The Immuno-modulatory Effect of Root of Asarum sieboldii Miq. Water Extract on OVA-induced Asthma

세신 전탕액 경구투여가 천식 억제 및 면역조절에 미치는 영향

조성은

, 강재희

, 이현

1대전대학교 한의과대학 침구의학교실

[Abstract]

TheImmuno-modulatoryEffectofRootof AsarumsieboldiiMiq.Water ExtractonOVA-inducedAsthma

SeoungEunJo

,JaeHuiKang

andHyunLee

1

DepartmentofAcupuncture&MoxibustionMedicine,CollegeofKoreanMedicine, DaejeonUniversity

Objectives : Theaimofthisstudywastoinvestigatetheasthma-suppressiveandimmuno-reg- ulatoryeffectofAHCR-HA(RootofAsarumsieboldiiMiq.waterextract)onOVA(ovalbumin)- inducedasthmainmice.

Methods : AllC57BL/6miceexperimentalgroups,excepttheNormalandN-AHCRgroups,were sensitizedwithOVA.ThemiceintheN-AHCRgroupandtheOVA-AHCRgroupweretreated withwaterextractofAHCR(1%)byanoraladministration,andtheOVA-Salinegroupwere treatedwithsalinesolution.OraldosesofAHCRwaterextractandsalinewereadministered for8weeks,threetimesaweek.

Results & Conclusion : ThelungweightandtotalcellsinthelungsoftheOVA-AHCRgroupde- creasedsignificantlycomparedwiththoseoftheOVA-Salinegroup.Totalleukocytesand eosinophilsinBALFandphotomicrographsoftheOVA-AHCRgroupdecreasedsignificantly comparedwiththoseoftheOVA-Salinegroup.Thecollagenaccumulationinthelungsections oftheOVA-AHCRgroupdecreasedsignificantlycomparedwiththoseoftheOVA-Saline group.TheconcentrationsofIL-4,IL-5,IL-13andIgEinBALFandtheserumoftheOVA- AHCRgroupdecreasedsignificantlycomparedwiththoseoftheOVA-Salinegroup.ThemRNA expressionsofTNF-α,IL-1β,IL-4,IL-5andIL-13inthelungsoftheOVA-AHCRgroupde- creasedsignificantlycomparedwiththoseoftheOVA-Salinegroup.

✱ Correspondingauthor:DepartmentofAcupuncture&MoxibustionMedicine,CheonanOriental HospitalofDaejeonUniversity,4,Notaesan-ro,Seobuk-gu,Cheonan-si,Chungcheongnam- do,331-958,RepublicofKorea

Tel:＋82－41－521－7578 E－mail:lh2000@dju.kr Key words :

Asthma;AHCR-HA;

Immuno-modulatory effect

Received : 2016. 02. 12.

Revised : 2016. 02. 29.

Accepted : 2016. 03. 02.

On－line : 2016. 03. 18.

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I. 서론

천식은 바이러스, 알레르기 항원 등 다양한 자극원에 의 한 기관지 반응 증가로 생리적인 기도의 광범위한 수축과 함께 기침, 발작적 호흡곤란, 천명 등의 임상적 증상이 나 타나는 질환이다

.

천식의 원인은 감염, 대기 오염, 심인적 요인 등 다양한 데 현재는 알레르기 질환의 하나로 인식되고 있는 것이 통 상적이다

. 최근 산업화, 환경오염, 주거 및 작업 환경 변화 로 인해 각종 알레르기 질환이 늘어남에 따라 천식의 유병 률 또한 지속적 증가 추세를 보이고 있다

. 국내 통계에 따 르면 만 19세 이상에서 천식 유병률은 98년 1.1 %에서 2013 년 3.0 %로 점차 증가하는 경향을 보이며

, 2014년 청소년 의 천식 진단율은 9.2 %에 달하는 것으로 보고되고 있다

. 천식은 병리학적으로 기도의 과민성과 함께 반복적 염증 을 특징으로 하는데, 발병 시 기도 내에 활성화된 T세포, 비 만세포, 호산구 등의 염증세포들로부터 사이토카인(cy- tokine), 케모카인(chemokine) 등 다양한 면역물질들이 분비된다

. 이 중 T조력세포(이하 Th세포)는 분비된 사이 토카인의 종류에 따라 Th

세포와 Th

세포가 나뉘어 서로 길항작용을 하며 이 과정이 천식을 유발하는 중

요한 기전이 되는 것으로 알려져 있다

. 한의학에서는 천식이 哮喘證의 범주에 속한다 고 할 수 있는데, 喘이란 呼吸急促한 것이고, 哮 란 喉中有聲響한 것을 의미한다

. 《東醫寶鑑》

에서 哮란 痰喘이 심해져 발작하는 것이라 하여 哮喘의 원인을 주로 호흡기의 痰氣로 인한 것으 로 보았으며, 이 외에 外感, 食傷, 勞倦, 體質적 素因과 함께 痰의 발생에 관계가 깊은 肺, 脾, 腎 三臟의 機能失調를 원인으로 보았다

세신(Root of Asarum sieboldii Miq.)은 性 溫味辛하고 心肺腎으로 歸經하여 祛風散寒, 通 窺止痛, 溫肺化飮하는 효능이 있어 感冒, 牙痛, 頭痛, 鼻塞, 風濕痺痛 등에 사용되어 왔다

.

최근에는 세신 추출물의 염증 억제 및 항산화 반응, 혈관 평활근의 조절, 항알레르기 효과 등 에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다

. 국 내 연구에서는 김 등

, 류 등

이 세신약침을 足 三里와 肺兪에 각각 적용하여 천식 억제와 면역 조절 기능이 있음을 보고한 바 있으나 세신 전탕 액의 경구투여와 관련된 실험적 연구는 아직 보 고된 바 없었다.

이에 저자는 세신 전탕액 경구투여가 천식에 미치는 영향을 규명하고자 정상 mouse와 알레

르기 천식이 유발된 mouse를 대상으로 세신 전탕액을 경 구로 투여하여 천식 억제 및 면역조절 작용에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 방법

1.재료 1)동물

동물은 4~5주령의 수컷 C57BL/6 mouse(21±2 g)를 대한실험센터(강원)에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료 (삼양사료, 한국) 및 물을 충분히 공급하고, 실온은 22±2 ℃, 습도는 50~60 % 상태를 유지하며 2주간 실험실 내 환경에 적응하도록 한 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 대전대학교 동물실험 윤리규정을 준수하여 시행하였다.

2)시약및기기

(1) 시약

본 실험에서 사용한 시약은 Table 1과 같다.

Table1.Reagents

Reagents Manufacturer Country

Aluminum potassium sulfate(alum)

Chicken egg albumin(ovalbuminOVA : grade Ⅳ) RBC lysis solution

Diethyl pyrocarbonate(DEPC) Ethidium bromide(EtBr) Isopropanol

D-phosphate buffer saline

Dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS) Collagenase

RPMI-1640 medium Chloroform

Sigma U.S.A.

Fetal bovine serum(FBS) Logan U.S.A.

Deoxynucleotide triphosphate(dNTP) Taq polymerase

Transcriptase

Moloey Murine Leukemia Virus Reverse M-MLV RT RNase

Transcriptase M-MLV RT RNase inhibitor

TaKaRa Japan

RNAzolB Tel-Test U.S.A.

IgE ELISA KIT Shibayagi Japan

IL-4 ELISA KIT IL-5 ELISA KIT IL-13 ELISA KIT

Biosource Biosource R＆DSystems

U.S.A

Agarose FMC U.S.A.

Hemacolor rapid staining set Merck Germany

(2) 기기

본 연구에서 실험에 사용한 기기는 Table 2와 같다.

3)약재

실험에 사용한 세신(Root of Asarum sieboldii Miq., 이하 AHCR)은 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 것 을 정선하여 사용하였다.

세신 100 g에 증류수 1,000 ㎖을 가하여 약탕기(웅진, 한국)에 넣고 3시간여 동안 달여서 추출한 후 여과하고 감

압증류기를 이용해서 분말로 만들어 PBS에 1 %로 희석해 서 실험동물에 경구투여하였다.

2.방법

1)Asthma mouse model

실험 1주차 200 ㎕의 OVA/alum(500 ㎍/㎖)을, 2~3주 째에는 100 ㎕ OVA/alum(500 ㎍/㎖)을 생쥐의 복강내에 투여(i.p)하였다. 4주째에는 마취 후에 100 ㎕의 OVA/

alum(500 ㎍/㎖)을 기도에 투여(i.t)하였다. 5~8주째까지 는 40 ㎕의 OVA/PBS(2.5 ㎎/㎖)을, 9~12주째까지는 40

㎕의 OVA/PBS(5 ㎎/㎖)를 air compressor를 통해 20분 간 일주일에 총 3회 노출시켰다(Fig. 1).

2)약물투여

실험 5~12주째까지 8주간 주 3회 1 % 세신 전탕액 100

㎕을 oral zonde needle을 이용하여 경구투여하였다 (Fig. 1).

3)실험군

동물은 10마리를 1군으로 하여, 정상군(Normal), 정상- 세신군(N-AHCR), 천식-saline군(OVA-saline), 천식- 세신군(OVA-AHCR)과 같이 4군으로 나누었다. 정상군 (Normal)의 경우 어떠한 처치를 하지 않았으며, 정상-세 신군(N-AHCR)은 천식을 유발하지 않은 정상 mouse에 세신 전탕액을 경구투여하였다. 천식-saline군(OVA- saline)은 천식 유발 후 saline 100 ㎕을, 천식-세신군 (OVA-AHCR)은 1 %의 세신전탕액 100 ㎕을 경구투여하 였다. Saline 및 세신 전탕액 투여는 5~12주째까지 총 8주 간 주 3회 간격으로 시행하였다(Fig. 1).

Table2.Instruments

Instruments Manufacturer Country Spectrophotometer Shimazu Japan

Rotary evaporator Eyela Japan

Centrifuge Sigma U.S.A.

Ice maker Vision Science Korea Primus 96 thermocycler

system MWG Biotech Germany

Plate shaker Lab-Line U.S.A.

Homogenizer OMNi U.S.A.

Flow cytometer Becton

dickinso U.S.A.

Cytological Centrifuge Hanil Korea Digital thickness gauge Mitutoyo Corp Japan Research microscope Nikon Japan Elisa Reader Molecular

devices U.S.A.

Bio-freezer Sanyo Japan

Electric chemical balance MC1 Germany

Air compressor Tamiya Japan

Pulverizer Rong tsong Taiwan

Fig.1.ExperimentalProcedure

4)BALF 분리

생쥐는 마취 후 표피를 열어 기도에 주사기를 삽입 후 끈 으로 고정한 후에 10 % 농도의 FBS/ DMEM medium을 3회 순환하여 분리하였다.

5)Enzyme-linkedimmunosorbentassay (ELISA)

ELISA Kit를 이용하여 생쥐로부터 분리한 BALF 및 serum에서 각각의 cytokine 양을 측정하였다. 항cy- tokine 항체가 표면에 코팅된 96 well plate에 BALF 혹 은 serum을 반응시킨 다음 총 4회 세척하고, biotin 표식 이 있는 항cytokine 항체를 반응시켜 다시 4회 세척하였 다. 그 후 straptavidin-HRP를 가하였으며 이는 Elisa- reader를 통해 결과치를 측정하였다.

6)Photomicrographs

분리된 BALF를 세척해서 1,000 rpm으로 5분 동안 cytospin을 시행한 후, Hemacolor rapid staining set (Merck, Germany)를 이용하여 염색하였다. 그 후 공 기 중에서 건조시킨 후에 bright microscope(Nikon, Japan ; ×400)를 이용하여 관찰 및 측정하였다.

7)Histological analysis

조직은 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법 을 통해 염색하였다. 폐조직 중 일부는 Cryotome를 통해 절편하고 Masson's Trichrome stain system(Dako, Japan)를 이용하여 염색하였다

8)RT-PCR

(1) Total RNA의 추출

각 실험군의 생쥐에서 떼어낸 폐조직을 homogenizer 를 이용하여 분쇄한 후 RNAzolB(Tel-Test, USA)를 이 용하여 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)로 처리한 20 ㎕의 증류수 중에 용해시켜 정량하였으며, RNA 확인을 위하여 4 ㎍의 RNA 를 EtBr이 포함된 formaldehyde buffer와 혼합하여 70 ℃의 온도에서 10분 동안 denaturation 후, formal- dehyde를 첨가한 1.5 % agarose gel 중 loading dye와 loading하여 양을 측정하였다. 측정 후 확인된 RNA는

RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChain Reaction)에 이용하였다.

(2) cDNA 합성

역전사 반응의 경우 준비된 total 3 ㎍에 해당하는 RNA 를 75 ℃에서 10분간 denaturation 후, 10mM dNTPs 2.5 ㎕, randomsequencehexanucleotides(25 pmole/

25 ㎕) 1 ㎕, RNA inhibitor로서 RNasin(20 U/㎕) 1 ㎕, 100 mM DTT 1 ㎕ 및 5×RT buffer(250 mM Tris-Cl 4 ㎕, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl

) 모두 혼합 한 후에 1 ㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 첨가하고 DEPC 처리된 증류수를 가해 최종적으로 20 ㎕의 부피가 되도록 하였다. 그 결과 만들어진 20 ㎕의 반응 혼합액은 잘 섞어 원심분리한 후에 37 ℃ 항온 수조에서 60분간 반 응시켜 first-strand cDNA를 합성하도록 하고, 95 ℃에 서 10분간 두어 M-MLV RT를 불활성화시키는 즉시 얼음 으로 옮겼다. 합성이 완료된 이러한 first-strand cDNA 는 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 사용하도록 하였다.

(3) cDNA의 PCR 증폭

PCR의 경우 Primus 96 Legal PCR system(with high pressure lid, MWG in Germany)을 사용하였다.

반응은 이미 합성된 1 ㎕의 first-strand cDNA를 주형으

로 사용하였다. β-actin, TNF-α, IL-1β, IL-5, IL-4

IL-13에 대한 sense primer(20 pmole/㎕)와 antisense

primer(20 pmole/㎕)를 혼합 후 1 ㎕를 가하고, 다시 3 ㎕

의 2.5 mM dNTPs, 3 ㎕의 10×PCR buffer(100 mM

Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl

)와

0.18 ㎕의 Taq polymerase(5 U/㎕)를 첨가 후 최종적으

로 부피가 30 ㎕이 되도록 멸균증류수를 가하였고, pre-

denaturation(95 ℃, 5분), denaturation(74 ℃, 5분),

annealing(55 ℃, 1분) 및 elongation(72 ℃, 1분)을

25cycle 시행한 후에 postelongation을 72 ℃ 3분 조건

하에 PCR을 시행하였다. 각각의 PCR products는 20 ㎕

씩 1.2 % 농도의 agarose gel에 loading시켜 50 V 조건

하에 30분 동안 전기영동시켜 분석하였다. Oligonu-

cleotide의 염기배열은 Table 3과 같다.

3.통계분석

통계분석의 경우 SPSS 통계프로그램(ver 18.0 KO)을 사용하였다. 결괏값은 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, Kruskal-wallis test를 통하여 분석 후 Mann Whitney U test로 각 군 간의 차이를 확인하였다. 분석결과, nor- mal군과 N-AHCR군 간에는 유의한 차이가 나타나지 않 아 다른 실험군은 normal군과만 비교하고 N-AHCR군과 의 비교는 생략하였다. 신뢰도가 95 % 이상(p≪0.05)인 경 우에 유의성 있는 것으로 판정하였다.

Ⅲ. 결과

1.Lung weight

OVA-saline군에서 normal군에 비하여 폐의 무게가 유의하게 증가하였으며, OVA-AHCR군에서 OVA- saline군에 비하여 폐의 무게가 유의하게 감소하였다 (Fig. 2).

Table3.Oligonucleotideprimer

β-actin sense oligonucleotide 5'-TGGAATCCTGATCCATGAAC-3' antisense oligonucleotide 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAGTCCG-3' IL-4 sense oligonucleotide 5‘-AGCCATATCCACGGATGCGAC-3’

antisense oligonucleotide 5‘-GCATGGTGGCTCAGTACTACG-3’

IL-5 sense oligonucleotide 5'-GCTCCTTCAGGAATCTGTTC-3' antisense oligonucleotide 5'-GGCTCATGTACTTTCATGAG-3'

IL-13 sense oligonucleotide 5‘-GCCGGGATGGGCATTCCACGTGTG-3’

antisense oligonucleotide 5‘-GGACGCCAAGGTCAAGAACAGTTG-3’

IL-1β sense oligonucleotide 5'-CCTCTTCTTGAGCTTGCAAC-3' antisense oligonucleotide 5'-AGCCCATGAGTTCCATTCAC-3' TNF-α sense oligonucleotide 5'-AGCGGCTGACTGTCAGATTGTTAG-3'

antisense oligonucleotide 5'-GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG-3'

Fig.2.EffectofAHCRonlungweightofOVA- inducedasthmaticmouse

C57BL/6 mice were injected, inhaled and sprayed with OVA for asthma sensitization and challenge, and treated with oral admin- istration of AHCR decoction. At the end of the experiment, the mice were sacrificed and the lungs were taken out and weighted.

Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

2.Cell count

1)Total cells in Lung

OVA-saline군에서 normal군에 비하여 폐 내 총세포 수가 유의하게 증가하였으며, OVA-AHCR군에서 OVA- saline군에 비하여 폐 내 총세포 수가 유의하게 감소하였 다(Fig. 3).

2)Total Leukocyte in BALF

OVA-saline군에서 normal군에 비하여 BALF의 leukocyte 수가 유의하게 증가하였으며, OVA-AHCR군 에서 OVA-saline군에 비하여 BALF의 leukocyte 수가 유의하게 감소하였다(Fig. 4).

Fig.4.EffectofAHCRonthenumberoftotal

leucocytesinBALF

BALF was obtained from each experimental group and the number of total leukocyte in BALF was calculated. Values repre- sent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.3.EffectofAHCRonthenumberoftotalcellsin OVA-inducedasthmaticmouselung The mice lungs were taken out, chopped and disposed with collagenase and the total number of lung cells was calculated.

Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

3)Eosinophils in BALF

OVA-saline군에서 normal군에 비하여 BALF 내 호 산구의 수가 유의하게 증가하였으며, OVA-AHCR군에서 OVA-saline군에 비하여 BALF 내 호산구의 수가 유의하 게 감소하였다(Fig. 5).

Fig.5.EffectofAHCRonthenumberofEosinophils inBALF

BALF was obtained from each group of mice and the number of Eosinophils was calculated. Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

3.Photomicrographs of Eosinophil in BALF

OVA-saline군의 BALF에서는 호산구가 다량으로 관 찰되었으며, OVA-AHCR군의 BALF에서는 OVA- saline군에 비하여 호산구가 현저하게 감소하였다(Fig. 6).

4.Histologicalanalysisoflungsection

OVA-saline군에서는 폐조직에 collagen이 다량으로 부착되어 있는 것이 관찰되었으나, OVA-AHCR군에서는 collagen의 부착이 현저하게 감소하였다(Fig. 7).

Fig.6.Photomicrographs(originalmagnification,

×400)ofBALFcytospin

BALF was obtained from each group, and washed, fixed and stained. BALF from OVA-saline group exhibited remarkably in- creased number of Eosinophils at bright microscope(Nikon, x400). BALF from OVA-AHCR group showed less Eosinophils compared to OVA-saline group.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

Fig.7.HistologicalanalysisoflungsectionsofOVA- inducedasthmaticmouse

Mouse lung tissue was sliced and embedded in paraffin, and the sections were stained with masson's trichrome(blue: colla- gen)

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

5.ELISA

1)IL-4,5,13,IgE in BALF

OVA-saline군에서 normal군에 비하여 유의하게 증가 하였으며, OVA-saline군에 비하여 OVA-AHCR군에서 유의하게 감소하였다(Fig. 8, 9, 10, 11).

Fig.8.EffectofAHCRonthelevelofIL-4inBALF The concentration of IL-4 in mice BALF was measured using ELISA.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

2)IL-4,5,13,IgE in Serum

OVA-saline군에서 normal군에 비하여 유의하게 증가 하였으며, OVA-saline군에 비하여 OVA-AHCR군에서 유의하게 감소하였다(Fig. 12, 13, 14, 15).

Fig.9.EffectofAHCRonthelevelofIL-5inBALF The concentration of IL-5 in mice BALF was measured using ELISA. Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.10.EffectofAHCRonthelevelofIL-13inBALF The concentration of IL-13 in mice BALF was measured using ELISA. Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.11.EffectofAHCRonthelevelofIgEinBALF The concentration of IgE in BALF was measured using ELISA.

Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.12.EffectofAHCRonthelevelofIL-4inserum

The concentration of IL-4 in mice serum was measured using ELISA. Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.13.EffectofAHCRonthelevelofIL-5inserum

The concentration of IL-4 in mice serum was measured using ELISA. Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

6.RT-PCR

천식과 관련된 여러 cytokine의 mRNA 발현을 관찰한 결과, TNF-α, IL-5, IL-4 IL-13 등의 mRNA 발현이 OVA-AHCR군에서 OVA-saline군에 비하여 현저히 감 소하였다(Fig. 16).

Ⅳ. 고찰

천식은 흔한 만성 호흡기 질환으로 현재 전 세계적으로 약 1~18 %의 유병률을 보이고 있다

. 발작적이고 만성적 으로 발생하는 천명, 호흡급촉, 흉민, 해수 등의 다양한 임 상 증상을 비롯하여 병리적인 기도의 염증 상태를 특징으 로 하며 증상은 대개 운동, 알레르기 항원, 날씨, 바이러스 등에 의해 시작되거나 악화된다

.

천식 발병에는 유전적 소인과 환경적 요인이 복합적으로 관여하나 최근 환경오염, 식생활 및 생활환경의 변화와 함 께 발생 빈도가 증가하고 있으며, 만성적이고 반복적인 발 병 특징으로 인하여 천식치료법 연구에 대한 중요성은 대 체로 점차 커지고 있는 추세이다

.

천식의 주요 증상은 만성적인 기관지 염증 및 기관지 평 활근의 과민성으로 유발되는 기침과 호흡곤란이라 할 수 있다

. 알레르기 천식의 경우 주로 IgE에 의해 매개되는 제 1형 과민반응 과정에서 비만세포, 호염구 등의 면역세포들 Fig.14.EffectofAHCRonthelevelofIL-13inserum

The concentration of IL-4 in mice serum was measured using ELISA. Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.15.EffectofAHCRonthelevelofIgEinserum

The concentration of IL-4 in serum was measured using ELISA.

Values represent the means±SD of 10 mice.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with AHCR decoction.

∥: p≪0.01 vs normal group.

¶: p≪0.05 vs OVA-saline group.

Fig.16.mRNAexpressionofTNF-α,IL-1β,IL-5,IL-4 andIL-13inlung

The mRNA expression of cytokines in lung was observed by RT-PCR.

*: Normal : Normal mouse.

†: N-AHCR : Normal mouse treated with AHCR decoction.

‡: OVA-saline : OVA-induced asthmatic mouse treated with saline.

§: OVA-AHCR : OVA-induced asthmatic mouse treated with

AHCR decoction.

이 생산하는 화학적 매개물에 의한 염증에서 시작되며, 이 러한 염증반응의 반복에 의해 가속화되고 만성화된다

. 그 결과 천식 환자에서 기도의 부종과 더불어 조직학적으로 림프구, 호산구, 호중구의 침윤과 함께 모세혈관 밀도 증가 에 따른 세포 수 증가(cellularity)와 상피세포의 박탈(de- nudation)이 흔히 관찰되며 점액선 비대나 기저막의 콜라 겐 증가가 동반되기도 한다

.

韓醫學에서 천식은 外部 刺戟으로 外感有熱이 氣管支 에 몰려 痰液이 氣道를 狹小시켜 呼吸困難이나 氣管支 痙 攣, 때로는 氣管支 閉塞으로 호흡 시 喘鳴이나 통증을 호 소하는 증상으로 표현하고 있으며 呼吸急促, 喘鳴有聲하 는 哮喘證과 유사하다고 할 수 있다

. 문헌적으로 보면 《素 問·調經論篇》에 “氣有餘則 喘咳上氣 不足則 息利少氣”,

《素問·藏氣法時論》에 “喘咳逆氣 肩背痛 汗出”, 《靈樞·

五閱使》에서 “肺病者 喘息鼻張”이라 하여 喘症에 대해 최 초로 언급하였다

.

본 연구에 사용된 세신(Root of Asarum sieboldii Miq.)은 쥐방울과(Aristolochiaceae)의 식물로 민족도리 풀(Asarum heterotropoides F. Maekawa var. mand- shuricumF.Maekawa) 또는 족도리풀(Asarum sieboldii F.Maekawa)의 뿌리를 주로 사용한다

. 세신의 약리작용 은 주로 정유성분에 의한 것으로 알려져 있는데 全草에는 정유 2.6 %로 구성되어 있으며 methyleugenol을 주 성 분으로 α-pinene, camphene, β-pinene, nyrcene 등 함유되어 있다

. 세신의 생리적 효능으로는 항염증, 기억 력 증진, 뇌세포 보호, 항암효과, 멜라닌 생성 억제 및 활성 등이 보고된 바 있으며 세신의 성분 중 methyleugenol은 동물실험에서 기관지 이완을 유도하고 항염작용을 통해 피 부 종창을 억제하는 것으로 알려져 있다

.

세신은 《圖經本草》에서 “其根細而其味極辛，敬名之日 細辛”, 《吳普本草》에서 “如葵，葉赤色，一根一葉相連”이 라 하여 세신의 명칭이 形態와 함께 뿌리가 가늘고 맛이 매 운 성상으로부터 생겨났음을 언급하고 있다

. 세신의 性 味에 대하여 《神農本草經》에서 辛溫無毒이라 하였고 《醫 學入門》에서 味辛小毒으로 기록되어 있으나 세신 독성에 관한 최근 연구에 따르면 과량 복용 시 특정 정유성분에 의 한 中毒 증상 발생의 가능성이 보고된 바 있다

.

세신의 효능과 주치를 보면 解表散寒의 效能으로 發熱 惡寒, 外感風寒, 鼻塞, 鼻流淸涕에 사용되고, 祛風止痛의 效能으로 風濕痺痛, 頭痛, 牙痛에 사용될 수 있으며 溫肺 化飮의 效能으로는 外感風寒이나 寒飮이 入肺하여 발생 한 咳嗽氣喘, 痰飮淸稀에 사용한다

. 利水道의 효능에 대 해서는 《名醫別錄》

에 최초로 기재되어 있으며 《用藥心得 十講》

에서 세신의 辛溫한 氣味가 胸中滯氣를 열고 通肺

竅함으로써 咳逆上氣를 치료하고 寒痰喘嗽, 鼻塞不聞, 風 寒痺痛의 증상에 사용할 수 있다고 하여 利水道를 설명하 고 있다. 肺는 淸氣를 흡입하여 腎과 함께 水道通調하는 기능이 있는데 이것이 痰濁이나 上逆하게 되면 咳嗽, 呼吸 急促 등의 증상이 나타나게 된다. 따라서 세신의 利水道 작 용을 통해 肺 속의 水氣를 제거함으로써 水道를 通暢시켜 천식의 증상을 치료할 것으로 사료된다.

천식의 발병기전은 기도의 지속적인 아급성(subacute) 염증 상태로부터 기인하는 것으로 알려져 있으며 IgE로 매 개되는 type 1 과민반응 및 폐로 들어간 항원에 대해 발생 하는 기도의 알레르기성 염증반응으로 설명할 수 있다

. 폐 로 유입된 항원의 1차적인 제거는 폐포에 있는 대식세포가 담당하며 대식세포가 활성화되어 항체 생산을 위해 B세포 를 자극함으로써 항원에 특이적인 IgE를 분비한다

. 생산 된 IgE는 비만세포를 활성화시키고 항원과 IgE의 결합을 통해 비만세포에서 탈과립되는데 이 과정이 초기 천식반응 을 유발하게 된다

. 또한 B세포는 항원에 노출된 이후 DC4 T세포를 자극하여 Th

세포는 Th

세포로 분화되고, 이렇게 분화된 Th

세포는 사이토카인(cytokine)인 IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-13 등을 생산하여 호산구를 자극 함으로써 후기 알레르기성 기도반응을 일으킨다

.

이와 같이 천식은 호산구와 T세포의 침윤, 비만세포, 호 염구 및 상피세포 활성화 등 다양한 면역물질이 관여하는 염증성 질환이며, 특히 이 중 호산구와 T세포가 천식의 병 리과정에서 기도의 염증을 유발하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다

.

천식 발병기전에 관여하는 면역세포 가운데 T세포는 세 포 표면분자의 종류에 따라 CD4

T세포, CD8

T세포, 유도 자(Inducer) T세포 등으로 분류할 수 있다. 이 중 CD4

T 세포는 알레르기 면역반응에 중요한 역할을 담당하며 활성 화 시 분비되는 사이토카인의 종류에 따라 다시 조력T세포 (helper T cell)인 Th

세포와 Th

세포로 나눌 수 있다

.

Th

세포는 표면에 CCR5 수용체를 가지고 IL(inter-

lukine)-2, IL-12, IFN(interferon)-γ등을 분비하며

면역반응 중 바이러스나 결핵균에 대한 방어작용 및 지연

형 과민반응에 관여한다

. 한편 Th

세포의 경우 CCR3,

CCR4, CCR8과 같은 수용체가 있으며 IL-4, IL-5, IL-

6, IL-9, IL-10, IL-13 등을 생산하며 천식과 같은 알레

르기 반응, 기생충 감염에 대한 방어작용 및 즉시형 과민반

응에 관여한다. 이들 Th

세포와 Th

세포의 면역반응은 서

로 길항작용을 하며 균형을 유지하고 있으며, Th

세포와

Th

세포 사이의 불균형이 천식을 유발하는 것으로 알려져

있다. 특히 천식군의 BALF에서 Th

세포의 기능 활성화가

관찰되었다는 연구 결과가 다수 보고되고 있다

.

호산구의 대표적인 화학 유도물질인 eotaxin은 주로 기 도 상피세포에서 분비되며 호산구, 호염기구, Th

세포, 비 만세포 등에 존재하는 CCR3 수용체와 결합하여 염증세포 들을 조직 내로 이동시킨다

. eotaxin은 초기 염증반응에 서 국소 호산구증을 유발한 후 연속반응을 통해 점차 더욱 강력한 호산구증을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이러 한 염증반응은 eotaxin과 Th

에서 분비된 사이토카인과 의 상호작용을 통해 극대화된다

.

Th

에서 분비된 사이토카인 중 IL-4는 B세포를 자극하 여 IgE의 생산을 촉진시키는데 중요한 역할을 하며, 염증 세포 자극을 통한 염증 매개물질 분비를 통해 기관지의 과 민성 증가와 기도 폐쇄를 일으켜 천식 증상을 유발하게 된 다

. 초기 면역반응에서 IL-4는 면역반응의 성질을 결정 하는데에 큰 영향을 미치며 항체형성 증진과 더불어 지연 형 과민반응을 억제하는 IFN-γ생산을 억제하는 작용을 한다

.

IL-5의 경우 IL-4를 보조하는 역할뿐 아니라 호산구 증 가증을 초래하는 주요한 사이토카인으로서 성숙한 호산구 를 활성화시키고 호산구 내의 과립물질 분비를 촉진시키며 ADCC(antibody dependent cell cytotoxicity)를 유발 시킨다

. IL-5는 과거에는 B세포의 증식이나 분화, IgM 을 생성하는 작용에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔 으나 최근에는 호산구를 활성시키는 사이토카인임이 알려 지면서 알레르기 염증반응을 이해하는 중요한 연구대상이 되어 왔다

.

IL-13은 Th

세포에서 주로 생산하며 IL-4와 수용체를 공유하여 기능적으로 IL-4와 유사하며 IgE 매개성 염증 에서 중요한 작용을 한다. 기관지 상피세포나 평활근세포 를 자극하여 eotaxin 분비를 증가시키고 호산구의 활성을 유발하는 강력한 인자이다. IL-13을 제거한 경우 호산구 침착, 기관지 과민성 증가, 기관지 점액의 과분비 등이 나 타나는데, 이를 통해 IL-13이 기도의 염증반응 및 기관지 과민성을 유발하는 주요한 인자임을 알 수 있다

.

한편 기관지 과민성 반응과 기도 폐쇄 등 초기 천식의 발 생에 중요한 역할을 하는 IgE 또한 Th

세포의 사이토카인 과 더불어 알레르기성 천식의 병리과정에 중요한 역할을 한다. 특히 B세포로부터 생성된 혈관 내 IgE의 경우 기도 의 비만세포를 활성화시켜 각종 염증성 물질을 생산하도록 유도하여 기도 염증반응에 관여하게 된다

.

현재 천식의 발병기전에 따라 서양 의학적 치료법으로 抗炎症劑인 스테로이드와 더불어 氣管支 擴張劑 등의 약 물이 사용되고 있으나 천식 발병률은 지속적 으로 증가 추 세에 있으며 완치가 어렵고 치료 기간이 길어 이와 같은 치 료법만으로는 천식치료에 대한 수요를 완전히 채우지 못하

고 있는 실정이다

. 따라서 천식의 치료와 예방에 있어 단순한 증상의 개선뿐만 아니라 위와 같은 각종 면역세포 들의 활성을 조절함으로써 기관지의 염증반응을 억제하는 것이 천식치료에 있어 근원적 접근법이라 생각할 수 있다.

다양한 치료법과 새로운 약물에 대한 필요성이 대두되는 가운데 한의학 분야에서도 한약재를 이용하여 효능은 높으 면서 부작용은 적은 약물을 천식의 예방과 치료에 이용하 기 위한 연구가 현재까지 이어지고 있으며 이에 관한 많은 실험과 임상적인 결과물이 보고되고 있다

.

천식치료에 관한 기존 한의학 분야에 있어 시행된 실험 적 연구를 보면 단일 또는 복합 한약제제를 이용한 경우가 가장 많았다. 단일제제로는 黃芩, 半夏, 甘草, 蓽茇 등

이 보고된 바 있고 복합제제로는 麥門冬湯, 金水六君煎, 瀉白散, 加味淸肺化痰湯 등

에 대한 연구가 있었다.

천식에 대한 세신의 기존 연구로는 김 등

등의 細辛약 침의 천식 억제 및 면역조절 효과에 대한 보고와 류 등

의 肺兪 細辛藥鍼이 OVA-induced asthma mouse model 의 면역조절작용에 미치는 영향에 대한 보고가 있으나 아 직까지 세신 전탕액 경구투여가 정상 동물과 알레르기 천 식 유발 동물의 면역조절 기능에 미치는 영향을 비교한 연 구는 접하지 못하였다.

이에 저자는 세신 전탕액 경구투여의 천식 억제효과 및 면역 기능에 미치는 영향에 대해 알아보기 위하여 C57BL/

6 mouse에 알레르기 천식을 유발하고 실험군을 천식- saline군(OVA-saline), 천식-세신군(OVA-AHCR)으로 나누어 세신 전탕액을 경구로 투여하였다. 또한 정상군 (Normal), 정상-세신군(N-AHCR)을 설정하여 천식이 유발되지 않은 생리적 상태에서 세신의 작용을 비교시험 하였다.

그 후 각 군의 폐질량, 폐 내 총세포 수, BALF에서의 총 leukocyte 수 및 호산구 수, 현미경사진(photomicro- graph)상의 호산구 수의 변화, 폐의 조직학적 검사상 관찰 소견, ELISA를 통한 BALF와 혈청 내 IL-4, IL-5, IL- 13, IgE 양의 변화를 측정하였다. 또한 RT-PCR을 이용 하여 TNF-α, IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인의 mRNA 발현을 관찰하였다.

그 결과 모든 항목에 있어 OVA-saline군에서 Normal 군에 비해 증가하였고, OVA-AHCR군에서 OVA-saline 군에 비해 감소하였으며, N-AHCR군의 경우 Normal군 과 거의 차이가 없었다(Fig. 2~16).

본 실험에서 세신 전탕액 투여군은 천식의 병리기전에

있어 다음과 같은 작용을 하는 것으로 생각된다. 첫째, 세

신 전탕액 투여는 폐의 무게 증가 및 폐와 BALF 내 림프구

및 호산구 양의 증가를 모두 억제한다. 이는 세신이 천식으

로 인해 폐에 유발되는 부종 및 염증반응을 억제함으로써 폐 내 염증세포 증식과 침윤을 제한하는 작용을 하기 때문 인 것으로 사료된다. 둘째, 세신 전탕액 투여는 BALF와 serum에서 Th

세포가 생산하는 사이토카인 중 IL-4, IL- 5, IL-13 및 IgE을 유의성 있게 감소시킨다. 이는 세신 전 탕액의 경구투여가 천식의 면역학적 병리과정 중에 염증세 포의 발현과 더불어 주요 인자의 병적인 생산을 억제하는 것으로 생각된다. 또한 위의 모든 실험 항목에 있어 N- AHCR군의 경우 Normal군과 비교할 때 측정치에서 거의 변화가 없었는데, 이는 세신 전탕액의 경구투여는 림프구, 호산구, 사이토카인 및 IgE 등 병적 증가에 한하여 억제작 용을 하는 것으로 사료된다.

기존의 세신 약침을 이용한 천식치료와 관련된 연구와 비교할 때 세신의 경구투여에 있어 실험 결과의 유효성을 보임에 따라 세신은 경구투여를 통하여 위와 같은 면역계 조절작용을 통하여 천식으로 인한 알레르기 면역반응 과정 의 병적인 항진을 억제하여 기도의 염증반응 및 과민반응 을 완화시킴으로써 알레르기성 천식의 증상 개선에 유효한 결과를 나타낼 것으로 기대된다. 나아가 보다 객관적인 치 료 효과 및 임상 적용을 위해 향후 세신의 약리작용 및 적 용방법 등에 대한 지속적이고 다양한 연구가 필요할 것으 로 사료된다.

V. 결론

본 연구에서는 세신 전탕액 경구투여의 천식증상 개선과 면역기전에 미치는 영향을 알아보기 위하여 C57BL/6 mouse에 천식병태를 유발시킨 후 천식이 유발된 mouse 와 정상 mouse에 세신 전탕액을 경구로 투여한 후 천식억 제 및 면역조절작용을 비교 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 천식을 유발하지 않은 정상 mouse에 세신 전탕액을 경구투여한 정상-세신군(N-AHCR)을 설정하여 비 교시험 한 결과 세신은 병적 상태에 한하여 천식 억제 및 면역조절 작용을 나타내었다.

2. OVA-AHCR군에서 폐의 무게 및 폐 내 총세포 수가 유의성 있게 감소하였다.

3. OVA-AHCR군에서 BALF 내의 총림프구 수와 호산 구 수가 유의성 있게 감소하였으며 이는 현미경사진 을 통해서도 동일한 결과를 나타내었다.

4. OVA-AHCR군에서 폐의 조직학적 검사상 collagen 의 부착량이 유의성 있게 감소하였다.

5. OVA-AHCR군에서 BALF와 serum 내 IL-4, IL- 5, IL-13 및 IgE 양이 유의성 있게 감소하였다.

6. OVA-AHCR군에서 TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-5 및 IL-13 등의 mRNA 발현이 유의성 있게 감소하 였다.

7. N-AHCR군의 경우 Normal군과 비교하여 폐의 무 게 및 폐 내 총세포 수, BALF에서의 BALF 내의 총 림프구 수와 호산구 수, 조직학적 검사상 collagen의 부착량, BALF와 serum 내 IL-4, IL-5, IL-13 및 IgE 양, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-5 및 IL-13 등 의 mRNA 발현에 있어서 거의 차이가 없었다.

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