J. of Korean Orthopaedic Research Society Volume 5, Number 2, October, 2002
저강도 초음파가 인체 골 모세포(SaOS-2)와 인체 내피세포(HUVEC) 공동 배양에 미치는 영향
인제대학교 의과대학 일산백병원 정형외과학교실 주 석 규・김 병 직
= Abstract =
Effects of Low Intensity Ultrasound on the Co-Culture of Human Osteoblastic Cells (SaOS-2) with Endothelial Cells (HUVEC)
Suk-Kyu Choo, M.D., Byung-Jik Kim, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Inje University Ilsan Paik Hospital, Koyang, Korea
P u r p o s e : We investigated the effects of low intensity ultrasound on the co-culture of human osteoblastic cells with endothelial cells and analysed cell proliferation and growth factors that might be involved in bone formation.
Methods: Cell culture system was established with human osteoblastic cells (SaOS-2) and primary isolated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Low intensity ultrasound (1 MHz) treatment was adminis- tered for 20 minutes per day to each well for 4 consecutive days and its effects were determined by analysing cell proliferation activity, alkaline phosphatse and amount of growth factors such as basic fibroblast growth factor, transforming growth factor β1 and transforming growth factor β2 in the conditioned medium.
Results: Low intensity ultrasound treatment increased cell proliferation activity, level of the basic fibroblast growth factor and transforming growth factor β1 in the co-culture system. The levels of alkaline phosphatase and transforming growth factor β2 in the conditioned medium were not changed. We could not observe the change of cell proliferation or amount of various growth factors in a culture system of SaOS-2 or HUVEC.
Conclusion: The low intensity ultrasound treatment can increase osteogenesis by certain interaction between the two cells and increase in bFGF and TGF β1 participate in the process.
Key Words: Low intensity ultrasound, Co-culture, Human osteoblastic cells (SaOS-2), Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), Alkaline phosphatase, growth factors.
※ 통신저자: 주 석 규
경기도 고양시 일산구 대화동 2 2 4 0
인제대학교 의과대학 일산백병원 정형외과학교실 Tel: 031) 910-7913 Fax: 031) 910-7967 E-mail: [email protected]r
서 론
최근 저강도 초음파(low intensity pulsed u l t r a s o u n d )는 동물실험과 임상실험에서 가골 형성을 증가시켜 골 유합을 촉진시킨다는 사실이 밝혀졌으며 이 사실은 골 모세포들이 저강도 초음 파의 신호에 반응함을 시사하는 것이다1 3 ). 1983년 에 Xavier 등1 9 )은 인체에 30m W/cm2의 저강도 초음파를 불유합 부위에 하루에 2 0분씩 적용하여 7 0 %의 대상에서 아무런 부작용 없이 치유되는 것을 최초로 보고하였으며 동시에 Duarte 등4 )도 조직학적 분석과 촬영을 이용하여 저강도 초음파 가 토끼 비골 절골술에서 수술 후 1 3일째, 대조군 과 비교하여 가골 부위가 200% 이상 증가되어 골 유합을 촉진시켰다고 보고하였다.
이러한 사실은 저강도 초음파가 골 형성을 촉진 시킨다는 사실을 의미한다. 즉 기계적 에너지가 생물학적 신호에 영향을 주어 세포안의 유전자 발 현에 영향을 미치고 대사능의 변화를 초래한다고 추측되며 신호전달, 유전자발현, 혈행속도, 조직 형성 등 아직 규명되지 않은 복잡한 골 유합과정 과 여러 물질들이 지정된 장소와 제한된 시간의 연속하에 진행되어 골 형성을 촉진시킨다고 추론 하고 있다.
1 9 9 8년 Masaya 등1 4 )은 인체 골 모세포와 인체 내피세포 단독 배양으로는 저강도 초음파에 의한 세포 증식을 이룰 수 없으며 공동배양시 두 세포 간의 상호작용에 의해 인체 골 형성 기전에 작용 한다는 사실을 발표하였다.
본 연구에서는 인체 골 모세포주와 제대에서 분 리한 내피세포를 단독 혹은 공동 배양하여 저강도 초음파가 미치는 골 모세포증식의 변화와 골유합에 일차적으로 작용하는 것으로 알려진 세포증식인자 인 basic fiabroblast growth factor(bFGF), transforming growth factor (TGF) β1, TGF β2 및 alkaline phosphatase의 변화를 조사하고 자 단독 배양한 세포주와 공동 배양한 세포주에 초 음파를 투여한 군과 안한 군을 비교 분석하였다.
연구재료 및 방법
1. 세포주
모든 세포주는 3 7°C의 습성된 ( h u m i d i f i e d ) 5% CO2 배양기에서 계대배양 하였다. 골 모세포 주 단독 배양, 공동 배양에 사용된 세포주는 SaOS-2(Human osteoblastic cell line :한국 세포주은행)와 직접 임부의 탯줄에서 분리 배양한 일차 배양 내피세포(HUVEC:Human umbili- cal vein endothelial cells: primary culture) 를 사용하였다.
1) SaOS-2 (Human osteoblastic cells) 한국세포주은행 배양배지로 M c C o y’s 5A (antibiotics), 10% FBS(Fetal bovine serum) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 사 용하였으며 세포 분리에는 Trypsin 0.25%- EDTA 2.65 mM (3ml/55 cm2)을 사용하였다.
구체적인 세포 배양 과정은 S a O S - 2를 1 . 5×1 05 cells/well 의 농도로 6 well 배양접시( C o s t a r , Corning Incorporated, Corning, NY) 에 깔아 증식시켰고, 24시간 배양 후, 저강도 초음파 처리 를 각 w e l l당 2 0분씩 4일간 연속적으로 처리하였 다. 저강도 초음파 처리일 다음날 c o n d i t i o n e d m e d i u m과 세포 용해질을 각 w e l l에서 모아, 세포 수와 성장인자의 양을 측정하였다.
2) 인체 제대정맥 내피세포(HUVEC) 분리 및 배양 분만실에서 나온 신선한 제대를 구하여 70% 에 탄올에 담가 씻어 내었다. 양끝의 제대정맥을 찾 아 바늘을 꽂아 겸자로 고정시켰다. 주사기를 바 늘의 끝에 연결하여 항생제가 섞인 H B S S ( H a n k’s Balanced Salt Solution)로 여러 번 세척하여 불순물 및 혈액을 깨끗이 제거하였다. 한쪽 끝을 막은채 0.2% collagenase, 2 mM CaCl2 i n H B S S를 가득 채워 다른 한끝도 막고 3 7°C 항온 수조 또는 배양기에 넣고 1 5분간 유지시킨 다음 이 탯줄의 막힌 한쪽을 열고, 50 ml 원뿔형 t u b e에 용액을 모으고, HBSS로 두어 번 씻어 5 분간 1000 rpm으로 원심분리하였다. 침전물을 H B S S로 씻어 다시 원심분리한 후 마지막으로 배 양배지인 Heparin 5 U/ml, ECGS 100 mg/ml, 20% FBS in M199에 녹여 배양접시에
깔아 주었다.
초기 분리할 때 사용한 배지는 M199 (antibi- otics), Heparin (5 U/ml), ECGS(endothe- lial cell growth supplement-100 mg/ml)와 20% FBS(Fetal bovine serum)을 사용하였고, 그 후 계대 배양에는 M199 (antibiotics), ECGS (30 mg/ml)와 10% FBS 혼합배지를 사 용하였다. 세포 분리에는 Trypsin 0.025%- EDTA 0.01%를 처리하여 세포를 떨어뜨린 후 동일 부피의 Trpysin Neutralizing Solut i o n ( T N S )을 처리하였다. 세포 계대 배양과정은 H U V E C을 2×1 05 c e l l s / w e l l의 농도로 6 well 배양접시에 배양하였다. 24시간 배양 후 저강도 초음파 처리를 각 w e l l당 2 0분씩 4일간 연속적으 로 처리하였다. 저강도 초음파 처리일 다음날 conditioned medium과 세포 용해질을 각 w e l l 에서 모아, 세포수와 성장인자의 양을 측정하였다.
3) SaOS-2 + HUVEC (Co-Culture)
배양배지로 M c C o y’s 5A (antibiotics)와 10% FBS를 적응시켜 사용하였다. SaOS-2를 1 . 5×1 05 cells/well 의 농도로 6 well 배양접시 (human type I collagen-coated)에 깔아 배양 하 였 다 . 24시간 후 H U V E C을 2× 1 05 c e l l s / w e l l의 농도로 성장중인 SaOS-2 위에 혼합 배양시켰다. 24시간 후 저강도 초음파 처리를 각 w e l l당 2 0분씩 4일간 연속적으로 처리하였다.
2. 초음파 처리장치
(주)신진전자에 의뢰하여 저강도 초음파 신호( 1 MHz, 200ms burst sine wave repeating pulsation at 1.0 kHz, delivered at an intensity of 30 mW/cm2 spatial and tempo- ral average)를 발생시키는 장비를 주문 제작하였 다. 초음파 전달을 위하여 넓은 배양접시 외부 표 면에 젤을 처리하여 에너지를 전달 시켰다. Poly- styrene 재질의 6 well 배양접시를 사용하였으며 초음파가 배양접시를 통해 배양세포에 전달되는 것 은 o s c i l l o s c o p e을 이용, 직접 확인하였다3 ).
3. 세포 증식도 분석
세포 증식도의 측정은 tetrazolium 염을 f o r- m a z a n으로 변환시키는 세포의 대사능을 이용한 MTT [3- (4,5- Dimethylthiazol- 2- YL)- 5- (3- carboxymethoxyphenyl- EH- Tetrazoli- u m ) ]검색법 시약 G5421(Cell Titer 96 Aque- ous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit, Promega, USA)를 사용하였다.
흡광도의 정도는 세포수와 정비례한다는 성질을 이용 하여 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 세포수 증가 정도를 알아보았다. 세포의 증식과 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 기법 중 가장 직접적이고 이상적인 방법은 세포에 t r y- pan blue 등을 처리한 후 현미경과 혈구계 ( h e m o c y t o m e t e r )를 이용하여 살아있는 세포수 를 세는 것이지만 시간과 너무 많은 노력이 요구 되므로 검체 수가 많을 경우에는 사용할 수 없기 때문에 본 연구에서는 살아있는 세포수를 간접적 으로 측정하는 M T T검색법을 이용하였다.
최종 정량은 ELISA reader로 490 nm의 흡광 도를 측정하였다. 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영 한다. 우선 M T S와 PMS(phenazine Metho- sulfate) 용액을 3 7°에서 1 0분, 또는 실온에서 9 0분간 완전히 녹였다. MTS 2 ml과 PMS 100 μl를 사용 직전에 섞어 준비했다. 세포가 있는 각 w e l l에 2 0μl씩 준비한 용액을 넣었다. 37°의 5 % CO2 배양기에 넣어 1시간에서 4시간가량 반응시 킨 후 490 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
4. Alkaline Phosphatase(ALP) 활성도 측정
Alkaline Phosphatase 측정은 D G 1 2 4 5 ( A L P Optimized Colorimetric Test Kit, Sigma, NY, USA)를 사용하여 측정하였다. 완충용액은 ALP reagent A: Diethanolamine buffer pH 9.8, 1.213 mol/L, 0.607 mmol/L, ALP reagent B: P-Nitrophenyl phosphate 60.8 mmol/L ALP로 구성되며 흡광도를 405 nm에 보정하였다.
5. 인체 basic fibroblast growth factor(bFGF) 정량
인체 bFGF 측정은 Q u a n t i k i n e / h u m a n FGF basic immunoassay Kit, DFB50 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다. 시약 k i t에 제공된 표준용액을 이용 흡광도를 정량화 할 수 있었으며 측정할때 마다 표준곡선을 만들어 비교 분석하였다.
6. Transforming growth factor (TGF) β1 측정
TGF β1의 측정은 TGF b1 Emax Immunoas- say System Kit, G1230 (Promega, Madi- son, WI, USA)를 사용하였다. Kit에 제공된 표준용액과 비교하여 흡광도를 TGF beta1의 농 도로 저량화 할 수 있었다.
7. Transforming growth factor(TGF) β2 측정
TGF β2측정은 Emax ImmunoAssay Sys- tem kit, G3400 (Promega, Madison, WI, U S A )를 사용하였다.
8. 통계적 처리
초음파를 투여한 군과 안한 군에 대해 S a O S - 2 단독배양, HUVEC 단독배양, 두 세포의 공동배 양에 대해 매 항목(세포증식도, Alkaline phos- phatase, bFGF, TGFβ1, TGFβ2) 마다 배양 시작시 3개의 well, 배양 시작후 3개의 w e l l에 대해 MTT assay 측정값을 6 ~ 8회 반복 측정하 여 SPSS 7.5 프로그램을 이용하여 반복 측정값 에 대한 분산 분석을 시행하였다.
*A490nm: optimal density at 490 nm +US: treated with ultrasound
Fig. 1. Effect of low intensity ultrasound on cell prolifera- tion activity in SaOS-2 cell line, HUVEC, and Co- culture. The Ultrasound had no effect on the iso- lated culture of SaOS-2 or HUVEC(top and mid- dle) but showed increased cell proliferation on co- culture of the two cells(bottom).
A B
C
결 과
1. 저강도 초음파에 대한 세포증식도 측정
세포증식도의 변화는 저강도 초음파를 처리하지 않은 SaOS-2 세포주에서 배양 시작시 490 nm 에서의 흡광도가 0 . 2 2 6±0 . 0 0 9이었으며, 배양 4 일째에는 0 . 4 5 5±0 . 0 0 1이었다. 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작시 0 . 1 7 1±0 . 0 0 6이 었으며, 배양 4일째 0.400 ±0 . 0 0 3으로 측정되어 저용량 초음파에 의한 세포증식도의 차이가 나타 나지 않았다(Fig. 1A).
HUVEC 세포의 경우 저강도 초음파를 처리하 지 않은 배양 시작 세포에서 490 nm에서의 흡광 도가 0 . 1 5 7±0 . 0 0 5이었으며, 배양 4일째는 0 . 3 0 2±0 . 0 0 1이었다. 저강도 초음파를 처리한 세 포에서는 배양 시작시 흡광도가 0 . 1 5 2±0 . 0 0 3이
었으며, 배양 4일째 0 . 3 0 0±0 . 0 1 7로 저용량 초음 파에 의한 세포증식도의 차이가 역시 나타나지 않 았다(Fig. 1B).
공동배양한 세포의 경우는 저강도 초음파를 처 리하지 않은 배양 시작 세포의 흡광도는 0 . 2 1 7±
0 . 0 0 8이었으며, 배양 4일째 0 . 3 1 6±0 . 0 1 4이었 다. 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시 작시 흡광도가 0 . 2 5 6±0 . 0 0 6이었으며, 배양 4일 째 0 . 4 3 9±0 . 0 0 9로 저강도 초음파를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군을 배양 4일째 비교한 결과 통계적으로 유의한 차이가 뚜렷하여(P<0.01), 저 강도 초음파가 세포증식도에 영향을 미쳤음을 알 수 있었다(Fig. 1C).
2. 저강도 초음파에 대한 Alkaline Phos- phatase(ALP) 활성도 측정
ALP 활성도의 변화는 저강도 초음파를 처리하
*A405nm: optimal density at 405 nm +US: treated with ultrasound
Fig. 2. Effect of low intensity ultrasound on alkaline phosphatase activity in SaOS-2 cell line, HUVEC, and Co-culture. Ultrasound had no effect on Alka- line Phosphatase activity in SaOS-2(top), HUVEC (middle), or co-culture of the two cells (bottom).
C
A B
지 않은 SaOS-2 세포주에서 배양 시작시 흡광도 가 1 7 . 5 3±0.09, 배양 4일째에서 2 1 . 0 2±0 . 1이 며 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작 시 1 0 . 0 2±0 . 0 6이었으며, 배양 4일째 1 3 . 7 7±
0 . 0 3으로 측정되어 저강도 초음파에 의한 A L P 활성도의 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2A).
HUVEC 세포의 경우 저강도 초음파를 처리하 지 않은 배양세포에서 배양 시작시 흡강도가 9 . 8 8±0 . 0 0 5이었으며, 배양 4일째 1 2 . 0 1±0 . 0 0 1 으로, 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작시 9 . 7 6±0 . 0 9에서, 배양 4일째 1 3 . 2 0±
0 . 0 2로 측정되어 저강도 초음파에 의한 ALP 활 성도의 차이가 역시 나타나지 않았다(Fig. 2B).
공동배양한 세포의 경우도 저강도 초음파를 처 리하지 않은 배양세포에서 시작시 2 2 . 3 5±0 . 0 8이 었으며, 배양 4일째에는 4 0 . 0 6±0 . 0 4로, 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작시 2 0 . 0 1
±0 . 0 5이었으며, 배양 4일째 3 3 . 5 5±0 . 0 6으로 저강도 초음파에 의한 ALP 활성도의 차이가 전 혀 나타나지 않았다(Fig. 2C).
3. 저강도 초음파에 대한 basic fibroblast growth factor(bFGF) 측정
동일한 세포배양 기법으로 분석한 b F G F의 변 화는 저강도 초음파를 처리하지 않은 SaOS-2 세 포주에서, 배양 시작시 25 pg/ml±0.26, 배양 4 일째에서 120 pg/ml±3 . 4 6이며 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작시 40 pg/ml±1 . 3 0 에서, 배양 4일째 130 pg/ml±2 . 8 8로 측정되어 저강도 초음파에 의한 b F G F의 차이가 나타나지 않았다(Fig. 3A).
HUVEC 세포의 경우 저강도 초음파를 처리하 지 않은 배양세포에서 배양 시작시 20 pg/ml±
0 . 0 7이었으며, 배양 4일째 105.4 pg/ml±7 . 0 2 이었다. 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작시 18.5 pg/ml±5 . 2 6에서, 배양 4일째 102.8 pg/ml±7 . 3 4로 저강도 초음파에 의한 b F G F의 차이가 역시 나타나지 않았다( F i g . 3B).
+US: treated with ultrasound
Fig. 3. Effect of low intensity ultrasound on basic fibrob- last growth factor(bFGF) in SaOS-2 cell line, HUVEC, and Co-culture. Ultrasound had no effect on isolated culture of SaOS-2(top), or HUVEC (middle) but increased bFGF activity in co-culture of the two cells(bottom).
A B
C
공동배양한 세포의 경우는 저강도 초음파를 처 리하지 않은 배양세포에서 배양 시작시 b F G F의 농도는 43 pg/ml±2 . 3 8이었으며, 배양 4일째 130.5 pg/ml±9 . 8 3이었다. 저강도 초음파를 처 리한 세포에서는 40 pg/ml±3.66, 175 pg/ml
±6 . 5 4로 저강도 초음파를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군을 배양 4일째 비교한 결과 통계적으 로 유의한 차이가 뚜렷하여(P<0.01), 저강도 초 음파가 b F G F의 생성에 영향을 미쳤음을 알 수 있었다(Fig. 3C).
4. 저강도 초음파에 대한 TGF β1 측정
TGF β1의 변화는 저강도 초음파를 처리하지 않은 SaOS-2 세포주에서 배양 시작시 TGF β1 의 농도는 70 pg/ml±2 . 3 7이었으며, 배양 4일째 에서 220 pg/ml±5 . 6 8이었다. 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 시작시 72 pg/ml±5 . 3 4이었 으며, 배양 4일째 205 pg/ml±4 . 3 3으로 측정되 어 저강도 초음파에 의한 TGF β1의 차이가 나타
나지 않았다(Fig. 4A).
HUVEC 세포의 경우도 저강도 초음파를 처리 하지 않은 배양세포에서 배양 시작시 T G F b e t a 1의 농도는 12 pg/ml±0 . 2 2이었으며, 배양 4일째는 10 pg/ml±0 . 0 4이었다. 저강도 초음파 를 처리한 세포에서는 배양 시작시16 pg/ml±
0 . 0 6이었으며, 배양 4일째 17 pg/ml±0 . 0 4로 저강도 초음파에 의한 TGF β1의 차이가 역시 나 타나지 않았다(Fig. 4B).
공동배양한 세포의 경우는 저강도 초음파를 처 리하지 않은 배양세포 배양 시작시 TGF beta 1 의 농도가 80 pg/ml±7 . 2 3이었으며, 배양 4일째 280 pg/ml±6 . 1 5이었다. 저강도 초음파를 처리 한 세포에서는 배양 시작시 101 pg/ml±1 . 9 6이 었으며, 배양 4일째 380 pg/ml ±5 . 8 2로 저강도 초음파를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군을 배 양 4일째 비교한 결과 통계적으로 유의한 차이가 뚜렷하여(P<0.01), 저강도 초음파가 TGF β1의 생성에 영향을 미쳤음을 알 수 있었다(Fig. 4C).
TGF β2의 농도는 저강도 초음파를 처리하지
A B
C
+US: treated with ultrasoundFig. 4. Effect of low intensity ultrasound on transforming growth factor(TGF) β1 activity in SaOS-2 cell line, HUVEC, and Co-culture. Ultrasound hd no effect on isolated culture of SaOS-2(top) and HUVEC (middle) but increased TGF beta1 activity in co- culture of the two cells(bottom).
않은 SaOS-2 세포주에서 배양 시작시 47 pg/ml
±2.33, 배양 4일째에서 65.5 pg/ml±5 . 7 5이었 으며 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시 작시 40 pg/ml±3.22, 배양 4일째 57 pg/ml±
5 . 9 2로 측정되어 저강도 초음파에 의한 TGF β2 의 차이가 나타나지 않았다(Fig. 5A).
HUVEC 세포의 경우 저강도 초음파를 처리하 지 않은 배양세포에서 배양 시작시 38 pg /ml±
2 . 0 4이었으며, 배양 4일째 45 pg/ml±4 . 8 1이었 다. 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시 작시 47 pg/ml±5 . 0 7이었으며, 배양 4일째 4 7 p g / m l±7 . 4 6으로 저강도 초음파에 의한 TGF β 2의 차이가 역시 나타나지 않았다(Fig. 5B).
공동배양한 세포의 경우도 저강도 초음파를 처 리하지 않은 배양세포에서 배양 시작시 6 5 p g / m l±6 . 2 5이었으며, 배양 4일째 60 pg/ml±
6 . 9 3이었다. 저강도 초음파를 처리한 세포에서는 배양 시작시 56 pg/ml±3.63, 배양 4일째 5 9 p g / m l±4 . 6 2로 저강도 초음파를 처리한 군과 처 리하지 않은 대조군을 배양 4일째 비교한 결과 통
계적으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 5C).
고 찰
저강도 초음파는 Kristiansen, Klug, Wang
등1 0 , 1 1 , 1 8 )많은 사람들에 의해 동물실험과 인체실험
을 통하여 안전하면서도 골 유합을 촉진시키고 불 유합을 치유할 수 있다고 입증되었다. 하지만 아 직도 그 기전에 대해서는 정확하게 입증되지 못했 다. 그동안 많은 연구에 의해 Yang 등2 0 )은 Aggrecan gene expression의 증가에 의한다고 하였고 세포막의 투과성의 변화에 의해 c a l c i u m i o n의 흡수가 증가되는 것이 중요 기전이라고 하 였다.
1 9 9 8년 Masaya 등1 4 )은 인체 골 모세포와 인체 내피세포와의 상호작용이 인체 골 형성 기전에 작 용한다는 사실을 발표하였다. 본 연구는 인체 골 모세포주와 내피세포를 단독 혹은 공동 배양하여 저강도 초음파가 미치는 세포증식의 변화와 골 유 합에 일차적으로 작용하는 것으로 알려진 세포증
+US: treated with ultrasound
Fig. 5. Effect of low intensity ultrasound on transforming growth factor(TGF) β2 activity in SaOS-2 cell line, HUVEC, and co-culture. Ultrasound had no effect on SaOS-2(top), HUVEC(middle) or co-culture of the two cells(bottom).
A B
C
식인자들의 변화를 조사하고자 하였다.
저강도 초음파가 세포의 특성이나 단백질 합성 에 미치는 기전에 대해서 밝혀진 연구결과는 매우 제한적이지만 여러 추론이 가능하다. Ryaby 등1 7 ) 은 세포막 투과성에 변화를 유도하여 특정 이온이 나 신호물질, 단백질의 수송이 영향을 받아 세포 막 안의 유전자 발현에 영향을 미칠 수도 있다 하 였으며 Jinguishi 등7 )는 세포골격이 세포간질에 부착되는 성질을 바꾸어 유전자 발현의 변화를 유
도할 수도 있다고 하였고, Wang 등1 8 )은 초음파 의 기계적 에너지에 민감할 수 있는 세포막의 양 이온 이동통로가 영향을 미칠 수도 있을 것이며, 미세한 온도변화에도 민감한 효소의 활성변화로 일어날 수도 있을 것이며, 이러한 모든 가능성이 복합적으로 진행될 수도 있다. 본 연구에서 단독 으로 배양한 세포에서는 유의성을 찾을 수 없는 것으로 볼 때, 초음파 신호가 전달되기 위해서는 공동 배양을 통한 세포간 단백질이나 세포 차원에
Table 1. The result of effect of low intensity ultrasound on culture of SaOS-2 and HUVEC and co-culture of the two cells.
Control
initial 4day difference
cell proliferation SaOS-2 0.226+0.009 0.455+0.001 0.229
(O.D. at 490 nm) HUVEC 0.157+0.005 0.302+0.001 0.145
co-culture 0.217+0.008 0.316+0.014 0.099
ALP SaOS-2 17.53+0.09 21.02+0.1 3.49
(O.D. at 405 nm) HUVEC 9.88+0.005 12.01+0.001 2.13
co-cul.ture 22.35+0.08 40.06+0.04 17.71
b-FGF SaOS-2 25+0.26 120+3.46 95
(pg/ml) HUVEC 20+0.07 105.4+7.02 85.4
co-culture 43+2.38 130.5+9.83 87.5
TGF beta1 SaOS-2 70+2.37 220+5.68 150
(pg/ml) HUVEC 12+0.22 10+0.04 2
co-culture 80+7.23 280+6.15 200
TGF beta2 SaOS-2 47+2.33 65.5+5.75 17.5
(pg/ml) HUVEC 38+2.04 45+4.81 7
co-culture 65+6.25 60+6.93 5
Ultrasound treated
initial 4day difference
cell proliferation SaOS-2 0.171+0.006 0.400+0.003 0.229
(O.D. at 490 nm) HUVEC 0.152+0.003 0.30+0.017 0.148
co-culture 0.256+0.006 0.439+0.009 0.183
ALP SaOS-2 10.02+0.06 13.77+0.03 3.75
(O.D. at 405 nm) HUVEC 9.76+0.09 13.20+0.02 3.44
co-culture 20.01+0.05 33.55+0.06 13.54
b-FGF SaOS-2 40+1.30 130+2.88 90
(pg/ml) HUVEC 18.5+5.26 102.8+7.34 87.3
co-cultur 40+3.66 175+6.54 13
TGF beta1 SaOS-2 72+5.34 205+4.33 133
(pg/ml) HUVEC 16+0.06 17+0.04 1
co-culture 101+1.96 380+5.82 279
TGF beta2 SaOS-2 40+3.22 57+5.92 17
(pg/ml) HUVEC 47+5.07 47+7.46 0
co-culture 56+3.63 59+4.62 3
서 특유의 전달기전이 있을 것이라 추론할 수 있다.
Growth Factor중 acidic FGF(FGF-1)와 basic FGF(FGF-2)는 주로 단핵세포, 대식세 포, 파골세포와 연골세포에 의해 생성되고 중배 엽, 신경외배엽 세포에 관여한다. 그중에서 b F G F 는 가골의 양과 유기질 성분을 증가 시킨다5 ).
TGF β는 골의 발육과 치유과정에 중요한 역할 을 하는 것으로 알려져 있다. 인체의 거의 모든 세포들이 TGF β를 합성하고 또 그 수용체를 갖 고 있다. 하지만 골모 세포가 제일 많이 생산을 하고 그 다음이 혈소판이다. 또한 가장 많은 수용 체를 갖고 있는 것도 골 모세포이다. 골 모세포에 서 생산된 TGF β는 골의 세포외기질에 저장되어 있어서 인체에서 가장 큰 저장소이기도 하다8 ).
TGF β는 골 세포, 골 모세포, 파골 세포, 연 골세포 등에 의해 생성되지만 전반적인 역할은 골 모세포 증식을 촉진시키고 교원질 합성을 증가시 키는 것이다. 따라서 골절 치유 과정에서 매우 중 요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 외부에서 TGF β를 골절 부위에 주입을 하면, 골절 치유 과정에서 골 모세포를 증식시키는 것을 볼 수 있
다1 2 ). 또 골절 치유 과정 중, 연골형성 과정과 연
골내 골화 과정 중에 TGF β1 유전자의 발현이 특히 많고 막내 골화 과정에서는 상당히 적은 것 으로 알려져 있다1 ). 또한 TGF β1은 골절 치유 과정 중 처음부터 다량으로 발현되는 것이 아니라 수상 후 2주부터 그 유전자의 발현이 증가하여 계 속 높은 양을 유지한다고 하며 바로 2주라는 시기 는 골절 후 연골성분이 가장 많은 시기이다. 반면 에 TGF β2는 골절 초기부터 다량 발현되어 계속 높은 발현율을 유지한다9 , 1 5 ). 그래서 TGF β1의 역할은 골절 치유과정 시작부터가 아니라 어느 정 도 진행된 후부터 중요하다고 생각된다. 본 연구 에서는 저강도 초음파가 골 모세포와 내피세포의 공동 배양에서 TGF β1의 상승을 유발하는 것을 관찰하였다. 하지만 본 연구에서 확인한 TGF β1 의 상승기전을 이해하기 위해서는 추가적인 연구 가 계속되어야 할 것 같다.
Alkaline Phosphatase는 인체의 간, 골, 소 장, 비장등에서 생산되는 i s o e n z y m e이다. 그 중 에서도 골에서 가장 많이 생산되며 골 모세포가 alkaline phosphatase를 생산하고 a l k a l i n e
p h o s p h a t s e의 혈청농도가 올라가는 것은 골 모 세포의 활동성이 증가하거나 또는 골형성을 의미 한다. 예를 들어 구루병이나 골 육종 같이 골 형 성 기능이 항진된 골 질환에서 혈청농도의 증가를 볼 수 있다2 , 6 , 2 1 )
. Yoo 등2 1 )에 의하면 골 유합 기간 중에는 전구세포들의 연골화 과정이 진행되면서 동시에 alkaline phosphatase의 증가를 관찰할 수 있으며 이 시기는 무기질이 축적되기 시작할 단계이다. 골 모세포의 기능은 무기질을 가골 기 질에 축적시키는 것으로 골 모세포가 활동할 때 alkaline phosphatse가 증가한다는 것을 알 수 있다.
본 연구에서는 저강도 초음파에 의해 골 모세포 의 증식이 증가한다는 것을 확인하였으나 a l k a- line phosphatase의 증가는 없었다. 이것은 저 강도 초음파가 공동배양을 통해 골 모세포를 증식 시키지만 활동성과는 무관하거나 아니면 세포배양 조건이 새로 생성된 골 모세포가 활동성을 띄울 수 있는 환경이 아니고 골 모세포의 활동성이 증 가할려면 또 다른 조건이 동반되야 한다는 것을 의미한다.
인체 골 모세포주와 인체내피세포를 공동배양했 을 때에 미치는 저강도 초음파의 효과는 세포증식 도의 증진과 bFGF, TGF β1의 상승이었으며, 세포분화의 지표로 알려진 A L P와 TGF β2의 경 우는 전혀 변화가 없었다. 또한 인체 골 모세포주 나 인체내피세포만의 세포배양에서는 저강도 초음 파의 효과를 발견할 수 없었기 때문에 초음파의 신호를 매개로 두 세포들 사이의 상호작용이 특정 유전자군에 신호가 전달되어 이루어진 결과라고 추론한다.
결 론
저강도 초음파가 골 유합을 촉진시킬 수 있는지 여부와 그 기전을 알고자 인체 골 모세포와 제대 에서 분리한 인체 내피세포를 단독 혹은 공동 배 양하여 세포증식도 및 세포증식인자에 대한 실험 을 하였다.
인체 골 모세포주와 제대에서 분리한 인체내피 세포를 공동 배양할 수 있었으며 이때 미치는 저 강도 초음파의 효과는 세포증식도의 증진과
bFGF, TGF β1의 상승이었다. 반면 세포분화의 지표로 알려진 A L P와 TGF β2의 경우는 전혀 변화가 없었다. 또한 인체 골 모세포주나 인체내 피세포만의 세포배양에서는 저강도 초음파의 효과 를 발견할 수 없었다. 이러한 사실은 저강도 초 음파가 골 형성을 촉진시키고 그러기 위해서는 골 모세포와 내피세포의 상호작용이 필요하며 그 과 정에 b F G F와 TGF β1이 관여한다는 것을 시사 한다.
R E F E R E N C E S
01 ) Bostrom M and Asnis P: TGF beta in Fracture Repair. Clin Orthop and Related Research , 355s:
124-131, 1998.
02 ) Burtis CA and Ashwood ER: Clinical Chemistry.
2nd ed. Philadelphia:WB Saunders, 1940-1942, 1 9 9 7 .
03) Choi HH: Bio Medical Engineering, College of Biomedical Science and Engineering, Inje universi- ty, personal communication.
04 ) Duarte LR : The stimulation of bone growth by ultrasound. Arch Orthop Trauma Surg, 101:153- 159, 1983.
05 ) Einhorn TA: Enhancement of fracture Healing. In : Pritchard DJ ed. Instructional Course Lecture. A m Academy Orthop Surg, 401-416, 1996.
06 ) Henry JB: Clinical Diagnosis and Management by laboratory meathods. 19th ed, Philadelphia, W B S a u n d e r s, 178-183, 1996.
07 ) Jingushi S, Heydemann A and Kana SK: Acidic fibroblast growth factor injection stimulates carti- lage enlargement and inhibits cartilage gene expres- sion in rat fracture. J Orthop Res, 8:364-371, 1990.
08 ) Joyce ME, Jingushi S and Bolander ME: Trans- forming growth factor-βin the regu -lation of frac- ture repair. Orthop Clin North Am, 2:199-209, 1990.
09 ) Joyce ME, Roberts AB and Sporn MB: Trans- forming growth factor-βand the initia -tion of chon- drogenesis in the rat femur. J Cell Biol, 110:2195- 2207, 1990.
1 0 ) Klug S-J, Lewallen DG and Bolander ME: Low
intensity ultrasound treatment increa -ses strength in a rat femoral fracture model. J Orthop Res, 12:40- 47, 1994.
1 1 ) Kristiansen TK, Ryaby JP, McCabe J, Frey JJ and Roe LR: Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific low intensity ultra- sound. J Bone Joint Surg, 79-A:961-973, 1997.
1 2 ) Lind M, Schmacker B and Soballe K: Transform- ing growth factor-βenhances fracture healing in rab- bit tibiae. Acta Orthop Scand, 64:553-556, 1993.
13) Macey LR, Kana SM and Jinguish S: Defects of early-fracture healing in experimental diabetes. J Bone Joint Surg [Am], 71:722-733, 1989.
1 4 ) Masaya I, Yoshiaki A, Tomihiro O and Keiji K:
Effect of ultrasound on the co -culture of osteoblast with endothelial cells. Proceedings of the 6th meet- ing of the International Society for Fracture Repair.
Strasbourg, France, Sept 23-26, 1998.
1 5 ) Rosier RN, Okeefe RJ and Hicks DG: The Poten- tial Role of TGF beta in Fracture Healing. C l i n Orthop and Related Research, 355s:294-300, 1998.
1 6 ) Ryaby JT, Bachner EJ and Bendo J: Low intensi- ty pulsed ultrasound increases calsium incorporation in both differentiating cartilage and bone cell cul- tures. Trans Orthop Res Soc, 14:15, 1989.
1 7 ) Ryaby JT, Matthew J and Duarte-Alves P: Low intensity pulsed ultrasound affects adenylate cyclase activity and TGF-βsynthesis in osteoblastic cells.
Trans Orthop Res Soc, 17:590, 1992.
1 8 ) Wang N, Butler JP and Ingber DE: Mechan- otransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. S c i e n c e, 260:1124-1127, 1993.
1 9 ) Xavier CA and Duarte LR: Estimulaci ultra-soni- ca de callo osseo Applicana clinica. Rev Brasileira O r t h o p, 18:73-80, 1983.
2 0 ) Yang KH, Parvizi J, Wang SJ et al: Exposure to low density ultrasound increases aggrecan gene expression in a rat femur fracture model. J Orthop R e s, 14:802-809, 1996.
2 1 ) Yoo JU and Johnstone B: The role of osteochon- dral progenitor cells in Fracture re -pair. Clin Orthop and Related Research, 355s:73-81, 1998.
