서
론
들깨 (Perilla frutescens (L.) Britt)는 꿀풀과 (Labiatae)에
속하는 한해살이 식물로서 일본 및 동아시아가 원산지 이며 (Lee et al. 1986), 키는 1미터 정도 자라고 줄기는 네모지며 특이한 냄새를 풍긴다. 잎은 마주나고 가장자 리에 톱니가 있으며 잎자루가 길다. 민간에서 잎을 여름 과 가을에 채취하여 그늘지고 바람이 잘 통하는 그늘에 서 말린 후 감기, 풍한, 오한, 발열, 구토 및 설사 등에 사 ─ ─ 13 ──
방사선 유도 돌연변이 약용들깨 핵산 추출물의
Inducible Nitric Oxide Synthase
저해활성
박용대∙강민아∙이효정∙진창현∙최대성 김동섭∙강시용∙변명우∙정일윤*
한국원자력연구원 정읍 방사선과학연구소 방사선전략기술개발부
Inhibition of an Inducible Nitric Oxide Synthase Expression
by a Hexane Extract from Perilla frutescens cv. Chookyoupjaso
Mutant Induced by Mutagenesis with Gamma-ray
Yong Dae Park, Min Ah Kang, Hyo Jung Lee, Chang Hyun Jin, Dae Seong Choi, Dong Sub Kim, Si-Yong Kang, Myung Woo Byun and Il Yun Jeong*
Radiation Research Center for Innovative Technology, Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea
Abstract -- In earlier investigations, seeds of Perilla frutescens (L.) Britt. cv. Chookyoupjaso were irradiated with 200 Gy gamma ray to generate mutagenesis. The aim of this study is to investigate the effects of a hexane extract from Perilla frutescens (L.) Britt. cv. Chookyoupjaso mutant 45 on the actions of anti-inflammatory activity on inducible nitric oxide synthase, and an identification of the major active compound. The hexane extract from P. frutescens exhibited activity of inhibi-tion of a NO producinhibi-tion (IC50, 295.1μμg ml--1). The hexane extract was further divided into sub-fractions by silica-gel chromatogarphy. Inhibition of the NO production by various sub-fractions was assayed in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Among the seven fractions, the 5th fraction was the most effective (IC50, 19.5μμg ml--1). The 5th fraction suppressed the expression of protein of iNOS in LPS-induced RAW 264.7 cells, and GC/MS analyses showed that isoegomaketone is a major bio-active compound in the 5th fraction. The result indicated that isoegomaketone has a good potential to be developed as an anti-inflammation agent.
Key words : Perilla frutescens (L.) Britt. cv. Chookyoupjaso, Inducible nitric oxide, Anti-inflam-mation, Isoegomaketone
* Corresponding authors: Il Yun Jeong, Tel. +82-63-570-3150, Fax. +82-63-570-3159, E-mail. [email protected]
용한다 (Peng et al. 2005). 현재까지 생리활성물질의 다양 한 추출방법과 생리활성 효과가 보고되었다. 들깨 추출 물은 염증의 유발 요인이 되는 TNF-α와 lipoxygenase활 성을 저해함으로써 뛰어난 항염증 효과를 나타낸 것으 로 보고되었고 (Yamamoto et al. 1998; Ueda et al. 2002), 또한 HL-60 셀에서 superoxide와 peroxide의 생성을 저 해함으로 강력한 항산화 활성을 나타낸다고 보고되었다 (Nakamura et al. 1998). 이 식물의 생리 활성물질에 대한 기존의 연구에서, 여러 종류의 essential oils, fatty acids,
flavonoids 등이 발견되었다고 보고된 바가 있다. 이 식
물체의 주성물은 phenolic 화합물인 rosmarinic acid이고, flavonoids의 종류로 알려진 catechin, apigenin, luteolin, caffeic acid, and ferulic acid가 그 외 미량의 생리활성물 질로 분리되었다(Ishikura 1981; Aritomi et al. 1985).
포유동물 세포의 nitric oxide synthase (NOS)의 경우, 유사형태가 3가지 존재하는데 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) 그리고 inducible NOS (iNOS)이 다 (Ignarro et al. 1987; Moilanen et al. 1995). iNOS는 외 부 자극에 대한 염증 면역방어기전의 다양한 과정을 매 개하는 pro-inflammatory cytokines (Interleukin (IL)-1b, -6, -12), Interferon-γ, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 및 lipopolysaccharide (LPS) 등에 의해 유도되고 (Stuehr
1999), 특히 iNOS에 의해 생성된 과량의 NO는 세포 독
성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타내며 자가 면역질환이나 만성 염증의 주요원인이 된다 (Stuehr et al. 1991; McCartney et al. 1993). 그러므로 과도한 NO 의 생성을 저해하고, iNOS 단백질 발현을 저해시키는 물질은 각종 자가 면역성 질환이나 염증 예방 또는 치료 에 유용할 것으로 기대된다. 이에 본 연구에서는 방사선 유도 돌연변이 약용들깨의 핵산 추출물에 대해 silica-gel 컬럼크로마토그라피를 통한 분획을 실시하여 각 분획에 대하여 NO 생산 저해활성을 측정하고 나아가 가장 효 과적인 분획에 대하여 iNOS 발현을 평가하였다. 이를 통하여, 돌연변이 약용들깨의 항 면역성 소재로서 활용 할 수 있을지에 대한 가능성을 알아보았다.
재료 및 방법
1. 시약 및 분석기기컬럼크로마토그라피는 Midium Pressure Liquid Chroma-tography (MPLC, combiflash, teledyne isco.)를 사용하였고 담체로는 silica 40 gram flash column (teledyne Isco.)를 사 용하였다. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectrum은
Jeol (Japan)사의 JNM-ECA500를 사용하여 측정하였다.
2. 추출 및 분리
약용들깨 종자에 감마선을 200 Gy 처리하여 선발된 M17세대의 종자 (P. frutescens (L.) Britt. cv. Chookyoupjaso
mutant 45)를 표준재배법에 의해 재식하고 9월에 돌연변 이 들깨 지상부를 음건한 후 파쇄한 시료를 120 g을 취 하여, 핵산으로 추출하여 감압 농축하였다. 농축된 액을 건조하여 핵산추출물 12 g을 얻었다. 그 후 핵산추출물을 실리카겔 컬럼크로마토그라피 (hexane : EtOAc, 100 : 0 → 90 : 10)를 실시하여 분핵 1~7을 얻었고 실리카겔 컬럼 크로마토그라피 (Hexane : EtOAc==95 : 5)를 실시하여 화 합물 1 (10 mg)을 얻었다 (Fig. 1).
화합물 1-Yellow oily compound, C10H12O2, 1H-NMR
(500 MHz, CDCl3) δ 8.03 (1 H, m), δ 7.44 (1 H, m), δ 7.01 (1 H, dd, J==6.9, 15.5 Hz), δ 6.82 (1 H, m), δ 6.47 (1 H, dd, J==1.5, 15.5 Hz) δ 2.53 (1 H, m) δ 1.11 (3 H, S), δ 1.09 (3 H, S); 13C-NMR (500 MHz, CDCl 3) δ 184.2, δ 154.6, δ 147.2, δ 144.2, δ 129.3, δ 124.1, δ 109.2, δ 31.3, δ 21.4, δ 21.4. 3. 세포배양과 시료 처리
RAW 264.7 세포를 10% Fetal Bovine Serum (FBS) Dul-becco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 배양액으로 37�C, 5% CO2incubator에서 배양하고 2일에 한번 계대
배양하여 유지하였다. RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포 함한 DMEM 배지로 교환한 다음 2×105cells well-1로 하여 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 부착시키고 시료는 최종농도 0.1% Dimethyl sulfoxide (DMSO) 용액 이 되도록 첨가한 다음 2시간 후 최종농도 0.1%의 LPS 를 처리하여 18시간 동안 배양하여 유리된 NO의 생성 정도를 측정하였다.
4. Griess 시약을 이용한NO의 정량
96 well plate에 각 well당 배양액 100μl씩을 취하고 Griess 시약 (2.5% H3PO4, 1% sulfanilamide, 0.1%
naph-o
o
thylethylenediamine 용액)을 100μl씩 가하여 15분 동안 발색 시킨 후 photometer reader를 이용하여 546 nm에서 흡광도를 특정하였다. 검량선 작성을 위해 sodium nitrite (NaNO2)를 표준품으로 하여 비교하였다 (Feelisch and
Stamler 1995).
5. Western blot을 통한 iNOS 단백질의 발현
RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 배양액으로 2 ×105cells 100 mm-1dish로 분주한 뒤 24시간 동안 부착 시키고 LPS 처리 군과 LPS 비 처리 군으로 나누어 18시 간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 1 mM PMSF를 포함한 lysis buffer를 사용하여 세포를 용해시키고, 각 시료별 세포질액 단백질을 20μg을 western blot용 시료 로 사용하였다. 이 시료를 10% SDS-PAGE (poly acry-lamide gel electrophoresis)를 이용하여 전기영동한 후 nitro cellulose membrane으로 gel의 단백질을 blot시켰다. 5% skim milk로 1시간 동안 blocking한 후 1 : 5,000의 비율로 iNOS의 항체를 12시간 동안 결합시키고 1 : 5,000 입의 2차 항체를 1시간 동안 배양한 후 enhanced chemi-luminescent (ECL) 검출시약 (GE Healthcare, UK)을 이용 한 chemiluminescence 방법으로 iNOS 단백질의 발현정 도를 관찰하였다.
6. 세포 증식도 분석
쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 2 ×105cells well-1로 세포를 분주하고 24시간 배양 후 여 러 농도의 시료 용액을 배지에 희석하여 첨가하였다. 48 시간이 지난 후 EZ-cytox 시약을 넣고 4시간 동안 배양 한 후 photometer reader를 이용하여 480 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 7. GC 분석조건 Isoegomaketone을 먼저 methanol에 녹여 1 mg ml-1의 표준액으로 조제한 후 이를 다시 50, 40, 30, 20, 10 μg ml-1로 희석하여 표준용액으로 하였으며, 사용된 분석기
기는 미국 Agilent Technologies사 5890 Gas Chromato-graphy에 연결된 5988A Mass Selective Detector를 사용 하였다. 이용된 분석 컬럼은 HP-5MS capillary (25 m× 0.32 mm id, 0.25μm film thickness Agilent)를 사용하였으 며, 컬럼 온도는 50�C에서 2분간 유지시킨 후 17�C min-1
으로 280�C까지 승온 시키고 5분간 유지하였다. 운반기 체 헬륨의 유속은 0.9 ml min-1이었으며, 주입방법은
splitless 모드로 설정하였다. MS에서 ionization source는
electron ionization (EI mode)으로 전압은 70 eV이었다.
결과 및 고찰
1. LPS에 의해 유도된NO 생성율 저해활성
돌연변이 들깨 핵산추출물 분획과 이것을 다시 실리 카겔 컬럼크로마토그라피를 실시하여 얻어진 7개의 분 획을 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 존재하는 nitrite (NO2-)의 양을 Griess 시약을 사용 하여 측정하였다. 돌연변이 들깨의 핵산추출물을 LPS와 처리했을 때의 nitrite (NO2-)의 양은 핵산추출물에서 농 도에 따라 저해활성이 관찰됐고 IC50값은 295.1μg ml-1 로 나타났다 (Fig. 2). NO 저해활성이 있는 들깨의 핵산
Fig. 2. Effects of hexane extract from P. frutescens mutant on
LPS-induced NO in RAW 264.7 cells. Cells were treated with various concentrations (100, 200, 400, 500μg ml-1) of
extract for 2 h, then with LPS (1μg ml-1) and incubated for
18 h. Nitrite (μ M) 25 20 15 10 5 0 None 0 100 200 400 500
LPS++haxane extract from P. frutescens (μg ml-1)
Fig. 3. Cell viability by LPS-induced RAW 264.7 macrophage
cells. Cell viability were evaluated by Ez-cytox cell viabi-lity assay and relative absorbance were compared. The re-sult of cytotoxic activity by fraction 5 did not affect cell vi-ability at any of the concentration tested.
Cell viability (% ) 100 80 60 40 20 0 Control 6.25 12.5 25 50 Fraction 5 (μg ml-1)
추출물을 실리카겔 컬럼크로마토그라피를 이용하여 (hexane : EtOAc 100 : 0→ 90 : 10) 7개의 분획을 나눴다. 이렇게 얻어진 7개의 분획을 NO 저해활성을 측정한 결 과 5번 분획에서 가장 뛰어난 활성을 보였고 그밖에 다 른 분획에서는 활성이 없거나 대조군과 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 분획 5를 50, 25, 12.5, 6.25μg ml-1의 농 도에서 LPS와 함께 처리하였을 때 IC50값은 19.5μg ml-1 의 활성을 보였다 (Fig. 4). 위 결과를 통해 돌연변이 들 깨의 핵산추출물이 가지는 NO (NO2-)저해활성은 가장 뛰어난 활성을 지닌 5번 분획에 의한 것으로 판단된다. 2. 돌연변이 들깨 5번 분획 자체의 세포 증식도 분석 핵산추출물로부터 분리한 5번 분획에 대한 세포 독성 을 알아보았다. 5번의 농도를 달리한 시료를 처리하여 48시간 후 EZ-cytox 시약 처리한 뒤 4시간 후에 흡광도 를 측정한 결과 6.12~50μg ml-1의 농도에서 세포 생존 율이 농도에 유의한 독성이 관찰되지 않았다. 위 결과로 5번 분획은 RAW 264.7세포의 생존에는 영향을 미치지 않고 NO 생성을 저해함을 알 수 있었다 (Fig. 3). 3. 돌연변이 들깨 5번 분획의iNOS 단백질 발현 억제 활성 NO 생성 저해 기작을 알아보기 위해 먼저 NO 생성 저해활성이 우수한 5번 분획이 활성화된 대식세포 RAW 264.7 cells에서 iNOS 발현에 미치는 영향을 West-ern blot으로 확인하였다. 5번 분획을 활성화된 세포에 농도별로 처리하고, 2시간 뒤 LPS (1μg ml-1)로 처리한 후 18시간 동안 배양하여 세포내에 존재하는 iNOS 단백 질 발현 양을 관찰하였다. 그 결과 5번 분획 50μg ml-1 로 처리하였을 때 iNOS 단백질 발현이 되지 않은 것을 확인하였고 다른 농도에서도 iNOS 단백질 발현이 줄었 다(Fig. 4). 이와 같은 활성은 NO 생성 저해활성 결과와 일치하는 것으로 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세 포에서 돌연변이 들깨의 핵산 추출물의 NO 생성 저해 활성은 iNOS 단백질발현 억제에 의한 것임을 확인하였 다.
Fig. 4. Effects of fraction 5 on LPS-induced expression of NO and
iNOS in RAW 264.7 macrophage cells. RAW 264.7 cells were treated with different concentrations (6.12, 12.5, 25, 50μg ml-1) for 2 h, then with LPS (1μg ml-1) and
in-cubated for 18 h (A). Expression of iNOS protein by LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells. Cells were harvest-ed and subjectharvest-ed to western blot analysis (B).
Nitrite (μ g ml -1) 20 15 10 5 0 None 0 6.12 12.5 25 50 LPS++Fraction 5 (μg ml-1) i-NOS β-Tubulin (A) (B)
Fig. 5. Chromatogram of 5 fraction from P. frutescens by GC/MS (A). Mass spectra of isoegomaketone form 5 fraction (B). 2θ++07 1θ++07 1θ++06 Absorptance 80 60 40 20 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 Time (min) 40 60 80 100 120 140 160 180 Mass (m/z) 41 77 95 121 135 164 O O (A) (B)
4. 돌연변이 들깨 5번 분획 중 isoegomaketone 함량 5번 분획의 정제된 화합물 1을 얻기 위하여 컬럼크로 마토그라피 (hexane : EtOAc==95 : 5)를 실시하였고, 화합 물 1은 NMR spectroscopy 분석과 문헌의 기기분석 data 와 비교하여 isoegomaketone으로 구조 동정을 하였다 (Abdulla et al. 1978). 5번 분획에서 얻어진 화합물 1의 함량분석은 GC/MS로 확인하였다. 그 결과 isoegomake-tone은 5번 분획 중 34.8%가 함유되어 있었고, 이 결과 는 isoegomaketone은 5번 분획의 주요 구성 성분으로 분석되었다(Fig. 5). 문헌에 따르면 isoegomaketone은 per-illaketone과 함께 들깨의 주요성분으로서 들깨 특유의 향 을 내는 방향성 성분이며(Madoka et al. 2004), perillake-tone은 limonene과 같은 monoterpene의 전 합성 물질로 밝혀진 바 있다 (Baser et al. 2003). 하지만 아직까지 isoe-gomaketone에 대한 생리활성에 관한 연구는 진행되어진 바 없다.
결
론
본 연구에서는 방사선 유도 돌연변이 약용들깨 핵산 추출물 분획이 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포 로부터 NO 생성 저해활성에 미치는 영향을 조사하였다. 핵산추출물에 대하여 실리카겔 컬럼크로마토그라피를 실시하여 얻어진 7개의 분획을 각각 25, 50, 100, 200μg ml-1의 농도에서 NO 저해효과를 측정하였고, 이 중 5번 분획에서 IC50이 19.5μg ml-1의 농도로 NO 생성을 저해 함으로 뛰어난 항염증 활성이 관찰 되었다. 또한 5번 분 획의 iNOS 단백질 발현을 western blot 방법으로 측정한 결과 단백질 발현이 농도에 의존하여 저해되는 것을 확 인하였다. 5번 분획의 활성 물질을 확인하기 위해 컬럼크 로마토그라피를 사용하여 화합물 1을 분리하였고 1D-, 2D-NMR의 data와 참고문헌을 통하여 isoegomaketone 으로 동정하였다. GC/MS를 이용하여 5번 분획의 isoe-gomaketone의 함량을 조사한 결과, isoegomaketone은 34.8%의 함량으로 5번 분획에 함유되어 있는 것으로 분 석 되었다. 위의 결과를 바탕으로 5번 분획에 다량 함유 되어있는 isoegomaketone이 iNOS 단백질 발현에 영향을 준 것으로 예상되고, isoegomaketone을 다량 함유한 돌 연변이 약용들깨는 항 면역성 소재로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.사
사
본 연구는 농림수산식품부에서 주관하는 농림기술개 발사업의 지원으로 수행되었습니다. 이에 감사드립니다.참 고 문 헌
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Manuscript Received: February 4, 2009 Revision Accepted: February 20, 2009
