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이학 석사 학위 논문
파고지(
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세포부착분자의 발현에 미치는 영향
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/
분자의학전공
이 광 민
파고지(
Psor
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에서
분리한 i
sobavachal
cone이
세포부착분자의 발현에 미치는 영향
지도교수 이 수 환
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2014년 2월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/
분자의학전공
이 광 민
-
국문요약-파고지(
Psor
al
eacor
yl
i
f
ol
i
a)
에서 분리한 i
sobavachal
cone이
세포부착분자의 발현에 미치는 영향
뇌의 염증반응은 다양한 뇌질환에서 공통적으로 나타나는 특징 중의 하나이다. 뇌의 염증반응에서의 백혈구의 침윤(infiltration)과 이동(migration)은 다양한 뇌 질환의 진행과정과 함께 중요한 관계성을 가지고 있다. 따라서 염증반응에서 leukocyteinfiltration의 조절은 Alzheimer'sdisease와 stroke등을 포함하는 퇴행 성 뇌질환의 치료를 위해 아주 중요한 치료적 target으로 여겨지고 있다. Leukocyte의 infiltration은 혈관 내벽에 존재하는 세포부착분자들에 의해 발생 되 어지는 것으로 알려져 있으며 세포부착분자 중 ICAM-1의 발현에 의해 강한 부착 을 유발하여 leukocyte의 infiltration과 migration에 주된 역할을 한다.ICAM-1 은 염증인자에 의해 발현이 조절되며,특히 뇌혈관 장벽을 구성하는 주된 세포인 뇌혈관 내피세포에서의 발현은 뇌질환 발병 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으 로 알려져 있다.따라서 ICAM-1 분자의 작용을 조절함으로써 퇴행성 뇌질환 및 뇌 손상과정에서의 염증반응을 조절하려는 시도가 이루어져 왔다. 파고지(Psoralea corylifolia)는 중국과 동아시아에서 뇌 노화에 대한 보호와 치 매치료에 사용되어져 왔다.이 밖에도 관절염개선효과,항산화작용 및 항암작용 등 이 보고되어 있다.파고지에서 분리한 IBC는 NO의 생성과 iNOS의 발현을 억제함 으로써 뇌 염증작용의 억제를 통해 퇴행성뇌질환에서 동반되어 나타나는 염증작용 의 치료제로서의 적용가능성이 시사된바 있다.본 연구에서는 파고지에서 유래된 flavonoid 성분인 IBC가 염증성 자극에 의한 뇌혈관 내피세포에서의 부착분자 발 현과 이에 관련된 신호전달계에 미치는 영향을 검토함으로서 뇌손상 보호물질로서 의 이용 가능성을 확인하고자 하였다. IBC는 뇌혈관 내피세포주인 bEnd.3세포에서 LPS에 의해 유도된 백혈구 부착 및
ICAM-1의 발현을 유의적으로 억제하였으며 ICAM-1의 발현에 관여하는 것으로 알려진 전사 인자 NF-kB 활성화와 subunitp65의 핵내 전위 및 IkB-α의 인산화 를 유의적으로 감소시켰다.
IBC는 MyD-88의존적인 경로의 specific agonist인 MALP-2에 의해 유도된 ICAM-1의 발현 및 IkB-α 인산화를 농도의존적으로 감소시켰다.IBC는 또한 TRIF에 의존적인 경로를 활성화 시킬 수 있는 poly[I:C]에 의해 유도되는 ICAM-1의 발현,IkB-α 인산화,NF-kB활성화는 억제하였으나 MyD-88경로와는 달리,저 농도에서 억제하는 결과를 확인 할 수 있었다.하지만 TRIF에 의존적인 경로만을 통하여 발현되어지는 IFN-β의 발현에서는 ICAM-1의 발현에서 나타난 결과와는 달리 IBC에 의한 농도의존적 감소효과를 확인하였다. 따라서 IBC는 MyD88과 TRIF에 의존적인 경로를 저해함으로써 뇌혈관 염증반응 을 억제할 수 있는 것으로 결론지을 수 있으며 이를 통해 뇌손상 및 퇴행성 뇌질 환의 치료에 기여 할 수 있을 것으로 추정된다.
Key word :Isobavachalcone (IBC),Lipopolysacchariode (LPS),intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), NF-kB, cerebrovascular endothelial cells(bEnd.3),TLR4signaling
차 례
국문요약...ⅰ 차례...ⅲ 그림차례...ⅴ 약어...ⅶ Ⅰ.서론...1 Ⅱ.연구 목적...5 Ⅲ.실험재료 및 방법...6 A.시약 및 실험기기...6 1.실험시약...6 2.실험기기...6 B.실험 방법...7 1.세포 배양 및 처리...7 2.MTT assay...7 3.백혈구-내피세포 부착 측정...7 4.Western blotting...85.TotalRNA 분리 및 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction...8
6.Immunocytochemistry...10
7.Transfection andluciferaseassay...11
8.통계처리...11 Ⅳ.결과...12 1.IBC가 뇌혈관내피세포의 LPS 유도 생존능력(viability)에 미치는 영향...12 2.IBC가 LPS에 의해 유도된 백혈구-내피세포 부착 및 ICAM-1의 발현에 미 치는 영향...12 3.IBC가 LPS에 의해 증가되는 NF-kB 활성화에 미치는 영향...13
4.IBC가 LPS에 의해 증가되는 IFN-β 발현 및 IFNβ PRDⅢ-Ⅰ활성화에
미치는 영향...13
5.IBC가 MALP-2에 의해 유도된 MyD-88에 의존적인 경로의 활성화에 미 치는 영향 ...14
6.IBC가 poly[I:C]에 의해 유도된 IFN-β 발현 및 IFNβ PRDⅢ-Ⅰ활성화 에 미치는 영향...14
7.IBC가 poly[I:C]에 의해 유도된 TRIF에 의존적인 경로의 활성화에 미 치는 영향...15
Ⅴ.고찰...30
Ⅵ.결론...35
Ⅶ.참고문헌...36
그림 차례
Fig 1.EffectofIBC on theviability ofcerebrovascularendothelialcells...16
Fig 2.EffectofIBC on LPS-induced leukocyte adhesion to cerebrovascular endothelialcells...17
Fig 3.EffectofIBC on LPS-induced ICAM-1 expression in cerebrovascular endothelialcells...18
Fig 4.EffectofIBC on LPS-induced NF-kB activation in cerebrovascular endothelialcells...19
Fig 5.EffectofIBC on LPS-induced IFN-β expression in cerebrovascular endothelialcells...20
Fig 6.EffectofIBC on LPS-induced IFNβ PRDⅢ-Ⅰ transcriptionalactivity in cerebrovascularendothelialcells...21
Fig 7. Effect of IBC on MALP-2-induced ICAM-1 expression in cerebrovascularendothelialcells...22
Fig 8.EffectofIBC on MALP-2-iduced NF-kB transcriptionalactivity in cerebrovascularendothelialcells...23
Fig 9. Effect of IBC on MALP-2-induced IkB-α phosphorylation in cerebrovascularendothelialcells...24
Fig 10. Effect of IBC on poly[I:C]-induced IFN-β expression in cerebrovascularendothelialcells...25
Fig 11.Effectof IBC on poly[I:C]-induced IFNβ PRDⅢ-Ⅰ transcriptional activity in cerebrovascularendothelialcells...26
Fig 12. Effect of IBC on poly[I:C]-induced ICAM-1 expression in cerebrovascularendothelialcells...27
Fig 13.EffectofIBC on poly[I:C]-induced NF-kB transcriptionalactivity in cerebrovascularendothelialcells...28
Fig 14. Effect of IBC on poly[I:C]-induced IkB-α phosphorylation in cerebrovascularendothelialcells...29
사용 약어
IBC :Isobavachalcone LPS :Lipopolysaccharide
poly[I:C]:Polyinosinic:polycytidylicacid
MALP-2:Macrophage-activating lipopeptide-2 TLR :Toll-likereceptor
ICAM-1:Intercellularadhesion molecule-1
RT-PCR :Reversetranscription-polymerasechain reaction MTT :3-[4,5-dimethilthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium NF-kB :Nuclearfactor-kappaB
IkB-α :IkappaB-alpha IFN-β :interferon-beta
Ⅰ.서 론
1.퇴행성 뇌질환과 뇌염증반응 염증반응은 유해한 자극의 제거와 손상된 부위의 치유와 보호를 위한 생체방어 반 응이다.하지만 뇌 염증(brain inflammation)반응은 다양한 뇌질환에 나타나는 특징으 로 만성 퇴행성 질환,뇌졸중 및 뇌 손상과 같은 심각한 신경퇴행성 질환 등에서 부정 적 역할을 하는 것으로 알려 져 있다. 뇌 염증 반응을 일으킬 수 있는 요인으로는 바이러스,박테리아,미생물성 세균의 감염 그리고 cytokine,호르몬,물리적 손상(trauma)등이 알려져 있으며 뇌 염증 유발 시 선천적 면역 반응과 관련된 toll-likereceptors에 의해서 염증반응을 유발할 수 있 는 신호전달과정이 활성화 되는 것으로 알려져 있다.이 toll-likereceptors의 신호전 달과정은 일반적인 뇌수막염,뇌염 등의 감염성 뇌 질환에서 뿐만 아니라 신경퇴행성 질병에서도 병원균이나 손상된 조직 등에 의해서도 활성화 될 수 있으며 TLRs의 활 성화는 신경퇴행성 질환의 진행과정에 관여되어지는 것으로 알려져 있다(GlassCK et al.,2010; AmorS etal.,2010). 염증 반응 및 신경 퇴행성 질환과정에서 중요한 역할을 하는 toll-likereceptor의 신 호전달과 정을 저해함으로써 신경퇴행성 질환의 진행을 조절할 수 있을 것으로 기대 를 모으고 있다.2.Toll-likereceptor
Toll-likereceptor(TLR)는 선천적 면역체계에서 아주 중요한 역할을 담당하고 있다. Toll-like receptor는 1988년 초파리에서 처음 발견되었으며 초파리에서 배아가 형성 되는데 필수적인 항 진균성 면역반응을 하는데 있어 중요한 인자로 알려져 있다 (Lemaitreetal.,1996;Medzhitovetal.,1997).
TLR은 luecine 반복 서열의 세포외 영역(extracellular domain)과 세포 내 영역 (cytoplasmicdomain)으로 이루어진 typeⅠ세포막 단백질로서(Anderson etal.,2000) 이 receptor들은 microbialpathogens의 인식을 통하여 선천적 면역반응을 유발 시킨
수용체들은 최종적으로 염증반응을 유발하지만 각 수용체들에 의해서는 서로 다른 pathogen–associated molecule patterns(PAMPs)를 인식하는 것으로 알려져 있 다.(Okun et al,.; 2008; Akira et al,2006).대표적으로 생쥐의 13개의 수용체중 lipopolysaccharide (LPS)를 인식하는 toll-like receptor4(TLR4)는 MyD88에 의존적 경로와 비 의존적 경로로 나뉘어져 신호를 전달한다.
활성화된 TLR4에서 MyD88은 IRAK-4인산화를 위해 IL-1 receptor와 관련된 kinase-4를 모아 IRAK-4의 인산화 이후 IRAK-4의 degradation을 유발하게 되며 이 들의 연속적인 양상은 친수성 염증매개체들의 유도를 이끄는 NF-kB 전사인자의 활성 화한다. Canonical IKK 복합체는 IKK-α, IKK-β, IKK-γ로 구성되어 있으며, (Fitzgeraldetal.,2003;Leeetal.,2004;KawaiandAkira,2007)이 IKK complex는 활성화된 TLR MyD88의존적 신호전달과정을 통해 IKK complex의 subunit인 IKKα/ β가 활성화되어 IkB-α의 인산화를 유도하게 되며 인산화작용이 지속된 IkB-α는 p65 가 떨어져 나와 DNA와 결합하여 염증반응을 유발한다.
반면 MyD88의 비의존적 경로인 TRIF-dependent pathway에서 TLR4는 adaptor molecule로서 TRAM을 활용하며,TRIF는 IFN regulatory factor-3(IRF-3)의 인산화 를 이끄는 TRAF,TANK,TBK1,IKKε과 같은 downstream 효소를 활성화시킨다.이 후 인산화 된 IRF-3는 이량체 구조형성과 동시에 핵내에 전위되어 inducible nitric oxide synthase(iNOS),IP-10와 IFN-β 등의 IFN-inducible gene의 발현을 유도한다 (Fitzgeraldetal.,2003).
TRIF 신호전달과정의 활성화는 TRAF6와 RIP1을 경유하여 NF-kB의 활성화 또한 유도할 수 있다(Meylanetal.,2004;Hermanceetal.,2005).
TLR4의 신호전달 경로는 염증반응 유도과정에서 주요 신호전달 물질인 NF-kB, MAPK 그리고 IRF-3의 활성화를 수반하며 LPS에 의해 일어나는 대부분의 염증반응 을 매개한다.
3.세포부착분자
Cytokine,eicosanoids,chemokine과 같은 염증매개체들에 의해 염증이 발생하게 되 면 단 시간 내에 염증이 발생된 부분에 neutrophil,lymphocyte나 monocyte의 이동에
따라 염증발생부분에 도달하게 된다(Osborn,1990).염증이 발생한 부분에서는 이러한 백혈구의 이동과 부착에 관여하는 4종류의 glycoprotein superfamily라 불리는 immunoglobulin superfamily, adhesion superfamily,integrin superfamily, selectin superfamily 들에 의해서 반응한다.내피세포에서의 glycoprotein superfamily group은 intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), intercellular adhesion molecule-2 (ICAM-2)그리고 vascularcelladhesion molecule-1(VCAM-1)이 대표적으로 잘 알 려져 있다.
세포 부착 분자는 염증과 면역학적 감시과정에서 중요한 부분으로써 세포부착과정 에서 다른 세포와 extracellularmatrix(ECM)와의 결합에 포함된 세포표면상에 노출된 단백질이다(Staunton etal.,1988).앞서 언급한 세포부착 분자 intercellularadhesion molecule-1(ICAM-1),vascularcelladhesion molecule(VCAM-1)그리고 endothelial leukocyteadhesion molecule-1(E-selectin)과 같은 세포부착분자는 염증유발 인자들과 같은 친수성 염증매개체와 stress,infection에 의해 발현되어 비가역적 염증반응으로 진행되어 진다.특히 세포부착분자 중 ICAM-1은 염증 백혈구 및 내피세포 사이의 상 호 작용에 관련된 중요한 유착 분자로서 면역 글로불린의 superfamily에 속한다.이 ICAM-1은 integrinLFA-1와 상호작용을 통하여 내피세포와 leukocyte의 부착에 관여 한다(MarlinandSpringer,1987;Springer1990).VCAM-1은 호산구와 다른 백혈구의 확고한 부착에 관해 활성화된 antigen-4에 매우 높은 결합을 하며 E-selectin은 세포 표면의 탄수화물과 결합을 한다(Albelda and Buck,1990;Zimmermana etal,.1992). Blood-brain barrier(BBB)에서 내피세포의 표면 부착분자는 많은 뇌 질환 및 퇴행성 신경질환의 진행과정에서 중요한 역할을 하는데 염증반응에 의해 BBB구조의 손상과 함께 ICAM-1의 발현이 증가되며 이는 인간의 뇌 혈관내피에서도 확인된 바 있다 (Erälinnaetal.,1996).사실상 centralnervoussystem(CNS)혈관내피 상에 ICAM-1 의 발현은 다양한 뇌 질환 및 퇴행성 신경질환에 서의 특징 중 하나이다(Shariefet al.,1993).
뇌에서 leukocyte침윤의 조절은 다양한 뇌혈관 질환 및 퇴행성 신경질환에서 치료 를 위한 중요한 표적이 될 수 있으며,따라서 뇌 염증 시 ICAM-1의 작용조절은 뇌
4.IBC(Isovabachalcone) 콩과 식물인 Psoraleacorylifolia.L 는 한해살이로서 한국명으로는 파고지이다. 파고지는 인도 및 동아시아 지역에 이르기까지 많은 지역과 나라에서 약용식물로 사용이 되어져 왔으며,또한 중국의 한방의학에서 자궁출혈,심부전,심혈관 질환 등 의 다양한 질환에서 치료를 목적으로 사용되었다는 보고가 있다(Matsuda et al., 2007). 파고지는 화장품의 원료로서도 사용되고 있으며,파고지로부터 분리된 성분들은 골 절(Lim etal.,2008),골다공증(Yin etal.,2004,2008),전립선 암(Szliskzka,etal., 2009)등의 치료 작용과(Zhao,etal.,2009)항 파킨슨병효과와 신경 아 세포 종에서의 세포사멸 효과 등 다양한 생리작용이이 보고되어져 있다(Nishmura,etal.,2007).
이외에도 파고지의 추출물은 뇌졸중 및 Alzheimer병과 같은 뇌신경퇴행성질환에도 유효한 것으로 보고된 바 있다.파고지의 종자는 flavonoid,coumarin,merotepene등 세 가지 주요성분을 함유하고 있으며 각 성분의 다양한 효과들이 보고되고 있다.
Isobavachlacone(IBC)은 flavonoid 계열의 성분으로 항균작용(anti-bacterial),항매작 용(anti-fungal),항산화작용(anti-oxidant)작용 및 Parkinsondisease치료에 유효하다는 보고가 있다(Kuete,etal.,2012).
Isobavachalcone(IBC)는 이외에도 혈소판 응집 저해작용과 NO 및 iNOS발현 저해 등의 항염증작용에 보고된바 있으나 퇴행성 뇌질환과 관련된 뇌 염증반응에 미치는 영향은 아직 보고된 바 없다.
Ⅱ.연구 목적
IBC(Isovabachalcone)는 과거 중국과 동아시아 지역에서 독성치료 및 치매치료를 위 해서 사용이 되어졌었다는 기록이 있으며 현대에 들어와서 IBC가 항염증효과와 신경 보호효과,퇴행성 뇌질환에 대한 효과를 가지고 있다는 보고가 있다. IBC는 LPS,MALP-2,poly[I:C]에 의한 iNOS의 발현을 감소시키는 것으로 알려져 있지만 염증반응에 관여하는 세포부착분자인 ICAM-1의 발현 및 TLRs의 신호전달과 정에 미치는 영향에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 본 연구는 뇌혈관 내피세포에서 LPS에 의해 유도된 ICAM-1의 발현에 IBC가 미치 는 영향을 검토하고,ICAM-1의 전사 조절인자인 NF-kB 활성 및 TLR 신호전달과정 에 미치는 영향을 확인함으로써 염증을 동반하는 퇴행성 뇌질환에 적용가능성을 검토 하고자 하였다.
Ⅲ.실험재료 및 방법
A.실험기기 및 실험시약 1.실험시약
Dulbecco’smodified Eagle’smedium(DMEM)은 WelGENE(Daegu,Korea)에 서 fetal vobine serum(FBS)와 100U/ml penicillin/streptomycin은 Invitrogen (Carlsbad,CA,USA)에서 구입하였다.
Lipopolysaccharide(Escherichia coli, 0127:B8), polyriboinosinic polyribocyti didylic acid(poly[I:C]), MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-dephenyl -tetrazolium bromide),anti-actin antibody는 Sigma(St.Louis,MO,USA)에서 구입을 하였으며 Macrophage-activating lipopeptide 2-kDa(MALP-2)는 Alexis biocehmical(San Diego,CA,USA)에서 구입하였다.RT-PCR을 위해 total RNA분리에 사용된 Easy BlueTM는 iNtRon(Seoul,Korea)에서 제작,구입하였다. RT-PCR에서 사용한 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit은 Fermantas(Ontario, Canada), ICAM-1, IFN-β와 GAPDH oligo primer는 Bioneer(Daejeon,Korea)에서 제작,구입하였다.
Western blotting에서 사용된 Primary antibody인 ICAM-1,pIKB-α,IkB-α는 SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA,USA)로부터 구입하였으며 MAPKs antibody는 cellsignaling(Danvers,MA,USA)에서 구입하였으며,ECL detection reagent는 Amersham(Piscataway,NJ,USA)에서 구입하였다.
2.실험기기
세포 배양을 위해 MCO-17AICO2incubator(SANYO,Japan)를 사용하였고,
totalRNA 추출 후 정량을 위해 Nano Drop-1000 spectrophotometer(Thermo Scientific,Delaware,USA)를,RT-PCR은 My CycleTM (Biorad,Hercules,CA, USA)를 사용하였다.단백질 정량은 VersaMaxTM MicroplateReader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하였으며, Western blotting은
LAS-1000(Fuji,Honshu,Japan)으로 검출하였다.
B.실험 방법
1.세포 배양 및 처리
생쥐 뇌혈관 내피세포주인 bEnd.3세포는 AmerycanTypeCultureCollection (Manassas,VA,USA)에서 구입 하였으며 1,500㎎/L sodium bicarbonate가 포함 된 DMEM(WelGENE,Deagu,Korea)에 10% (v/v)FBS(Introgen,Carlsbad,CA, USA),1% penicillin-streptomycin(100U/ml)이 첨가 된 medium으로 5% CO2/
air,37°C 조건의 세포 배양기에서 배양하였다. 2.MTT assay 96wellplate에 bEnd.3세포주를 1×104cells/well로 세포를 가하고 24시간 안정 화 시킨 후 IBC를 농도별로(0.1,1,5,10,20μM)처리하였다.5%CO2,37°C에서 12,24,48시간을 배양한 뒤,5㎎/mlMTT(Sigma chemical)를 최종농도 0.5㎎/ml 가 되도록 각 well에 첨가하고 2시간 동안 세포 배양기에서 배양 후 100㎕의 extraction buffer(5% acetic acid,5% 1N-HC1,DMF를 1:1로 혼합하고 20% SDS를 첨가한 buffer)를 가하였다.2시간 동안 추가로 세포 배양기에서 배양 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 3.백혈구-내피세포 부착측정(Adhesion assay)
Coverglass가 놓인 24well에 bEnd.3세포를 3×104으로 24시간 배양 후 IBC와 LPS를 동시 처리 하여 12시간동안 배양하였다.Human monocyte cellline인 U937에 celltrackerTM ORANGE CMTMR[5-(and-6)-{((4-chloro methyl) benzoyl)amino}]로 30분 동안 세포 배양기에서 염색시킨 후 500㎕ (1*106cells/well)씩 bEnd.3세포가 배양된 coverglass위에 가하고,약 1시간동안 세포 배양기에서 부착 시킨 뒤 1X PBS로 3회 세척하고 VECTA Shield로 mounting하여 slide glass에 고정시켰으며 형광 현미경을 이용하여 부착정도를
확인하였다. 4.Western blotting 1×105cells/well의 bEnd.3 세포를 실험에 이용하기 전날 6wellplate에 가하여 24시간 안정화 시킨 후 80% confluent하도록 배양하였다.12시간동안 serum starvation처리 후 37°C,5% CO2배양 조건하에서 IBC(0.1,1,5,10μM)과 LPS, MALP-2또는 poly[I:C]를 동시처리 하여 12시간을 배양하였다.처리가 끝난 세 포는 차가운 (4°C)1×PBS로 2회 세척 후 각 well당 RIPA buffer100㎕(20mM Tris-HCl(PH 7.5),1mM EDTA (PH 8.0),150 mM NaCl,1% Triton X-100, 1mM phenylmethylsulphonylfluoride(PMSF),1mM Sodium Fluoride (NaF), 1mM sodium orthavonadata(Na3VO4),0.1% protein inhibitorcocktail(Sigma))
씩 넣고 세포를 긁어 취하였다.초음파분쇄기로 세포를 완전히 용해시키고 냉장 원심 분리기에서 14,000rpm으로 20분간 원심분리를 한 후 얻은 상층액을 시료 로 사용하였으며 BCA protein assay reagent(Thermo scientific, Delaware, USA)를 이용하여 단백질 양을 정량하였다.
일정량의 단백질 시료를 1×Leammlisample buffer (250 mM Tris-HCl(PH 6.8),40% glycerol,10% SDS,20% 2-mercaptoethanol,0.032% Bromophenol blue)와 섞어준 후 100°C에서 10분 동안 변성시켰다.동량의 단백질이 들어있는 시료는 10% SDS-PAGE를 행한 뒤,PVDF membrane(Billerica,MA,USA)에 전기적으로 단백질을 이동시킨 후 5% (w/v in T-TBS)non-fatdried milk 로 blocking 하였다.1차 antibody 는 4°C에서 14시간 동안 반응 시킨 후 2 차 antibody 는 1시간 동안 상온에서 반응 시킨 후, ECL detection reagent (Amersham,Piscataway,NJ,USA)로 발색시켜 LAS-1000(Fuji)을 이용하여 이 미지를 관찰하였다.
5.TotalRNA 분리 및 RT-PCR(Reverse transcriptio-polymerase chain reaction)
1.5×105cells/well의 bEnd.3세포를 실험에 이용하기 전 날 6wellplate에 가하 여 80% confluent하도록 배양한 후 12시간동안 serum starvation처리를 하였다. 이후 37°,5% CO2배양 조건하에서 IBC(0.1,1,5,10μM)와 LPS,MALP-2그
리고 poly[I:C]를 동시 처리 후 4시간동안 배양하였다.
TotalRNA는 easy BlueTM RNA isolation kit을 사용하여 분리하였다.처리가 끝난 세포를 차가운 (4°C)1× PBS로 2회 washing 후 각 well당 easy BlueTM 1ml씩을 가하여 세포 균질액을 얻었다.Microtube에 세포 균질액을 옮긴 후 chloroform 을 각각의 microtube에 200㎕씩 넣고 15초 동안 잘 섞어 주었다.냉 장원심분리기에서 14,000rpm 으로 15분간 원심 분리 하여 얻은 상층액을 새 microtube에 360㎕씩 옮겨 담은 뒤 isopropanol을 360㎕ 가하고 10~15차례 tube 를 뒤집어 혼합하였다.Tube를 냉장원심분리기에서 14,000rpm 으로 15분간 원 심 분리하여 얻은 RNA pellet에 70% EtOH를 800㎕를 가하여 혼합한 뒤 냉동 원심 분리기에서 14,000rpm으로 3분간 다시 원심분리 하여 얻은 RNA pellet을 상온에 서 건조시켰다.
건조된 RNA pellet을 40㎕ 의 DEPC water 에 녹인 후 Nano Drop-1000 spectrophometer(Thermo,Seoul,Korea)을 이용하여 totalRNA 양을 측정하였 다.
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas,Glen Burnie, USA)을 이용하여 cDNA 를 합성한 뒤 합성된 cDNA를 이용해 PCR을 수행 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색된 2% agarosegel에서 전기영동을 진행 후 Gel docsystem(GEL DOC 2000,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)을 통해 이미지를 관 찰하였다.
ICAM-1primer
Sense:5’-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3’ Anti-sense:5’-GAAGTGGTTCTCAGCC-3’
IFN-β
Sense: 5’-AAACAATTTCTCCAGCACTG-3’ Anti-sense:5’-GAAGTGGTTCTCAGCC-3’
GAPDH
Sense:5’-GTGAAGGTCGGTGTGAACGGA-3’
Anti-sense:5’-CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’
PCR 조건
ICAM-1:94°C 1분,58.7°C 1분,72°C 1분 - 31cycle IFN-β :92°C 30초,51°C 30초,72°C 30초 - 33cycle GAPDH :94°C 30초,60°C 30초,72°C 30초 - 26cycle
6.Immunocytochemistry
24wellplate에 coverglass를 넣어두고 그 위에 bEnd.3세포는 3×104cells/well 로 가하였다.1일 동안 37°C,5% CO2배양 조건의 세포 배양기에서 배양 후 실
험 전 날 FBS 없이 1%의 penicillinstreptormycin이 포함된 DMEM으로 12시간 동안 serum starvation을 가한 후 LPS,MALP-2또는 poly[I:C]와 IBC(0.1,1,5, 10μM)를 동시 처리하여 12시간 동안 배양하였다.
Dulbecco’s phosphate buffered saline(0.9mM CaCl,2.7 mM KCl,1.2 mM KH2PO4,0.49mM MgCl2,138mM NaCland 8.1mM Na2HPO4)에 녹여진 4%
paraformaldehyde로 세포를 고정하였다. 30분 동안 Blocking solution(0.5% bovine serum albumin in 20mM Hepes,pH 7.4,120mM NaCl,1.8mM CaCl2,
5.4mM KCl,1.7mM MgCl2and 15mM glucose)로 처리 후 시료들은 4°에서 14
시간동안 1차 antibody와 함께 배양되었으며 14시간 지난 후 추가적으로 상온에 서 1시간동안 fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody와 함께
배양하였다. 염색된 시료는 VECTASHIELDⓇ(VectorLab, Burlingame, CA, USA)로 slide glass위에 고정하였고 confocal laser scanning microscope와 exciting 480nm 및 emission 540nm(FV-300,Olympus,Tyoko,Japan)에서 형광 을 측정하였다.
7.Transfection andluciferaseassay
3×104cells/well의 bEnd.3 세포를 24well의 plate에 가하고 1일 동안 37°,5% CO2배양 조건의 세포 배양기에서 배양 하였다.TransIT-LT1(MirusMadison,
WI,USA)를 이용하여 NF-kB binding site(2X)-luciferasereporterplasmid 와 β-galactosidaseplasmid를 co-transfection하였다.4시간 동안 co-transfection한 후 completemedia로 교체하고 24시간동안 안정화 시켰다.이 후 1% penicillin streptomycin 만 첨가된 DMEM 500㎕를 넣어 12시간 동안 serum starvation처 리한 후 LPS,MALP-2또는 poly[I:C]와 IBC(0.1,1,5,10μM)를 동시 처리하여 12시간 동안 배양하였다.
배양이 끝난 세포는 차가운 (4°C)1 x PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척 후 각 well당 reporterlysis1x buffer를 100㎕ 씩 넣은 후 70°에 얼린 후 녹여 완전히 용해 시켰다.냉장 원심 분리기에서 14,000rpm 으로 20분간 원심분 리 하여 얻은 상층액은 Luciferase Assay System 과 β-galactosidaseEnzyme System(Promege,Madison,WI,USA)을 이용하여 activity를 확인하였다.
8.통계처리
모든 자료는 평균 ± S.E.M.으로 나타내었고 Student’st-test로 통계처리 하 여 P<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
Ⅳ.결과
1.IBC가 뇌혈관 내피세포의 LPS 유도 생존성(viability)에 미치는 영향
10% FBS(feter bovine serum)와 1% P/S(penicillin streptomycin)이 첨가된 DMEM에 배양한 뇌혈관 내피세포를 96wellplate에 각 well당 1×104개의 세포 를 가하고 IBC(0.1,1,5,10,20μM)을 처리하여 각각 12,24,48시간동안 37°C, 5% CO2배양 조건의 세포 배양기에서 배양하였다. MTT assay를 통해 측정한 결과 IBC 20μM에서 시간이 지남에 따라 뇌혈관 내피세포의 생존성을 유의적으로 감소시켰으며 10μM이하 처리 군에서는 생존성 에 유의적인 영향을 주지 않았다.따라서 이후 실험은 10μM이하의 농도를 사용 하여 행하였다(Fig.1). 2.IBC가 LPS에 의해 유도된 백혈구-내피세포의 부착 및 ICAM-1 발현에 미치는 영향 뇌혈관 내피세포주인 bEnd.3 세포에 LPS(1㎍/ml)와 IBC(0.1,1,5μM)를 동시 처리하여 12시간동안 세포배양 후 뇌혈관 내피세포위에 monocyte인 U937을 가 하여 뇌 혈관내피세포에 U937의 부착을 관찰하였다. LPS 처리에 의해 증가된 백혈구의 부착은 IBC에 의해 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다(Fig.2). 혈관 내 백혈구의 부착이 이루어지기 위해서는 부착분자의 발현이 있어야만 백혈구가 혈관 벽에 부착이 되어 진다는 사실은 이미 널리 알려진 내용이다. 본 연구에서는 LPS에 의해 유도되는 ICAM-1의 발현에 미치는 IBC의 영향을 관찰하기 위해 RT-PCR과 Westernblotting을 진행하였다. 세포는 1.5×105cells / well (RT-PCR) 또는 1×105cells / well (western blotting)로 6wellplate에 가하였다.LPS와 IBC는 adhesionassay와 동일하게 동 시처리 하였으며 배양 시간은 RT-PCR sample은 4시간, western blotting
sample은 12시간동안 배양하였다.IBC는 LPS에 의해 유도된 ICAM-1 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 보였으나 5μM의 농도에서만 통계적 유의성 이 확인되었다(Fig.3). 3.IBC가 LPS에 의해 유도되는 NF-kB 활성화에 미치는 영향 ICAM-1의 발현에 관여하는 전사인자로는 NF-kB가 잘 알려져 있다.NF-kB 전사인자의 활성화는 IkB-α 인산화,NF-kB subunitp65의 핵 내 이동의 과정 을 경유한다.ICAM-1의 발현을 조절하는 NF-kB 활성화상에 IBC의 효과를 확 인하기 위하여 실험을 행하였다. IBC는 LPS에 의해 유도된 IkB-α 인산화,subunitp65의 핵 내 전이와 NF-kB 전사인자의 의존성 promoteractivity 활성화에서 모두 농도 의존적으로 NF-kB 활성화를 억제하였다(Fig.4). 4.IBC가 LPS에 의해 증가되는 IFN-β 발현 및 IFNβ PRDⅢ-Ⅰ활성화에 미치는 영향 IBC는 LPS에 의해 유도된 ICAM-1의 발현과 하위조절인자 NF-kB의존성 promoteractivity,p65의 전위과정,IkB-α의 인산화작용을 조절함으로써 TLR4를 통해 전달되어 지는 신호전달계는 down-regulation되었다.추가적으로 TLR4에 서 TRIF에 의존적인 경로만을 통하여 LPS에 의해 발현되어지는 IFN-α의 발현 상에 IBC의 효과를 확인하였다. LPS에 의해 유도된 IFN-β의 발현에 IBC 0.1,1,5μM를 처리 한 결과 0.1μM 을 제외한 1,5μM의 농도에서 통계적으로 유의성(P<0.05)있게 IFN-β 발현이 감 소되었다(Fig.5). IBC가 IFN-β의 발현을 조절하는 전사인자로서 IFN-β PRDⅢ-Ⅰ전사인자의 활성화를 차단할 수 있는지 확인하기 위하여 luciferaseassay를 통해 확인하였 다.LPS에 의해 유도되어진 IFN-β 활성화에 미치는 IBC의 영향을 확인한 결과 농도의존적인 감소를 보였으며 IBC 1,5μM의 두 농도에서 통계적으로 유의성
(P<0.05)있는 저해효과를 확인 하였다(Fig.6).
5.IBC가 MALP-2에 의해 유도된 MyD-88에 의존적인 경로의 활성화에 미치는 영향
TLR4 signaling pathway는 MyD88에 의존적인 경로와 TRIF에 의존적인 경 로에 의해 신호전달이 이루어진다.앞선 실험에서 IBC는 2가지의 신호전달 경로 를 가지는 TLR4의 신호전달을 통해 유도된 ICAM-1의 발현을 억제 하였다.하 지만 이것이 MyD88이나 TRIF에 의존적인 경로를 통해 억제되는 것인지 정확히 알 수가 없어 MyD88에 의존적인 경로만을 통해 활성화 되어 전달되어지는 TLR2의 specific agonist인 MALP-2에 의해 유도된 ICAM-1의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 추가 실험을 진행하였다. 실험과정은 LPS를 통한 실험과 동일하게 세포를 배양한 후 IBC 역시 동일하게 처리하였다 MALP-2에 의해 유도된 ICAM-1의 발현은 IBC에 의해 농도에 의존적으로 유의성 있게 억제 확인하였다(Fig.7). 다음으로 TLR2 신호전달계를 활성화시키는 MALP-2에 의해 증가된 NF-kB 활성화에 미치는 IBC의 영향을 확인하고자 luciferaseassay를 실행하였다.
IBC를 동일한 조건으로 처리를 하여 12시간 세포배양을 진행하였다.세포배양 후 luminometer를 통해 NF-kB 활성화에 미치는 IBC 의 영향을 확인한 결과 IBC 1,5μM 의 두 농도에서 통계적으로 유의성(P<0.05)있는 저해효과를 확인 하였다.(Fig.8)뿐만 아니라 IBC는 NF-kB 전사인자의 활성화를 조절하는 IkB-α 인산화에서도 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.9). 6.IBC가 poly[I:C]에 의해 유도된 IFN-β의 발현과 IFN-β PRDⅢ-Ⅰ활성 화에 미치는 영향 본 연구에서는 TLR 4 MyD88에 의존적인 경로에서 IBC가 세포부착분자인 ICAM-1의 발현을 억제하는 결과를 확인하였다.추가적으로 MyD88에 의존적인
경로가 아닌 TRIF의존적인 경로에서도 IBC의 영향이 관여되는지를 확인하기 위 하여 TRIF 의존적인 경로만을 가진 TLR3의 agonistpoly[I:C]를 처리하여 먼저 IFN-β의 발현에 IBC의 영향을 확인하였다. poly[I:C]에 의해 유도되어진 IFN-β의 발현은 IBC에 의해 농도 의존적으로 감 소하였으며 1,5μM의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 확인할 수 있었다 (Fig.10).IFN-β는 TLR 신호전달계의 TRIF에 의존적인 경로를 통해서 발현되며 IFN-β PRDⅢ-Ⅰ의 활성화에 의해 조절되는 것으로 이미 잘 알려져 있다. poly[I:C]에 의해 유도된 IFN-β PRDⅢ-Ⅰ의 활성화는 IFN-β 발현의 억제와 동 일하게 IBC의 처리에 의해 농도에 의존적으로 억제되었다(Fig.11).
7.IBC가 poly[I:C]에 의해 유도된 TRIF에 의존적인 경로의 활성화에 미치 는 영향
본 연구에서는 TLR3신호전달계(only TRIF-dependentpathway)를 활성화시 키는 poly[I:C]에 의해 유도되는 ICAM-1의 발현에 미치는 IBC의 영향을 관찰하 였다.
IBC는 poly[I:C]에 의해 유도된 ICAM-1 발현을 0.1μM의 농도에서만 통계적 유의성(P<0.05)있게 감소시켰다(Fig.12).
LPS를 이용한 실험과 동일하게 NF-kB 의존성 promoteractivity에 영향을 보 기위해 poly[I:C]를 처리하여 증가된 NF-kB 활성화에 IBC의 영향을 확인하고자 luciferaseassay를 행하였다.
IBC를 동일한 조건으로 처리를 하여 세포배양을 한 후 luminometer를 통해 NF-kB 활성화에 미치는 IBC 의 영향을 확인한 결과 ICAM-1의 발현에 관한 억 제효과와 동일하게 IBC 0.1μM 의 농도에서 통계적 유의성(P<0.05)있는 억제효 과를 확인하였다(Fig.13).NF-kB의 전사인자 활성화를 조절하는 IkB-α 인산화작 용에서 IBC는 NF-kB 전사인자 활성화의 억제양상과 동일하게 저 농도에서 감 소되었다(Fig.14).
Fig .1.Effect of IBC on the viability of cerebrovascular endothelial cells
bEnd.3cellswereincubated with IBC(0.1,1,5μM)for12,24or48hour in 5% CO2 incubator.Cellviability was determined by MTT assay.
MTT assay was performed as described in Material and Methods. Values are expressed as mean ±S.E.M of3 samples.* P <0.05,** P <0.001comparedwith control(CTL).
Fig .2. IBC suppressed LPS-induced adhesion of leukocytes to cerebrovascularendothelialcells.
bEnd.3 cells were incubated with LPS(1㎍/㎖) and varying concentration(0.1,1,5μM)ofIBC for12hourand furtherincubated with CMTMR pre-labeld U937 cells at37 °C for1hour.Adhered cells were imaged under confocalmicroscope.(A). Fluorescence intensity was measured with a spectrofluorometer(B).Valuesareexpressed asmean ±S.E.M of3 samples.# P < 0.01 compared with control(CTL),*P < 0.05comparedwith LPS alone.
Fig .3.IBC reduced LPS-induced ICAM expression in cerebrovascular endothelialcells.
bEnd.3 cells were exposed to LPS in presence ofIBC(0.1,1,5μM)for 4houror12hourto assessthelevelofmRNA and protein,respectively. Theprotein and mRNA levels ofICAM-1 were determined by western blotting and RT-PCR as described in Materials and Methods.Values areexpressed asmean ±S.E.M of3samples.#P < 0.01compared with control(CTL),*P < 0.05comparedwith LPS alone.
Fig .4. IBC inhibited LPS-induced NF-kB transcription activity in cerebrovascularendothelialcells.
bEnd.3cellswereexposed toLPS(1㎍/㎖)in presenceofIBC(0.1,1,5μ M)to assessIkB-α phosphorylation(A),NF-kB translocation(B :green, Alexa FluorⓇ 488;blue,Hoechst33258),NF-kB luciferase activity(C). Luciferase and β-galactosidase enzyme activities were measured as described in Materialsand Methods.Luciferaseactivity wasnormalized with β-galactosidaseactivity.Valuesareexpressed asmean ±S.E.M of 3 samples.# P < 0.001 compared with control (CTL),* P < 0.05 comparedwith LPS alone.
Fig .5. Effect of IBC on LPS-induced IFN-β expression in cerebrovascularendothelialcells.
bEnd.3 cells were exposed to LPS in presence ofIBC(0.1,1,5μM)for 4hour to assess the levelof mRNA and protein,respectively.The mRNA levels of ICAM-1 were determined by western blotting and RT-PCR as described in Materials and Methods.Values are expressed as mean ±S.E.M of 3 samples.# P < 0.01 compared with control (CTL),*P < 0.05comparedwithLPS alone.
Fig .6. IBC inhibited LPS-induced IFN-β transcriptional activity in cerebrovascularendothelialcells.
bEnd.3 cells were co-transfected with IRF3 binding site(IFNβ PRDⅢ-Ⅰ) -luciferase reporter plasmid and the expression plasmid of β -galactosidase.after24hour,cells were treated with LPS(1㎍/㎖)and IBC(0.1,1,5μM) for 12 hour,Luciferase activities were measured as described in Materials and Methods and luciferase activity was normalized with β-galactosidase activity.Values are expressed as mean ±S.E.M of3 samples.#P < 0.001 compared with control(CTL), *P<0.01comparedwithLPS alone.
Fig .7.IBC suppressed MALP-2-induced ICAM-1 in cerebrovascular endothelialcells.
bEnd.3 cells wereexposed to MALP-2(10ng/㎖)in presenceofIBC(0.1, 1,5μM)for4houror12hourtoassessthelevelofmRNA andprotein, respectively.Theprotein and mRNA levelsofICAM-1weredetermined by western blotting and RT-PCR as described in Materials and Methods.Values are expressed as mean ±S.E.M of3 samples.# P < 0.001 compared with control(CTL),* P < 0.05,** P<0.01 compared with MALP-2alone.
Fig .8.IBC inhibited MALP-2-induced NF-kB transcription activity in cerebrovascular endothelialcells.
bEnd.3 cells were co-transfected with NF-kB binding site(2x)-luciferase reporter plasmid and the expression plasmid of β -galactosidase.After24hour,cellsweretreated with MALP-2(10ng/㎖) and IBC(0.1,1,5μM)for12 hour,Luciferase activities were measured as described in Materials and Methods and luciferase activity was normalized with β-galactosidase activity.Values are expressed as mean ±S.E.M of3 samples.#P < 0.001 compared with control(CTL), *P < 0.05comparedwith MALP-2alone.
Fig .9. IBC reduced MALP-2 induced IkB-α phosphorylation in cerebrovascularendothelialcells.
bEnd.3 cells wereexposed to MALP-2(10ng/㎖)in presenceofIBC(0.1, 1,5μM)for15min toassessIkB-α phosphorylation.ThelevelsofI kB-α phosphorylation were determined by western blotting as described in Materialsand Methodsand Valuesareexpressed asmean ±S.E.M of3 samples.#P < 0.001compared with control(CTL),** P < 0.01and *
Fig .10. IBC suppressed on poly[I:C]-induced IFN-β expression in cerebrovascularendothelial cells.
bEnd.3cellswereexposedtopoly[I:C](1㎍/㎖)in presenceofIBC(0.1,1, 5μM)for4hourto assessthelevelofmRNA and protein,respectively. Theprotein and mRNA levels ofICAM-1 were determined by western blotting and RT-PCR as described in Materials and Methods.Values are expressed as mean ±S.E.M of 3 samples.# P < 0.001 compared with control(CTL),* P < 0.05,** P<0.01 compared with poly[I:C] alone.
Fig .11.IBC inhibited on poly[I:C]-induced IFN-β transcription activity on cerebrovascular endothelialcells.
bEnd.3 cells were co-transfection with IRF-3 binding site(2x)-luciferase reporter plasmid and the expression plasmid ofβ -galactosidase.after24hour,cells were treated with poly[I:C](1㎍/㎖) and IBC(0.1,1,5μM)for12hour,Luciferaseactivitiesweremeasureas described in Materials and Methods and luciferase activity was normalized with β-galactosidase activity. Values are expressed as mean ±S.E.M of3 samples.#P < 0.001 compared with control(CTL), *P < 0.05,**P<0.01comparedwith poly[I:C]alone.
Fig .12.IBC reduced on poly[I:C]-induced ICAM-1 in cerebrovascular endothelialcells.
bEnd.3 cells were exposed to poly[I:C]in presence ofIBC(0.1,1,5μM) for 4 hour or 12 hour to assess the level of mRNA and protein, respectively.Theprotein and mRNA levelsofICAM-1weredetermined by western blotting and RT-PCR as described in Materials and Methods.Values are expressed as mean ±S.E.M of3 samples.# P < 0.001compared with control(CTL),*P < 0.05compared with poly[I:C] alone.
Fig .13.IBC inhibited poly[I:C]-induced NF-kB transcription activity in cerebrovascular endothelialcells.
bEnd.3 cells were co-transfection with NF-kB binding site(2x)-luciferase reporter plasmid and the expression plasmid ofβ -galactosidase.After24 hour,cells were treated with poly[I:C](1㎍/㎖) and IBC(0.1,1,5μM)for12 hour,Luciferase activities were measured as described in Materials and Methods and luciferase activity was normalized with β-galactosidase activity.Values are expressed as mean ±S.E.M of 3 samples. # P < 0.001 compared with control (CTL),**P<0.01comparedwith poly[I:C]alone.
Fig .14.IBC reduced on poly[I:C]-induced IkB-α phosphorylation in cerebrovascularendothelialcells.
bEnd.3cellswereexposedtopoly[I:C](1㎍/㎖)in presenceofIBC(0.1,1, 5μM)for15min toassessIkB-α phosphorylation.ThelevelsofIkB-α phosphorylation were determined by western blotting as described in Materialsand Methodsand Valuesareexpressed asmean ±S.E.M of3 samples.# P < 0.001 compared with control(CTL),*** P < 0.001 comparedwith poly[I:C]alone.
Ⅴ.고 찰
뇌 염증반응(inflammation)은 다양한 자극에 대한 혈관주변 조직의 복합적인 반 응으로,어떠한 원인에 의하여 손상을 받았을 때 손상된 부위를 극소화 시키고 정상상태로 되돌리려고 하는 생체의 방어기전이다(Zweifachetal.,1965).일반적 으로 뇌의 염증유도는 뇌혈관 내피 세포와 leukocyte의 infiltration의 활성화에 의해 시작되어진다.(Dietrich,2002;KadlandLeitinger,2005).뇌 모세혈관의 내 피세포는(endothelialcell)는 매우 견고한 tightjunction으로 연결되어 있으며 이 내피세포 층 아래 위치한 기저막(basementmembrane)을 사이에 두고 신경 교 세포 또한 혈관 벽을 따라서 층을 이루고 있어 물질 투과에 커다란 장벽이 되고 있는데 이러한 기능적 단위를 뇌혈관장벽 (blood-brain barrier,BBB)이라 한다 (Wolburg etal.,1994;Zinkeetal.,1992).이 뇌혈관장벽은 유해한 물질이 뇌세 포로 들어가는 것을 막는 피동적 방호 층의 역할을 할 뿐만 아니라,혈구 세포의 뇌 내로 유입되는 과정을 차단하여 뇌를 immune priviliged tissue로 유지하기 위해 매우 중요한 역할을 하고 있다.하지만 염증자극이 주어지면 세포부착분자 의 발현을 통해 leukocyte의 infiltration과 migration이 유발되어 뇌 내에서의 염 증반응이 유발된다.(Nameretal,1993;Zhang etal.,2002)세포부착분자는 염 증과 면역학적 감시 과정의 중요한 부분으로서 세포부착과정에서 다른 세포와 세포외 기질과의 결합에 포함되어져 세포 표면상에 발현된 단백질이다(Staunton ,1988).VCAM-1,ICAM-1,E-selectin과 같은 세포부착분자는 사이토카인,호르 몬,스트레스 와 감염과 같은 자극에 의해 유도되며,이러한 세포부착분자의 발 현에 의해 leukocyte의 infiltration과 migration이 조절된다.BBB에서의 내피세포 의 표면 부착분자는 Alzheimerdisease,huntington disease,multiplesclerosis와 Parkinsondisease등의 병적 상태에서 동반되어 나타나는 것으로 보고되어 왔으 며(Glassetal.,2010;Amoretal.,2010)많은 뇌질환의 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Erälinnaetal.,1996).비만세포,NK세포,regulatory T 세포와 같은 다양한 면역반응에 관련된 세포에 발현되는 것으로 보고되어 있다(Eitan et al, 2009). Alzheimer, Parkinson, Huntington disease등의 퇴행성 신경질환의 모델에서도 역시 TLRs의 발현이 증 가되어지는 것으로 알려져 있으며 퇴행성 신경 질환에서 증가하는 염증성 분자, CNS 세포에 의해 TLRs의 발현이 더욱 더 증가한다는 보고가 있다(Iribarren, 2005;Olson,2004;Chenetal.,2006).
따라서 퇴행성 신경질환에서 공통적으로 동반되는 Toll-likereceptor의 신호전 달계의 조절은 뇌 염증반응의 완화나 염증이 수반된 뇌질환의 치료에 매우 중요 한 의의를 갖는다고 할 수 있다.
본 연구에서는 파고지로부터 분리한 flavonoid계열의 성분인 isobavachalcone (IBC)이 ICAM-1의 발현 및 TLR4신호전달에 미치는 영향을 검토함으로써 퇴 행성 신경질환에 동반되어 나타나는 염증반응의 억제제로서의 가능성을 확인하 고자 하였다.
CD14와 MD2와 같은 세포 밖 요소와 함께 형성되어있는 TLR4는 lipopolysacharide(LPS)를 인식하며,NF-kB 활성화를 이끄는 세포내 신호를 전 달한다(Triantafilou and Triantafilou,2002;Kawaiand Akira,2007)TLR 4의 활성화는 하위신호 MyD-88에 의존적인 경로와 TRIF에 의존적인 경로로의 활 성화로 연결된다(O’Neil, 2006). MyD-88에 의존적인 경로는 초기 단계에서 NF-kB의 활성을 유도하며,다른 연결고리인 TRIF에 의존적인 경로는 IRF-3의 활성화뿐만 아니라 지연된 NF-kB의 활성화를 유도한다(Meylan etal.,2004; Hermanceetal.,2005).TLR4신호전달계에 특이적 ligand로 알려진 LPS에 의 해 유도된 백혈구의 rolling과 부착은 CD14와 TLR 4가 결핍된 생쥐에서 확실하 게 감소된 반면,TLR 4의 MyD-88에 의존적인 경로가 결핍된 생쥐에서 오직 백혈구의 rolling현상이 LPS에 의해서만 일어난다는 보고가 있다(Zhou etal., 2006).이는 ICAM-1의 발현 및 백혈구의 부착이 TLR 신호전달에 의해 조절되 고 있음을 시사한다.IBC는 LPS에 의해 유도된 내피세포와 백혈구의 부착현상
과 ICAM-1의 발현에서 농도의존적인 억제효과를 보였다 (Fig.2,Fig.3).TLR 4 신호전달계에서 LPS에 의해 발현된 ICAM-1은 주요 전사인자 NF-kB 활성화 로 인해 조절된다(Balyasnikovaetal.,2000;Rahman etal.,2004;Minhajuddin etal.,2009).LPS에 의해 유도된 IkB-α 인산화,NF-kB subunitp65의 전위과 정 및 NF-kB 활성화는 IBC에 의해 농도의존적으로 억제되었다(Fig.4).본 결과 는 TLR 4신호전달계를 통해 발현된 ICAM-1의 발현이 IBC에 의해 억제되었 음을 의미한다.이 밖에 LPS는 TLR 4신호전달계를 통해 세포부착분자의 발현 에 영향을 주는 IFN-β의 생성에도 관여하는 것으로 알려져 있다.IFN-β는 TNF-α의 생성을 유도해 VCAM-1과 ICAM-1의 발현을 증가시키며 eosinophil 로부터 내피세포의 부착을 증가시킬수 있다(Kobayshietal.,2008).또한 LPS에 의해 유도된 TNF-α의 발현에서 중요한 분자로 알려진 retinoicacid-inducibile gen-Ⅰ(RIG-Ⅰ)은 NF-kB와 IRF3전사인자를 활성화시킬수 있다.RIG-Ⅰ의 발 현은 IFN-β 발현에 의해 유도되어지며 TRIF에 의존적인 경로를 통해 ICAM-1 의 발현을 더욱 증가시킬수 있다(Wang etal.,2008).TRIF에 의존적인 경로를 통해 ICAM-1의 발현을 증가시킬수 있는 IFN-β 발현에 IBC의 효과를 확인하 였다.LPS에 의해 유도된 IFN-β의 발현과 IFNβ PRDⅢ-Ⅰ의존성 promoter activity의 활성화는 IBC에 의해 농도의존적으로 억제되었으며 IBC는 TRIF에 의존적인 경로를 통해 유도된 IFN-β의 발현을 억제하였다(Fig.5,Fig.6). 다양한 보고에서 TLR 4 신호전달계에서 MyD-88에 의존적인 경로는 중요한 전달경로로써 여겨져 왔으며,기능적 MyD-88의 역할은 IL-1β에 의해 유도된 TNF-α 와 IL-6의 발현으로부터 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Adachietal.,1998;Ogimotoetal.,2006).본 연구에서는 TLR 신호전달계의 MyD-88에 의존적인 경로를 통해 발현되어지는 ICAM-1의 발현에 미치는 IBC 의 억제효과를 확인하였다.MALP-2에 의해 유도된 ICAM-1의 발현과 NF-kB 활성화,IkB-α 인산화는 연속적인 양상으로 IBC에 의해 농도 의존적으로 억제 되었다(Fig.7,Fig.8,Fig.9).MyD-88에 의존적인 경로는 거의 모든 TLRs에 의
해 공유되어진 중심적인 연결기이다.MyD-88이 결핍된 세포는 다양한 TLRs ligands로부터의 반응에서 염증성 사이토카인의 생성과 세포부착분자의 높은 생 성과 발현을 보였다(Kobayashietal.,2002).MyD-88에 의존적인 신호전달경로 는 모든 TLRs에서 NF-kB의 활성화를 유도하고 조절하는데 큰 역할을 한다. 이러한 기능을 가진 MyD-88에 의존적인 경로의 활성화를 통해 유도된 ICAM-1의 발현과 NF-kB 활성화가 IBC에 의해 억제됨으로써 이 경로를 통해 발현되어지는 세포부착분자의 발현과 사이토카인의 생성이 IBC에 의해 조절될 수 있음을 시사하고 있다. 다른 한편으로,TLRs에서의 TRIF에 의존적인 경로는 TLR4 및 TLR3 만이 TRIF에 의존적인 경로를 통하여 NF-kB와 IFNβ PRDⅢ-Ⅰ을 통해 세포부착분 자와 IFN-β의 발현을 유도한다(Kawaietal.,2001).LPS나 다양한 감염으로부 터의 반응에서 생성된 typeⅠ IFN은 뇌 염증반응과 퇴행성 뇌질환의 진행과정 을 가속화시킬 수 있는 사이토카인뿐만 아니라 항바이러스 적합면역 반응을 가 능하게 만들 수 있다(Theofilopoulosetal.,2005).
IBC는 TRIF에 특이적인 ligand인 poly[I:C]에 의해 유도된 IFN-β와 IFNβ PRDⅢ-Ⅰ의존성 promoter의 활성화에서 농도 의존적인 억제효과를 나타냈다 (Fig.10,Fig.11).하지만 poly[I:C]에 의해 유도된 ICAM-1 발현 상에 미치는 IBC의 효과는 다소 상반되는 결과를 나타냈다.TLR 4의 신호전달계와 MyD-88 에 의존적인 경로에서는 ICAM-1의 발현을 IBC가 농도에 의존적으로 억제하였 으나 TRIF에 의존적인 경로에서는 저 농도에서 ICAM-1의 발현과 NF-kB 활 성화를 억제하는 결과를 나타냈다(Fig.12, Fig.13, Fig.14). TRIF는 receptor interacting protein 1(RIP1) family의 구성과 함께 상호작용을 매개하는 Rip homotypic interaction motif(RHIM)을 포함한다(Meylan etal.,2004).RIP 1은 TRIF에 의존적인 NF-kB 활성화과정에 작용한다(Cusson-Hermance N etal., 2005).TRIF는 TRAF6,RIP1그리고 TBK1에 의해 신호전달이 이루어지며,그 중 Dominant- nagativeTRAF 6를 과잉발현 시키게 되면 TRIF에 의해 유도된 NF-kB 활성화를 억제한다고 알려져 있다(Brianetal.,1998).또 다른 전달과정
을 담당하는 TANK-binding kinase1(TBK1)은 IKKi의 인산화를 유발해 IRF3 의 transcription을 통한 typeⅠIFN의 발현을 유도한다.TBK1은 typeⅠIFN의 발현을 유도할 뿐만 아니라 NF-kB promoteractivity를 증가시키는 또 다른 신 호전달계를 가지고 있다.TBK1의 두가지의 신호전달과정은 targetmolecule에 따라 반응하는 민감성이 다르며,서로 경쟁적인 역할로서 신호전달에 관여한다. IBC를 처리하였을 때 ICAM-1의 발현과 IFN-β의 발현에 억제효과의 차이를 보인 것이 TBK1의 신호전달과정에서 보여 지는 targetmolecule에 따라 약물에 대한 민감성의 차이로 인해 억제효과의 차이가 발생한 것으로 예상되어진다. 하지만 TLR 4의 신호전달계는 MyD-88보다 TRIF에 의존적인 경로를 통해 거 의 대부분의 염증매개인자들이 경유하는 것으로 알려져 있다(Bjorkbackaetal., PhysioGenomics,2004). 본 연구에서는 IBC가 MyD-88과 TRIF에 의존적인 경로를 통해 억제함으로써 ICAM-1의 발현이 저해됨을 확인 할 수 있었으며,비록 두 경로에 대한 억제자 용에 차이가 있음에도 불구하고 IBC는 TLR4를 경유하여 발생되는 뇌 염증반응 조절에 효과적일 것으로 예상된다.
Ⅵ.결론
Isobavachalcone(IBC)이 LPS에 의해 유도된 세포부착분자 ICAM-1의 발현에 미 치는 영향에 대해 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 1.LPS에 의해 유도된 내피세포와 백혈구의 부착현상이 IBC에 의해 농도 의존 적으로 감소되었다. 2.LPS에 의해 유도된 세포부착분자 ICAM-1의 발현이 IBC에 의해 농도 의존적 으로 억제되었다. 3.IBC는 LPS에 의해 유도된 NF-kB 활성화를 농도 의존적으로 억제하였다.
4.MyD-88에 의존적인 경로에 특이적인 MALP-2에 의해 유도된 ICAM-1의 발 현이 IBC의 처리에 의해 농도 의존적인 억제 효과를 확인하였다.
5.TRIF에 의존적인 경로에 특이적인 poly[I:C]에 의해 유되된 ICAM-1및 I FN-β의 발현이 IBC에 의해 유의적으로 억제되었으나 농도의존적 억제 양상에는 차 이가 있었다.
따라서 IBC는 TLR 4신호전달계를 억제함으로써 세포부착분자의 발현 및 백혈 구-내피세포부착을 억제함으로써 뇌 염증반응을 개선할 수 있을 것으로 추정되 었다.
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Brain inflammation has been implicated in various cerebraldiseases. Leukocyte-infiltration into brain parenchyma is critically associated with in the development brain inflammation. Therefore, control of leukocyte infiltration is a very important therapeutic target for the treatmentofneurodegenerativediseasesaccompanied with inflammation such as Alzheimer’s disease and stroke. Isobavachalcone (IBC), a flavonoid from Psoralea corylifolia, is known to possess a wide spectrum of biological activities, antibacterial, antifungal, anticancer, anti-reverse transcriptase,antitubercular and antioxidant.Recently,it wasreported thatIBC suppressesLPS-induced iNOS expression and is expected to be useful for preventing or treating neurodegenerative disease.However,the effectof IBC on leukocyte-endothelialadhesion andexpression ofintercellularadhesion molecule-1(ICAM-1)in brain
endothelialcells remains unexplored.In this study,we examined the effect of IBC on ICAM expression and leukocyte adhesion in bEnd.3 cells and explored the possible mechanisms therein involved. IBC significantly down-regulated LPS-induced ICAM-1 expression and leukocytes-endothelialadhesion.IBC suppressed LPS-induced sequential events for NF-kB activation, that is, IkB-α phosphorylation, p65 translocation into nucleus and NF-kB transcriptional activity. TLR4 conveys LPS-signal to intracellular compartment via MyD88- and TRIF-dependentpathways,which culminatein theactivation ofNF-kB. As well as, IBC attenuated MALP-2 (a TLR2, 6 specific ligand)-induced ICAM-1 expression, IkB-alpha phosphorylation and NF-kB transcriptional activation. suggesting inhibition of MyD88-dependentsignaling pathway.
IBC also down-regulated poly[I:C] (a TLR3 specific ligand)-induced expression ofICAM-1 and IFN-β,which was mediated suppression of NF-kB or IFN-β transcriptional activity, respectively. These data indicate TRIF-dependent signaling pathway is also blocked by IBC. Taken together, our data suggest that IBC inhibits LPS-induced ICAM-1 expression and leukocyte adhesion in brain endothelialcells and these effects are mediated by blockade of MyD88-dependentand TRIF-dependentsignaling pathways and in turn,inhibition ofNF-kB activity.
Key words : Isobavachalcone(IBC), Lipopolysacharide(LPS), intracellularadhesion molecule 1(ICAM-1),NF-kB,Inteferon-β(IFN-β), cerebrovascularendothelialcells(bEnd.3),Toll-likereceptor4(TLR4)
