Enhancement of Skin-Whitening and UV-Protective Effects of Centella asiatica L. Urban by Utrasonification Process

초음파 병행을 통한 병풀의 미백 및 자외선 차단 활성 증진 효과

하지혜*·권민철*·김승섭*·정명훈*·황 백**·이현용*^,***^†

*강원대학교 바이오산업공학부, **전남대학교 생물학과, ***강원대학교 생명공학연구소

Enhancement of Skin-Whitening and UV-Protective Effects of Centella asiatica L.

Urban by Utrasonification Process

Ji Hye Ha

, Min Chul Kwon

, Seung Seop Kim

, Myoung Hoon Jeong

, Baik Hwang

and Hyeon Yong Lee

*

School of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, ChunCheon 200-701, Korea.

**

Department of Biology, Chonnam National University, Kwangju 520-830, Korea.

***

Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea.

ABSTRACT : Enhancement effect of ultrasonification process on UV-protection and skin-whitening activities using ^Centella

asiatica L. Urban extract was investigated. Cytotoxicity of the extracts measured on human skin fibroblast cells, CCD-986sk, and then, ultrasonification associated extracts showed 5~9% lower cytotoxicity then normal crude extracts on 1.0 ^㎎ / ^㎖ of highest sample concentration. The associated extrats showed highest inhibition activity of hyaluronidase on 1.0 ^㎎ / ^㎖ of con- centration as 54.2%. Also, the associated extract reduced expression of MMP-1 on UV-irradiated CCD-986sk cells down to 100.2% from 136.1%, and revealed high inhibitory potency on tyrosinase as 74.6% by adding 1.0 ^㎎ / ^㎖ of concentration.

Ultrasonification associated extract showed strong inhibition effect of melanin production on Clone M-3 cells as 84.2% by adding 1.0 ^㎎ / ^㎖ of concentration. From the preliminary observations, we considered that the extracts from C. asiatica could be potent natural materials for skin-whitening and anti-aging agent, and could enhance the activities by ultrasonification process.

Key Words : Centella asiatica L. Urban, Ultrasonification Process, Skin-Whitening, UV protection

서 론

병풀 ( Centella asiatica L. Urban) 은 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로 , 아프리카의 마다가스카르 섬이 원산지이나 인 도양 해안지역을 비롯한 서남아시아 및 중남미의 고온 다습한 곳에 폭넓게 자생하고 있으며 국내에서는 난대지방에 속하는

제주도 및 남부 도서 지방에 분포하고 있다 (Kartnig and

Hoffmann-Bohm, 1992). ^{또한 병풀은 아시아 등지에서 전통요}

법을 통해 오래전부터 약용으로 이용되어 왔으며 피부 외상 ,

만성궤양 , 뇌질환 등의 치료에 효과를 나타내는 것으로 알려 져 있다 (Brinkhaus et al. , 2000; Bonte et al. , 1993). 특히 수용성 추출물 내 주요성분인 asiaticoside, madecassoside, asiatic acid 및 madecassic acid 는 피부조직의 재생력을 갖는 물질들로 콜라겐 생성 촉진을 통한 세포외기질 생성의 개선 효과가 보고되고 있으며 , ^{실제로 이중} asiaticoside ^{는 피부주름}

개선용 유효성분으로 인증 및 사용되고 있다 (Kim et al. ,

2002). ^{이처럼 병풀은 피부치료제 및 피부 주름개선제 등의 유}

효성분으로 다양하게 이용되고 있으며 , 의약품 및 기능성 화 장품 소재로 사용하기 위한 국내 수요가 증가하고 있다 .

최근의 연구들을 통해 병풀의 추출물 및 유효성분인

asiaticoside 가 저농도에서도 높은 콜라겐 생성 유도 효과 및 세포 증식의 촉진은 물론 , 콜라겐 감소에 결정적 요인으로 작 용하는 MMP (Matrix Metallo Proteinase) ^{의 억제 효과를 나}

타내는 것이 보고되었다 (Gilchrest, 1989; Park and Kim,

1995). 따라서 본 연구에서는 피부 재생 촉진 및 유도 효과를

가지는 병풀의 효율적인 추출 공정으로 초음파를 병행한 추출 공정을 수행하고 그 효과를 알아보고자 하였다 .

초음파 에너지는 초음파 진동에 의한 공동현상을 유도함으 로써 매우 큰 에너지를 발생시키는데 , 이를 통해 주변에 위치 하는 반응 분자들의 운동에너지가 상승하고 충격 효과를 불러 와 높은 압력이 유도됨에 따라 혼합 효과를 나타내게 된다

(Chung et al. , 2000). 일반 열수 추출과 초음파 추출을 비교

†

Corresponding author: (Phone) +82-33-250-6455 (E-mail) [email protected]

Received 2010 January 11 / 1st Revised 2010 February 22 / 2nd Revised 2010 March 25 / Accepted 2010 April 5

한 실험에서 초음파 공정을 통해 추출 수율의 증가 및 추출 시간의 단축 효과가 확인되었으며 , ^{이는 초음파 공동효과에 따}

른 높은 압력이 세포 내부조직을 파괴함으로써 유효성분의 이 동거리가 짧아지고 확산이 용이해지기 때문이라는 결과가 보 고된 바 있다 (Kim et al. , 2001; Park et al. , 2004).

따라서 본 연구에서는 기능성 향장소재로서 활성이 기대되 는 병풀을 초음파 병행 공정으로 추출하고 , 이들 초음파 추출 물의 향장활성을 일반 열수 추출물과 비교 분석함으로써 향장 활성에서 초음파 병행 공정의 효과를 확인하고자 실험을 수행 하였다 .

재료 및 방법

1. ^{실험재료 및 추출방법}

본 실험에 사용된 병풀 ( Centella asiatica L. urban) ^초본

은 2007 ^년 4 ^{월 채취한 것을 지원받아 사용하였다} . ^{시료는 지}

상부를 분리하여 사용하였으며 추출은 음건된 시료에 10 배수 의 에탄올과 증류수를 용매로 이용하여 각각 60 ℃와 100 ℃에 서 24 시간 동안 실시하였으며 , 이들 중 절반은 다시 각각의 추출온도에서 초음파 발생기 (Asia Industry Co., Korea) 를 이 용하여 60 ㎑의 초음파를 30 분간 병행해 주었다 . 각 시료들은 감압여과 후 농축 및 동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사 용하였다 .

2. ^{세포주 및 세포 생육 배지}

병풀 시료의 세포독성 및 MMP-1 발현 억제 실험은 인간

피부 섬유아세포인 CCD-986sk (KCLB, Korea) 를 이용하여 확인하였으며 , melanin 생성은 mouse melanocyte 인 Clone M-3 ^세포 (ATCC, USA) ^{를 이용하였다} . ^{실험에 사용된 피부}

섬유아세포 및 melanocyte ^{는 각각} DMEM ^과 RPMI 1640 ^배

지에 10% heating-inactivated fetal bovine serum (FBS) 를 첨가시켜 배양하였다 .

세포배양에 사용된 배지 및 혈청은 Gibco (USA) 로부터 구 입하였고 , Hepes buffer 및 gentamycin sulfate, trysin-EDTA

는 Sigma (USA) 에서 구입하여 사용하였다 . 기타 시약들은

Sigma ^로부터 analyzed guarantied ^또는 regent grade ^{로 구입하}

여 실험에 사용하였다 .

3. ^{피부 섬유아세포 세포독성 측정}

병풀 시료의 세포독성은 병풀의 추출 성분이 피부외용제 및 주름개선용으로 주로 사용되는 것을 감안하여 인간 섬유 아세 포인 CCD-986sk 를 이용하여 , 세포 단백질 염색을 통해 세포 의 증식 및 독성을 측정하는 방법인 SRB (sulforhodamine B) assay (Doll & Peto, 1983) ^{로 측정하였다} . ^{실험 대상 세포}

의 농도를 4~5 × 10

cells/ ㎖으로 96 well plate 의 각 well 에

100 ^{㎕씩 첨가하여} 24 ^{시간 동안 배양} (37 ^℃ 5% CO

) ^{한 후} ,

각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ^그리고 1.0 ^㎎ / ^㎖

로 100 ㎕씩 첨가하여 48 시간 동안 배양하였다 . 배양이 완료

된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10% (w/v) TCA

(trichloroacetic acid) 100 ㎕를 가하여 4 ℃에서 1 시간 동안 방 치한 후 증류수로 5 회 세척하여 TCA 를 제거하고 실온에서

plate 를 건조한 뒤 각 well 에 1% (v/v) acetic acid 에 녹인

0.4% (w/v) SRB ^용액을 100 ^{㎕씩 첨가하고 상온에서} 30 ^{분 동}

안 염색시켰다 . ^{결합되지 않은} SRB ^염색액은 1% acetic acid

로 4~5 회 정도 세척 , 건조 시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 ㎚에서 microplate reader (Thermo max, Molecular Devices, USA) 를 이용하여 흡광도를 측정하였다 .

4. ^{피부 면역 관련} hyaluronidase ^{활성 저해 효과}

Hyaluronic acid ^{는 피부의 세균 침입이나 독성물질 침투를}

막는 역할을 하는 다당류로 분해효소인 hyaluronidase 의 작용 으로 가수분해 된다 . 따라서 hyaluronidase 의 활성 억제를 통 해 피부 면역을 증진할 수 있으며 , 본 실험에서는 Rooster Comb 에서 형성된 N-acetylglucosamine 의 양을 분광광도계로 측정하여 시료의 hyaluronidase 억제 활성을 판단하였다 . 0.1 M acetate buffer (pH 3.5) ^{에 녹인} hyaluronidase(7,900 unit/ ^㎖ ) 50 ㎕ 에 시료의 추출물을 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎ / ㎖가 되도록 20 ㎕가하고 , 효소의 활성화를 위해 12.5 mM 의 CaCl

200 ㎕를 혼합한 후 37 ℃ 수욕 상에서 20 분간 배양시켰다 . 대조군은 DMSO 용액을 넣고 수욕 상에서 20 분 간 배양하였다 .

Ca

로 활성화된 hyaluronidase 용액에 0.1 M acetate buffer ^{에 녹인} hyaluronic acid (12 ^㎎ /5 ^㎖ ) 250 ^{㎕를 첨가하}

여 다시 수욕 상에서 40 ^{분간 배양하였다} . ^{배양 후} 0.4 N NaOH 용액 100 ㎕와 0.4 M potassium tetraborate 100 ㎕를 반응 혼합물에 첨가하여 끓는 수조에서 3 분간 배양시킨 후 냉 각시켰다 . 냉각시킨 반응물에 dimethyl aminobenzaldehyde 용 액 (p-dimethyl amino-benzaldehyde 4 g, 100% acetic acid 350 ㎖ 및 10 N HCl 50 ㎖ 혼합액 ) 3.3 ㎖를 반응 혼합물에 첨가한 후 37 ^{℃ 수욕 상에서} 20 ^{분간 배양한 후} 585 ^{㎚서 흡}

광도를 측정하였다 . 저해비율은 다음과 같이 계산하였다 . Hyaluronidase Inhibition(%) = [(ODc − ODs) / ODc] × 100 ODc 는 대조군의 OD(optical density) 이고 , ODs 는 시료 용 액의 585 ㎚에서의 OD 값이다 .

5. UVA ^{처리를 이용한} MMP-1 ^{발현 저해 측정}

피부 섬유아세포인 CCD-986sk ^를 1.5 × 10

cells/ ^{㎖의 농도}

로 35 ㎜ dish 에서 약 80% confluency 에 도달할 때까지 배양

하였다 . UV ^{조사 전에 원래의 배지를 제거한 후} PBS ^{로 세척}

하여 배지 내 serum ^{성분을 제거한 다음} UV ^등 (35W, UV, Coralife) 에 필터를 이용하여 UVA (6.3 J/ ㎠ ) 를 24 시간 조사하 였다 . UVA 조사 후에는 FBS 를 첨가하지 않은 DMEM 배지 에 병풀 시료를 1.0 ㎎ / ㎖의 농도로 투여하여 24 시간 동안 배 양하였다 .

UVA 조사에 의해 유도되는 MMP-1 발현량 측정은

Dunsmore ^{등이 사용한 방법} (Dunsmore ^{et al} ., 1996) ^{을 이용}

하여 실시하였다 . UVA ^{조사 전과 후의 시료를 각각 처리하여} 24 시간 배양한 배지를 96 well plate 에 분주하고 4 ℃에서 하 룻밤 동안 반응시켰다 . TBS (phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20) 로 3 회 세척하고 3% PBS 로 37 ℃에서 1 시 간 동안 blocking 한 후 , 1 차 항체 (monoclonal anti-MMP-1 antibody) 를 blocking buffer 로 사용하여 1 : 3,000 으로 희석하 고 처리한 후에 37 ^℃에서 90 ^{분간 반응시켰다} . PBS ^{로 세척한}

다음 2 ^{차 항체} (alkaline phosphatase conjugated Goat anti- mouse IgG) 를 blocking buffer 에 1 : 3,000 으로 희석하여 처리 하고 , 37 ℃에서 90 분간 반응시킨 후 PBS 로 세척한 다음

alkaline phosphatase 기질용액 (1.0 ㎎ / ㎖ , p-mitrophenyl phos- phate in diethanolamine buffer) 을 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시켰다 . 3 N NaOH 로 반응을 완전히 중지시킨 후

microplate reader ^{를 사용하여} 405 ^{㎚에서 흡광도를 측정하였다} . 6. Tyrosinase ^{억제 효과 탐색}

Tyrosinase 억제 효과는 dopachrome 방법 (Hearing, 1987) 을 이용하여 측정하였다 . 150 ㎕ 의 mushroom tyrosinase (150 unit), 225 ㎕의 2.5 mM L-tyrosine, 225 ㎕의 0.4 M Hepes buffer (pH 6.8), 그리고 300 ㎕ 의 ethanol 용액 혹은 시료

(1.0 ^㎎ / ^㎖ ) ^{용액을 섞은 후} , ^{배양 전과} 15 ^{분간 배양 후 각각}

의 흡광도를 475 ^{㎚에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았}

다 . Tyrosinase 의 억제정도는 다음과 같이 계산하였다 . Tyrosinase inhibition(%)=(ODd ⁻ ODc) ⁻ (ODb ⁻ ODa)/(ODd ⁻ ODc) × 100

ODa (Optical density a) 와 ODb 는 각각 시료가 첨가된 용 액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이며 , ODc ^와 ODd ^{는 각각}

시료를 넣지 않은 기준 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도 이다 . 이들 tyrosinase 억제효과는 100 으로 나타날 때 완전한 억제를 의미하며 , 0 일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미 한다 .

7. Clone M-3 ^{세포로부터} melanin ^{생성량 측정}

흑갈색 색소인 melanin 은 일정량 이상의 자외선을 차단하여

피부를 보호하는 작용을 하지만 과도하게 생성될 경우 피부침 착 및 피부손상 효과를 나타낸다 . 표피 기저층에 존재하는

melanocyte 내 소기관인 melanosome 에서 생합성되며 이는 가 시광선 영역대의 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교할 수 있다 (Lim et al. , 2006). 실험을 위해서는 mouse 유래

melanocyte 인 Clone M-3 세포를 사용하였다 . M-3 세포 접종 후 50 ^㎍ / ^{㎖ 농도의 시료를} 3 ^{일간 처리하고 배지를 제거한 다}

음 세포를 PBS ^{로 세척하고} , ^각 well ^당 1.0 ^㎖의 1 N NaOH

를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 melanin 성분 을 녹여 나오게 한 뒤 , 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선 영역인 400 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다 .

8. ^통계처리

각 실험의 결과는 triplicate determinations ^{에 의한} Mean ^± SD (Standard deviation) 로 표시했으며 각 평균치 간의 차이는

Microsoft excel 의 student t -test 에 의해 p < 0.05 수준에서 유 의성을 검증하였다 .

결과 및 고찰

1. ^{피부 섬유아세포 세포독성}

Fig. 1 은 인간 피부 섬유아세포인 CCD-986sk 에 대한 병풀 추출 시료의 세포독성을 SRB assay 로 측정하여 나타낸 것이 다 . 세포독성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 증가하는 경 향을 나타내었고 , 최대 투여농도인 1.0 ㎎ / ㎖에서 70 ℃ 에탄 올 추출물이 32.5% 로 가장 높은 값을 나타내었다 . 반면 초음 파를 병행한 시료들이 같은 농도에서 나타낸 29% ^{가 가장 낮}

은 세포독성 수치였으며 , 용매조건별로는 큰 차이를 보이지 않 았으나 초음파를 병행한 추출물의 독성이 병행하지 않은 것에

비해 5~9% 감소된 수치를 보임에 따라 초음파 병행을 통해

Fig. 1.

Cytotoxicity of

extracts on human skin fibroblast, CCD-986sk.

†

70

EtOH: extracts by ethanol extraction at 70

, 70

EtOH U.S.: extracts by ethanol extraction with ultrasonifi-

cation process at 70

, 100

Water: extracts by water

extraction at 100

, 100

Water U.S.: extracts by water

extraction with ultrasonification process at 100

.

세포독성의 저감이 가능할 것으로 사료된다 . 이러한 결과는 기 존의 연구결과에 미루어 보아 초음파 병행 공정을 통해 유도 된 공동현상으로 추출물 내 독성성분의 변성 및 파괴가 일어 나기 때문인 것으로 사료된다 (Kwon et al ., 2008). 결과를 통해 최대 투여농도인 1.0 ㎎ / ㎖에서도 모든 조건의 시료가 정상세포의 생존율을 67% 이상으로 유지시킴에 따라 병풀 수 용성 추출물 시료가 인간 정상 피부 섬유아세포에 대해 유의 할만한 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다 . 2. Hyaluronidase ^{활성 저해 효과}

병풀 추출물의 초음파 병행 공정을 통한 향장활성 증진 효 과를 확인하기 위해 병풀의 대표적 활성으로 알려져 있는 피 부보호 효과 중 하나인 hyaluronidase 억제 활성을 확인하였

다 . Hyalurondase 는 피부 보습 및 탄력 유지에 기여하는

hyaluronic acid 의 분해효소로 피부면역 저해인자로 알려져 있 다 . ^따라서 hyaluronidase ^{의 효과적인 제어를 통해 피부 면역}

증진 효과를 얻을 수 있다 . ^{병풀 시료의} hyaluronidase ^억제효

과를 측정하여 Fig. 2 에 나타내었다 . 결과를 통해 모든 시료조 건에서 hyaluronidase 가 억제되는 것을 확인할 수 있었고 , 저 해 수준은 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며 , 실

험을 통해 시료에 따라 20~60% 의 저해 활성을 나타내었다 .

가장 높은 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 에탄올 추출 물로 최대 시료 투여농도인 1.0 ^㎎ / ^{㎖ 에서} 54.2% ^까지 hyaluronidase 저해활성을 나타내었다 . 반면 , 100 ℃ 열수 추출

물의 경우 같은 농도에서 41.7% 로 가장 낮은 활성을 나타내

었다 .

3. UVA ^{처리를 이용한} MMP-1 ^{발현 저해 효과}

광노화에 의한 피부주름 생성에 중요한 역할을 담당하고 있 는 MMP-1 ^{의 발현은} UVA ^{에 의해 세포에서} JNK/p38 ^{의 활성}

도가 증가하고 전사인자인 AP-1 의 활성도가 증가되는 신호전 달 경로를 통해 증가되어 피부에서 교원질의 결핍을 초래한다

고 알려져 있다 . 이처럼 자외선에 의해 증가되는 MMP-1 발

현에 미치는 병풀 추출 시료의 영향을 알아보고자 인간 섬유 아세포에 UVA 를 조사하고 시료를 첨가하여 24 시간 동안 배 양한 후 ELISA ^{로 측정한} MMP-1 ^{발현 저해 효과를} Fig. 3

에 나타내었다 .

MMP-1 은 UVA 조사를 통해 처리 전 대비 136.1% 까지 증 가하는 모습을 보였으나 , 시료 첨가를 통해 증가가 억제되는 경향을 나타내었는데 , 대부분의 시료 조건에서 농도에 비례하 여 억제 활성이 증가하는 경향을 나타내었다 . 가장 높은 억제 활성을 나타낸 것은 초음파를 병행한 에탄올 추출물로 최대 시료 투여 농도인 1.0 ^㎎ / ^{㎖ 에서} 100.2% ^{의 수치를 나타내} UVA ^{를 조사하지 않은 대조군과 유사한 수치를 나타내었다} .

이는 병풀 수용성 추출 시료가 MMP-1 발현 저해 활성을 가

지고 있으며 초음파 병행을 통해서 그 효과가 추가적으로 증 진될 수 있음을 나타내는 것이다 .

4. Tyrosinase ^{억제 효과}

Melanin ^{은 피부세포 내에서} tyrosinase ^{효소의 생합성 과정}

을 통해 만들어져 자외선 노출 , 건조 , 극한 온도 등으로부터 피부의 저항력을 높여주지만 , 과도한 멜라닌의 생성은 인체에 기미 , 주근깨 , 검버섯 등과 같은 색소 침착을 일으키고 , 피부

Hyaluronidase inhibitory activity of

extracts.

70

EtOH: extracts by ethanol extraction at 70

, 70

EtOH U.S.: extracts by ethanol extraction with ultrasonification process

at 70

, 100

Water: extracts by water extraction at 100

, 100

Water U.S.: extracts by water extraction with ultrasonification

process at 100

.

의 손상을 촉진한다 . 따라서 천연물의 향장품 및 의약품 적용 을 위해서는 천연물 시료의 미백 또는 착색효과에 대한 분석 또는 검증이 매우 중요한 부분이 된다 . 따라서 병풀 수용성 추출물 성분이 미백 또는 착색에 미치는 영향을 알아보고자

melanin 생성의 대표적 기작으로 tyrosinase 효소의 작용 저해 효과를 확인하여 Fig. 4 에 나타내었다 . 양성대조군으로는 피부

재생 효과를 나타내는 것으로 알려진 collagen 중에서 시약으

로 주로 사용되는 송아지 유래 collagen type I 과 ascorbic

Fig. 3.

Production of MMP-1 by adding

extracts on UVA-irradiated human skin fibroblast, CCD-986sk.

†

70

EtOH: extracts by ethanol extraction at 70

, 70

EtOH U.S.: extracts by ethanol extraction with ultrasonification process at 70

, 100

Water: extracts by water extraction at 100

, 100

Water U.S.: extracts by water extraction with ultrasonification process at 100

.

Fig. 4.

Tyrosinase inhibition effects of

extracts against the

melanin synthesis.

†

70

EtOH: extracts by ethanol extraction at 70

, 70

EtOH U.S.: extracts by ethanol extraction with ultrasonification process

at 70

, 100

Water: extracts by water extraction at 100

, 100

Water U.S.: extracts by water extraction with ultrasonification

process at 100

.

acid 를 사용하여 실험 비교하였다 . 모든 병풀 시료가 첨가를 통해 0.2 ㎎ / ㎖ 농도에서부터 50% 이상의 수치를 나타내었으 며 농도 증가에 따라 억제 활성도 소폭 증가하는 경향을 나타 내었다 . 초음파를 병행한 추출물이 그렇지 않은 시료에 비해

5% 가량 높은 억제 활성을 나타내었으며 , 특히 최고농도인

1.0 ㎎ / ㎖에서는 초음파를 병행한 시료가 양성대조군으로 사 용된 collagen type 1 및 ascorbic acid 를 상회하는 결과를 나타내었다 . 한 초음파를 병행한 에탄올 추출물의 경우

1.0 ^㎎ / ^{㎖ 농도의 첨가를 통해} 74.6% ^{의 가장 높은 억제활성을}

나타내었다 . ^{이는 병풀 유래 수용성 성분이 고농도의 처리를}

통해 송아지로부터 분리한 콜라겐보다 높은 활성을 나타낸 것 으로 피부재생 , 피부 면역활성 및 항노화 성분을 가져 피부외 상치료제로 이용되는 병풀이 향장제품으로도 적용 가능함을 시사하는 결과이다 . 한편 , 기존 tyrosinase 저해활성은 페놀함 량 및 항산화 효과와 상관관계에 있음이 보고됨에 따라 병풀 의 페놀함량 측정 연구도 함께 이루어져야 할 것으로 사료된 다 (Lee ^{et al} ., 2006).

5. Melanin ^생성량

추출물 투여를 통한 Clone M-3 세포의 melanin 생합성 및

세포 생존율을 알아보기 위하여 병풀 추출 시료를 각각 0.2,

0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎ / ㎖의 농도로 3 일간 처리하여 melanin 생 성량을 측정하였다 . ^{실험 결과} melanin ^{생성은 세포생존율 및}

형태학적 변화와는 많은 관련성을 보이지 않았으며 , ^초음파를

병행한 에탄올 추출물 시료가 0.2~1.0 ㎎ / ㎖의 각 농도에서 각 각 93.2%, 90.3%, 88.5%, 85.1%, 84.2% 의 생성량을 나타내 다른 시료들과 비교해 근소한 차이로 가장 높은 생성 억제 효 과를 나타내었다 . 특히 , 최고농도인 1.0 ㎎ / ㎖에서 60 ℃ 에탄 올 추출물 및 초음파를 병행한 에탄올 추출 시료가 각각

85.6% 와 84.2% 의 생성량을 나타냄에 따라 일반 100 ℃ 물 추

출물을 제외한 모든 조건의 병풀 추출물이 86.7% ^{를 나타낸}

양성대조군 ascorbic acid 에 비해 높은 생성 저해율을 나타내 었다 . 이를 통해 병풀 추출 시료가 melanin 생성량 억제에 효

과가 있음을 확인하였다 .

이상의 연구 결과를 통해 melanin 과다생성을 억제하면서

세포독성은 낮아야 하는 향장 미백소재로서 병풀의 활용 가능 성이 매우 높을 것으로 사료된다 .

감사의 글

본 연구논문은 한국학술진흥재단의 지원 ( 과제번호 KRF- 2007-314-C00271) ^{에 의해 얻은 결과이므로 이에 감사드립니다} .

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(Hausen).

Kim OT, Kim MY, Kim SJ, Kim YJ, Kim KS, Ahn JC, Kim

Table 1.

Effects of

extracts on melanin production in Clone M-3 cells.

Sample Concentrations (

/

)

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Melanin production (%)

Ascorbic acid 90.7 ± 0.6

90.0 ± 2.5 87.5 ± 3.0 86.7 ± 2.1 86.7 ± 1.8

60

EtOH 97.4 ± 0.4 94.5 ± 0.9 90.3 ± 1.7 86.4 ± 2.1 85.6 ± 1.8

60

EtOH with ultrasonification 93.2 ± 1.2 90.3 ± 1.8 88.5 ± 2.1 85.1 ± 1.3 84.2 ± 1.7

100

Water 99.6 ± 0.7 94.3 ± 1.2 92.4 ± 2.5 89.5 ± 2.9 88.9 ± 0.7

100

Water with ultrasonification 96.2 ± 0.5 90.9 ± 1.0 89.8 ± 1.9 86.6 ± 2.2 85.1 ± 1.8

†

Melanin content of non-treat control was set to 100%.

*

Mean values ± S.D. from three separate experiments are shown.

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