Compound 2 − Light yellow powder; m.p: 175-176^o; UV: λ max (MeOH): 284 (3.29); IR (KBr)cm^-1: 3300 (OH), 1630 and 1525 (aromatic ring); ¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD) δ: 4.56 (1H, d, J=8.0 Hz, H-2), 3.99 (1H, ddd, J=5.5, 8.0, 8.2 Hz, H-3), 2.84 (1H, dd, J=5.5, 16.1 Hz, H-4a), 2.50 (1H, dd, J=8.2, 16.1 Hz, H-4b), 5.85 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 5.92 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.83 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2'), 6.76 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5'), 6.71 (1H, dd, J=1.9, 8.3 Hz, H-6'), ¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 157.1 (C-9), 156.6 (C-5), 156.3 (C-7), 145.1 (C-4'), 144.9 (C-3'), 131.5 (C-1'), 119.4 (C-6'), 115.0 (C- 5'), 114.6 (C-2'), 99.9 (C-10), 95.5 (C-6), 94.8 (C-8), 82.1 (C-2), 67.7 (C-3), 29.9 (C-4); EI-MS m/z 290[M]⁺

Compound 3 − Colorless amorphous powder; m.p: 249- 251^o; UV: λ max (EtOH): 217, 265; IR (KBr)cm^-1; 3402 (OH), 1650 (CO); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ:

7.14 (2H, s, H-2, 6); ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ:

109.8 (C-2,6), 121.8 (C-1), 138.6 (C-4), 145.8 (C-3,5), 168.5 (COO); EI-MS m/z 290[M]⁺

감꼭지 분획물 및 항산화 활성 주성분의 DPPH 라디칼 소거작용의 측정 − Uchiyama 등¹⁹⁾의 방법을 약간 변형시킨 Yoshikawa등²⁰⁾의 방법에 의해 다음과 같이 측정하였다.

0.1 M의 초산 완충액(pH 5.5, 2.0 ml)에 시료의 EtOH 용액 (2.0 ml) 및 2×10^-4 M DPPH EtOH용액(1.0 ml)을 가하여 전량을 5 ml로 하고 실온에 방치한 후, 30분 후 517 nm에 서의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(mg) 을 α-tocopherol 및 BHA와 같은 기존의 항산화제를 대조군 으로 하여 시험하였다.

감꼭지 분획물의 총 폴리페놀 함량의 측정 − 총 폴리페 놀 함량은 Folin- Denis의²¹⁾방법에 의해 다음과 같이 측정 하였다. Blank 및 gallic acid를 MeOH로 희석하여 0, 50, 100, 250, 500 ppm의 농도로 제조하여 700 nm에서의 흡광 도로 측정한 검량선을 작성하였다. 각 분획물 10 mg을 MeOH 1 ml를 가하여 녹인 다음 0.2 N Folin-Ciocalteau 시 약을 0.5 ml 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 다음 10%

Na₂CO₃ 0.5 ml를 가하고 증류수 1 ml을 넣은 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 이어서 1시간 후 700 nm에서의 흡 광도를 측정하여 검량선 대비 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.

(3)

결과 및 고찰

기존에 널리 알려진 천연 항산화제인 α-tocopherol과 합 성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 감꼭지의 용매별 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용 실 험을 실시한 결과 Table I에 나타낸 바와 같이 감꼭지의 각 분획물들 가운데에서 n-BuOH 분획물이 가장 강력한 free radical 소거 효과를 나타내었다. 또한 그들의 함량과 항산 화 활성 간에 연관성이 있는 것으로 알려진²²⁾ 폴리페놀 화 합물이 감꼭지의 어느 분획물에 가장 많이 함유되어 있는 지는 확인할 수 있는 총 폴리페놀 함량 측정법에 의한 폴리 페놀의 함량 실험 결과 Table II에서와 같이 n-BuOH 분획 물에서 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 보임으로서 DPPH법 에 의한 free radical 소거 작용 실험 결과와 함께 감꼭지의 n-BuOH 분획물이 항산화 활성의 주성분 분획물 임을 확인 할 수 있었다.

계속하여 가장 강한 항산화 활성을 나타낸 n-BuOH 분획 물로부터 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 n-BuOH 분획물을 CHCl₃와 MeOH 혼합용매를 사용하여 전개용매 의 극성을 단계적으로 증가시키면서 silica gel column chromatography를 실시하여 얻어진 6종의 소분획물에 대해 서도 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용을 실시하였다.

그 결과 Table III에 나타난 바와 같이 fraction 4, 5 및 6이 BHA보다는 약하나 α-tocopherol과는 유사한 항산화 활성을 보임으로서 항산화 활성 주성분 소분획물임을 확인할 수 있 었다. 이들 소분획물로부터 항산화 활성 주성분들을 분리하 기 위하여 column chromatography를 연속적으로 실시하여 fraction 4로부터는 화합물 1을 fraction 5로부터는 화합물 2 를 fraction 6으로부터는 화합물 3을 각각 분리하였다.

얻어진 화합물 1은 미황색 분말로 FeCl₃ 시험에서 녹색 을, 아니스알데히드-황산시액에서 오렌지색을 나타내어 flavan 계 물질로 추정되었고, IR에서 수산기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인할 수 있었다. 또한 ¹H-NMR spectrum 에서 sp² carbon 유래의 5개의 signal이 δ 6.19, 6.40, 6.89, 7.64, 7.74에서 관측되고, 이들 proton signal의 chemical shift, 분열패턴 및 coupling constant 값의 비교 분석과 TLC 에서의 표준품과 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin으 로 추정할 수 있었다. 최종적으로 화합물 1의 기기 분석치 를 표준품 및 문헌치^23-25)의 spectral data와 비교 분석한 결 과 화합물 1의 구조는 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 quercetin 으로 동정하였다.

화합물 2는 FeCl₃시액에서 청남색으로 나타나 페놀성 화 합물임을 추정할 수 있었다. ¹H-NMR spectrum에서 δ 6.83, 6.76, 6.71에서 3치환체의 방향족 탄소에 결합된 3H의 signal 들이 검출되었다. A-ring의 H-8과 H-6으로 귀속되는 δ 5.92 와 5.85의 m-coupled doublet가 확인되었고, δ 4.56에서 C- ring의 H-2 signal이 관찰되었으며 δ 3.99의 H-3과 coupling constant가 8.0 Hz로 관측됨으로서 trans coupling을 하고 있 음을 알 수 있었다. δ 3.99와 2.84(H-4)의 signal 양상으로 보아 화합물 1은 flavan-3-ol 계통의 화합물임을 알 수 있었 다.²⁶⁾ ¹³C-NMR spectrum에서는 aromatic 영역에서 12개의 carbon peak와 aliphatic 영역에서 3개 등 총 15개의 carbon signal을 관찰 할 수 있었으며, C-3에 귀속되는 δ 67.7의 Table I. Radical scavenging effect of persimmon calyx extracts

on DPPH method

Sample 50% reduction(mg)^a α-Tocopherol 0.022±0.001

BHA 0.015±0.001

MeOH extract 0.070±0.002 n-Hexane extract 0.081±0.002 EtOAc extract 0.039±0.001 n-BuOH extract 0.014±0.001 H₂0 extract 0.076±0.002

aAmount required for 50% reduction of DPPH(2×10^-4, 0.079 mg) solution.

Data are expressed as means±SE of triplicate experiments.

Table II. Total phenolic contents of persimmon calyx extracts on Folin- Denis methods

Sample Total phenol content (mg/g)^a MeOH extract 4.95±0.24

n-Hexane extract 0.81±0.17 EtOAc extract 5.11±0.14 n-BuOH extract 5.78±0.12 H₂0 extract 2.56±0.21

aData are expressed as means±SE of triplicate experiments.

Table III. Radical scavenging effect of prepared fractions from n-BuOH extract of persimmon calyx on DPPH method

BHA 0.015±0.001

Fraction 1 0.088±0.002 Fraction 2 0.057±0.002 Fraction 3 0.055±0.002 Fraction 4 0.020±0.001 Fraction 5 0.022±0.002 Fraction 6 0.019±0.001

aAmount required for 50% reduction of DPPH(2×10⁴, 0.079 mg) solution.

(4)

hydroxyl carbon signal을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 기존 문헌의 data^27-29)와 비교하여 검토한 결과 화합물 2의 구조는 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 (+)-catechin으로 동정할 수 있었다.

화합물 3은 무색의 무정형 분말로서 FeCl₃정색 시험에서 청남색을 나타내고, IR spectrum에서 수산기와 카르보닐기 가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인함에 의해 페놀 성 화합물로 추정하였다. ¹H-NMR에서 δ 7.14에서 2H분의 singlet peak가 관측되고, ¹³C-NMR에서 galloyl기에 해당하 는 피크와 δ 168.5의 고자장 영역에서 카르보닐기 유래의 피크가 관측됨에 의해 gallic acid로 추정할 수 있었고, 표준 품 및 문헌치^30,31)와의 spectral data의 비교에 의하여 Fig. 1 에서와 같이 화합물 3은 gallic acid로 동정하였다.

감꼭지의 항산화 활성 주성분으로 단리된 quercetin, (+)- catechin 및 gallic acid에 대해서도 항산화 활성을 DPPH법 에 의해 실시한 결과 Table IV에 나타낸 것과 같이 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid 모두 대조군인 α-tocopherol 보다 는 우수하고 BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 보 였다. 따라서 이들 3종의 분리된 화합물이 감꼭지의 항산화 활성 주성분임이 명확해졌다.

결 론

현대 사회는 노인층의 증가와 식습관 및 환경의 급속한 변화에 따라 다양한 성인병들이 증가되고 있으며, 활성산소 가 각종 성인병 질환 및 노화와 연관성이 있음이 보고되어 짐에 따라 이들 활성산소를 제거 또는 약화시키는 항산화 제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 지금까지 개발되어진 다양한 천연 및 합성 항산화제들은 독성, 유해 성 및 효능 등에서 다소 미미한 점을 지니고 있다. 이에 천 연물이나 약용식물로부터 새로운 항산화제를 개발하기 위 한 연구의 하나로, 본 연구는 감꼭지(시체)에 대하여 보다 상세한 항산화 효과의 검토와 함께 항산화 활성 주성분 규 명 연구를 실시한 결과 다음과 같은 지견을 얻었다.

1. 감꼭지의 용매별 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 항 산화 활성과 총페놀법에 의한 폴리페놀성 물질의 함유량을 측정한 결과, 감꼭지의 n-BuOH 분획물이 가장 우수한 항 산화 활성을 나타내었다.

2. 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 우수한 항산화 효과를 나타낸 감꼭지의 n-BuOH 분획물에 대하여 항산화 활성을 검토하면서 소분획을 실시한 결과, 가장 높은 항산 화 효과를 나타낸 fraction 4와 fraction 5 및 fraction 6으로 부터 각각 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 3을 분리하였다.

3. 분리된 화합물 1과 2, 3의 기기 분석치를 표준품 및 문 헌치와 spectral data를 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin으로, 화합물 2는 (+)-catechin으로, 화합물 3은 gallic acid로 동정하였다.

4. 감꼭지의 항산화 활성 주성분으로 단리된 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid에 대해 DPPH법에 의한 free radical 소거 효과를 실시한 결과, 모두 대조군인 α-tocopherol 보다는 우수하고, BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과 를 나타냄으로서 이들이 감꼭지의 항산화 활성 주성분임이 판명되었다.

Fig. 1. Structure of compound 1, 2 and 3 isolated from n- BuOH extract of persimmon calyx.

Table IV. Radical scavenging effect of quercetin, (+)-catechin and gallic acid isolated from persimmon calyx on DPPH method

BHA 0.015±0.001

Quercetin 0.016±0.002 (+)-Catechin 0.015±0.001 Gallic acid 0.015±0.002

aAmount required for 50% reduction of DPPH(2×10⁴, 0.079 mg) solution.

(5)

사 사

본 연구는 상지대학교 2012년 교내연구비에 의해 수행되 었으며, 이에 감사드립니다.

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(2014. 2. 3 접수; 2014. 2. 27 심사; 2014. 3. 10 게재확정)