저작자표시-비영리-동일조건변경허락 2.0 대한민국 이용자는 아래의 조건을 따르는 경우에 한하여 자유롭게 l 이 저작물을 복제, 배포, 전송, 전시, 공연 및 방송할 수 있습니다. l 이차적 저작물을 작성할 수 있습니다. 다음과 같은 조건을 따라야 합니다: l 귀하는, 이 저작물의 재이용이나 배포의 경우, 이 저작물에 적용된 이용허락조건 을 명확하게 나타내어야 합니다. l 저작권자로부터 별도의 허가를 받으면 이러한 조건들은 적용되지 않습니다. 저작권법에 따른 이용자의 권리는 위의 내용에 의하여 영향을 받지 않습니다. 이것은 이용허락규약(Legal Code)을 이해하기 쉽게 요약한 것입니다. Disclaimer 저작자표시. 귀하는 원저작자를 표시하여야 합니다. 비영리. 귀하는 이 저작물을 영리 목적으로 이용할 수 없습니다. 동일조건변경허락. 귀하가 이 저작물을 개작, 변형 또는 가공했을 경우 에는, 이 저작물과 동일한 이용허락조건하에서만 배포할 수 있습니다.
의학 석사학위 논문
수핵을 이용한 요추간판 탈출증
모델에서 후근신경절에서의
CX3CR1의 순차적 변화
아 주 대 학 교
대 학 원
의 학 과/
의학전공
서 혜 진
수핵을 이용한 요추간판 탈출증
모델에서 후근신경절에서의
CX3CR1의 순차적 변화
지도교수
나 은 우
이 논문을 의학 석사학위 논문으로 제출함.
2010년
8월
아 주 대 학 교
대 학 원
의 학 과/
의학전공
서 혜 진
국문요약
-수핵을 이용한 요추간판 탈출증 모델에서
후근신경절에서의 CX3CR1의 순차적 변화
말초 신경손상 중 요추부 추간판 탈출시의 신경병증성 통증은 기계적 압박보 다는 생화학적 염증반응에 의한 것으로 알려져 있으며 통증의 전달에 있어서 사 이토카인,케모카인,프로스타글란딘 등의 다양한 염증 매개체가 관여하는 것으 로 되어 있다.이중에서 케모카인 중의 하나인 프랙탈카인(CX3CL1)은 말초신경 손상의 경우 신경세포에서 유리되어 척수 후각의 미세아교세포를 활성화함으로 써 통증을 촉진하는 것으로 보고하고 있다.수핵을 이용한 요추간판 탈출증 모델 연구에서 케모카인중 하나인 프랙탈카인과 프랙탈카인의 수용체인 CX3CR1에 대 한 연구는 대부분 척수 후각에서 연구되었으며 후근신경절에서의 CX3CR1의 시 간적 변화에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다. 이에 본 연구에서는 자가 수핵을 이용한 요추간판 탈출증 모델을 이용하여 통증의 발현 변화와 함께 후근신경절에서의 시간적 변화에 따른 CX3CR1의 발현 양상을 알아보고자 하였다. 백서에서 자가 수핵을 이용한 신경병증성 통증 모델을 만든 후 술 후 1일,5 일,10일,20일,30일에 통각과민과 기계적이질통을 확인하고 후근신경절에서RealtimePCR을 이용하여 CX3CR1의 mRNA를 시기별로 확인하고 면역형광염
색을 통해 수용체의 발현을 확인하였다.통각과민반응과 기계적이질통은 술후 1 일부터 유의하게 나타나 10일째 최고조를 나타낸 후 30일째까지 지속되었으며 CX3CR1의 mRNA는 1일째 유의한 감소를 보이다가 20일째까지 증가되었고 이 후 감소하였으며 면역형광염색검사상 3일째부터 증가하여 20일째까지 CX3CR1의 발현이 지속적으로 증가되는 양상을 보였다. 결론적으로 자가 수핵을 이용한 요추간판 탈출 모델에서도 말초신경손상과 같은 신경병증성 통증이 발현되며 후근신경절에서 CX3CR1의 발현이 증가되었고
ii
-이는 아급성 신경병증성 통증 반응과 관련이 있는 것으로 생각된다.
차
례
국문요약 ···ⅰ 차례 ···ⅲ 그림 차례 ···ⅳ Ⅰ.서론 ···1 Ⅱ.연구대상 및 방법 ···3 A.실험동물 ···3 B.요추간판 탈출 모델 제작 ···3 C.통증에 대한 행동검사 ···4D.RealTimePCR···5
E.면역형광염색검사 ···6
Ⅲ.결과 ···8
A.통증에 대한 행동검사 ···8
B.RealTimePCR···9
C.면역형광염색검사 소견 ···10
Ⅳ.고찰 ···13
Ⅴ.결론 ···15
참고문헌 ···17
iv
-그림 차례
Fig.1.A:operativeset-upforlumbardischerniationmodelinan anestheziedrat.B:Sequencesofoperatingmicroscopicview (a-d)ofexperimentalmodeloflumbardischerniationinduced byapplicationofnucleuspulposuswithoutmechanical
compression ···4 Fig.2.Thermalhyperalgesiawasdeterminedbymeasuringhindpaw
thermalwithdrawalresponseusingaradiantheat(A)and mechanicalallodyniawastestedbymeasuringhindpaw
mechanicalwithdrawalresponseusingvonFreyfilaments(B)···5 Fig.3.Comparisonofthermalhyperalgesia ···8 Fig.4.Comparisonofmechanicalallodynia ···9 Fig.5.CX3CR1mRNA expressionofinipsilateralandcontralateral
dorsalrootganglionintheexperimentalgroup,andsham
group···10 Fig.6.ExpressionofCX3CR1indorsalrootganglion1,3and5days
aftersurgery,low powerview ···11 Fig.7.ExpressionofCX3CR1indorsalrootganglion10,20and30
I
.서
론
다양한 말초 신경 손상의 원인 중 요추부 추간판 탈출에 의한 신경근병증은 흔히 경험하게 되는 질환 중 하나로 감각 저하 및 근력 저하 뿐만 아니라 하지 방사통,통각과민,기계적 이질감 등의 신경병성 통증을 야기한다.탈출된 수핵은 기계적 압박이 없는 경우에도 인터루킨-1,6,8등과 같은 사이토카인(cytokine), 종양괴사인자-α(TNF-α)등의 염증 매개체를 유리시켜 직간접적으로 화학적 염증반응을 일으키고 신경을 손상시킬 뿐만 아니라(Olmarker and Larsson,1998;
Specchiaetal.,2002;Ahn etal.,2002;Goupilleetal.,2006;Mulleman etal.,
2006),신경근의 신경 전도 속도의 감소 및 조직학적 변화를 일으킨다(McCarron
etal.,1987,Olmarkeretal.,1993).신경병증성 통증의 발생과 유지에 신경아교 세포가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.신경아교세포는 생리학적,병리학적 상황에서 신경세포를 역동적으로 조절하는 것으로 알려져 있으며,신경이 손상되 면 척수 후각에 존재하는 성상세포와 미세아교세포가 활성화되고,활성화된 신경 아교세포에서는 다양한 신경흥분 물질들을 분비하여 신경세포에 의한 통증 전달 을 촉진시키는 역할을 한다(Hashizume et al.,2000; Watkins et al.,2001;
Watkinsand Maier,2003).특히,미세아교세포는주로 통증 촉진 반응의 시작에
관여하고,성상세포는 통증 촉진 반응의 유지에 관여하는 것으로 보고되고 있다 (Raghavendraetal.,2003). 신경 손상으로 인한 염증 반응으로 면역 세포로부터 프로스타글란딘,히스 타민,브라디키닌,사이토카인,케모카인 등의 다양한 염증매개물질들이 유리된 다. 그 중 케모카인(chemokine)은 다양한 생물학적,병리학적 기능을 가진 단백 질 군으로 G-단백 결합 수용체에 결합하여 세포내 신호전달을 통해 활성화된다 (Vuaillatetal.,2007;Zhuang etal.,2007).면역세포로부터 유리된 케모카인은 척수의 성상세포의 이동 및 미세아교세포의 활성화에 관여하며,면역세포의 이동
-2-을 촉진하여 신경병증성 통증의 발생에 중요한 역할-2-을 한다고 알려져 있다( WatkinsandMaier,2003;,Abbadie,2005;Tsudaetal.,2005).
프랙탈카인(fractalkine,CX3CL1)은 케모카인 4개의 군(CXC,CC,C,CX3C) 중 하나인 CX3C군에 속하는 유일한 케모카인으로 다른 케모카인과는 달리 오직 하나의 수용체인 CX3CR1에만 결합하여 활성을 나타내고, T 세포,자연세포독 성세포 및 단핵포식세포의 부착 또는 화학주성인자로 작용한다.척수 내에서 미 세아교세포가 CX3CR1을 발현하는 주된 세포로 알려지고 있으며,신경세포가 활 성화되면서 신경세포 표면에 부착되어 있는 프랙탈카인이 유리되어 미세아교세 포의 CX3CR1에 작용하여 이 세포를 활성화함으로써 신경세포와 아교세포 간의 중요한 신호전달 물질로 추정되고 있다(Watkins etal.,2003;Vuaillatetal.,
2007). 이전의 연구들에서 외인성 프랙탈카인 주입 시에 CX3CR1과의 결합을
통해 이질통 및 통각과민이 유발되었으며,신경병증성 통증의 동물 모델에서 프 랙탈카인 차단제는 이질통 및 통각과민을 감소시켰다는 보고가 있었다.또한 말 초신경 손상이 신경세포에서 프랙탈카인을 유리하여 척수 후각의 미세아교세포
를 활성화함으로써 통증을 촉진하는 것으로 보고하고 있다(Verge etal.,2002;
Watkinsetal.,2003).
후근신경절과 케모카인의 직접적인 연관성에 대한 연구에서는 후근신경절 내 신경세포에서 케모카인 수용체들이 발현되고,케모카인 주입 시에 세포내 칼 슘 농도가 증가되며,케모카인에 감수성이 있는 대부분의 신경세포들은 통증과 관련됨을 보고 하였다(Ohetal.,2001;Abbadie,2005).
여러 신경손상 동물 모델 중 수핵을 이용한 요추간판 탈출증 모델을 이용한 연구는 많지 않으며,케모카인과 CX3CR1에 대한 연구는 대부분 척수후각에서 연구되어,후근신경절에서의 CX3CR1발현의 시간적 변화에 대한 연구는 아직까 지 보고된 바 없었다.이에 본 연구에서는 자가수핵이식 요추간판 탈출증 모델에 서 신경병증성 통증의 발현 변화와 함께 후근신경절에서의 시간적 변화에 따른 CX3CR1발현양상을 알아보고자 하였다.
Ⅱ.연구대상 및 방법
A.실험 동물
총 98마리의 체중 200~250그램의 Sprague-Dawley종 수컷 흰 쥐를 사용하였
고,모든 시술은 미국국립보건원의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따랐다.
B.요추간판 탈출 모델 제작 연구 방법
Zoletil(Virbac Laboratories,France,50mg/kg)을 복강내 주사하여 전신마취 를 유도하였다. 마취 유도 후 요추 1번에서 천추 3번까지의 등쪽 털을 제거하고
povidoneiodine용액으로 소독한 후 요추부에서 정중선을 따라 피부를 절개하고
요추 4번에서 천추 1번까지의 다열근을 박리하여 척추골을 노출시킨 후 복와위 로 고정하였다.좌측 제5번 요추 신경근과 후근 신경절을 노출시키기 위해 척추 후궁절제술을 시행한 후 쥐꼬리의 제2번과 3번 미추간 추간판에서 수핵을 채취
하여 좌측 제5번 후근 신경절의 근위부에 이식하였다(Fig 1, Ito등,2007).피부
를 봉합하고 povidone iodine 용액으로 소독한 후 사육하였으며 2일간
kanamycin(Komipharm,Shihung,Korea,80mg/kg)을 근육내 주사하여 감염을 예방하였다.Sham 대조군은 모든 수술적 처치를 실험군과 동일하게 시행하고 꼬 리에서 수핵을 채취하였으나,이식은 시행하지 않았다.
-4-Fig.1.A:Operative set-up for lumbar disc herniation modelin an anesthetized rat.B:Sequence of operating microscopic view (a-d) of experimental procedure for application of nucleus pulposus without mechanicalcompression.
C.통증에 대한 행동 검사
각각 술 후 1일,5일,10일 20일,30일에 통증에 대한 행동검사를 시행하
였다.(실험군 n=10,대조군 n=10)열 자극에 대한 통각과민을 평가하기 위해
Hargreaves등(Hargreavesetal.,1988)의 방법을 이용하여 sham 대조군과 실험 군에서 술 전,술 후 1일,5일,10일,20일,30일에 각각 열 자극 후 회피 반응이 일어날 때까지의 시간으로 통각 과민의 정도를 측정하였다.흰 쥐를 깨어있는 상 태에서 유리판이 있는 투명한 플라스틱 상자 안에 넣고 30분 동안 안정시킨 후
족저부에 방사열이 가해지도록 300watt의 할로겐 전구를 5mm 두께의 유리판에
대었다(Model336 combination unit,IITC/life Science Instruments,Woodland
Hill,CA,USA).양 측의 뒷발바닥 면을 교대로 검사하였으며,각 발바닥에 대한
실험은 적어도 30초 이상의 간격을 두고 시행하였고,발바닥 면이 완전히 유리판 에 닿은 후 안정 상태에 있도록 한 후 검사를 시행하였다.이후 회피반응이 나타
구했다.(Fig.2) 기계적 자극에 대한 이질통을 평가하기 위해 sham 대조군과 실험군에서 술 전,술 후 1일,5일,10일,20일,30일에 각각 흰 쥐의 요추 제5번 피부분절에 해 당하는 뒷발바닥의 후외측에 von Frey filaments를 이용하여 기계적 자극 후 회 피반응을 평가하였다.흰 쥐를 깨어있는 상태에서 격자 한 개의 크기가 3×3mm 인 철망 바닥 위에 놓은 후 투명한 플라스틱 상자 안에서 30분간 적응시킨 후 0.1g의 압력부터 시작하여 압력을 순차적으로 증가시키면서 6~8초 동안 자극을 가하였다. 이질통의 역치는 von Frey filaments가 휘어질 정도의 압력을 2~3초 간격으로 10회 가하였을 때 5회 이상의 회피반응이 나타나는 압력으로 하였다 (Chaplan등,1994).(Fig.2)
Fig.2.Thermalhyperalgesia was determined by measuring hindpaw thermalwithdrawalresponse using a radiantheat(A)and mechanical allodynia was tested by measuring hindpaw mechanical withdrawal responseusing von Frey filaments(B).
D.RealTimePCR(polymeraseChain Reaction)
시간의 변화에 따른 후근 신경절에서의 CX3CR1의 발현 정도를 관찰하기 위
해 통증에 대한 행동검사 후 realtime PCR 검사를 시행하였다(각 시간대별로
n=9,control(24hsham):n=9,총 54마리)
-6-총 RNA는 흰 쥐의 요추 제5번 후근 신경절 조직에서 술 후 1일,5일,10일, 20일,30일에 각 시간대별로 분리하여 액체질소에 얼린 후 RNA 추출 전까지 -86℃에서 보관하였다. 각 샘플에서의 Trizol 시약(Invitrogen Corporation,
Carlsbad,CA,USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였으며,순도는 분광광도계를
이용하여 검사하였다. 총 RNA의 1ug을 cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems,USA)를 사용하여 25℃에서 10분,37℃에서 120분 반응시 켜 cDNA를 합성하였다.7500 RealTime PCR system (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 realtime PCR 측정을 시행하였다.ProbeFinder software (Universal Probe Library (UPL),Roche,Switzerland)를 사용하여 primer와 TaqMan probe를 설계하였다.사용된 primer는 CX3CR1에 대하여 senseprimer 5’-GTG GGA CTG GGT GAG TGG-3’과 antisenseprimer5’-GAG GTA GGC
ATG GTG AGG TC-3’과 HPRT(내부 참조 대조군)에 대하여 sense primer
5'-GGT CCA TTC CTA TGA CTG TAG ATT TT-3'와 antisense primer
5'-CAA TCA AGA CGT TCT TTC CAG TT-3'를 사용하였다.Mastermix는
250nm의 UPL probe,700nM의 각 primer(sense 및 antisense),5X TaqMan master4μl,cDNA2μl로 구성되었다.PCR 조건은 95℃에서 10분간 전배양 후,총 50회 동안 95℃에서 10초간의 denaturation,60℃에서 1분간의 annealing을 실시 하였다.
E.면역형광염색검사(Immunohistochemistry)
CX3CR1의 발현 여부를 면역조직화학법으로 확인하기 위해,술 후 1일,3일, 5일,10일,20일,30일에 흰 쥐를 희생시켰다(각 시간대별로 n=4).Zoletil(Virbac Laboratories,France,50mg/kg)을 복강내 주사하여 전신마취를 유도하였으며,헤
파린 첨가 식염수를 관류시킨 후 4% paraformaldehyde 500ml(in 0.1M
phosphatebuffer(PB),pH 7.4)로 고정시켰다.요추 제5번 후근 신경절을 제거하
phosphatebuffer(PB),pH 7.4)로 동결방지 처리하였다.40um의 두께로 후근 신 경절을 절단하여 절편들을 인산염 완충액 내에 보관하였다.면역형광염색을 위하 여 절편들을 10% 정상 당나귀혈청(NDS,Jackson Immunolabs,West Grove,
PA,USA)(inPB)내에서 10분간 block한 후 1차 항체의 혼합물과 함께 하룻밤
동안 배양하였다.후근신경절에서의 CX3CR1발현 여부를 관찰하기 위해 rabbit
anti-CX3CR1(1:500,Torrey PinesBiolab,La Jolla,CA,USA)으로 면역형광염 색을 시행하였다.1차 항체의 혼합물과 함께 밤동안 배양한 다음 절편을 세척하
고 10분간 2% NDS에서 배양하였고,그 후 3시간 동안 PBS에서 Cy3 (1:200,
Jackson Immunolabs, West Grove, PA, USA)와 결합되는 2차 donke
y-antirabbit항체와 함께 배양하였다.수차례 세척 후 절편을 슬라이드 위에 올려
놓고 Vectashield (Vector)로 덮은 후 광학현미경(DMRE,Leica,Germany)으로
관찰하였다.이미지는 현미경에 부착되어 있는 디지털카메라(F-view II,SIS,
Munster, Germany)로 얻었으며, 대조도와 밝기는 Photoshop(7.0, Adobe SystemsInc,SanJose,CA,USA)으로 조절하였다.
F.통계 분석
측정한 모든 자료는 SPSS version 15를 이용하여 분석한 후 평균±표준오차
로 나타내었다. 통증에 대한 행동검사는 Wilcoxon 부호순위검정과
Mann-Whitney Utest로,mRNA의 시간에 따른 발현 여부는 paired t-test및 independentt-test를 시행하였으며,통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.
-8-Ⅲ.결 과
A.통증에 대한 행동검사 열자극에 대한 통각과민 반응 검사에서는 동측(좌측)뒷발바닥에서의 통증 역치가 1일째부터 유의하게 감소되어(p<0.05),10일(p<0.01),20일(p<0.05),30일 (p<0.05)까지 유의하게 감소되었으며,반대측(우측)뒷발바닥에서는 1일(p<0.05), 10일(p<0.01)까지만 유의하게 감소된 결과를 나타내었다.양측 모두 10일째 회 피반응의 잠시가 가장 많이 감소하였으며,이후 서서히 증가되었다.(Fig.3)Fig.3.Comparison ofthermalhyperalgesia.Hindpaw withdrawallatencies inresponsetoaradiantheatoftheexperimental(lumbardischerniation)and sham groups.Responsesto thermalstimulation ofthehindpaw wasreduced during 1 day through 30 days in the left hindpaw after surgery in experimental group. *p<0.05, †p<0.01, Values are mean±SD(n=10). Test: lumbardischerniation,Left:ipsilateral,Right:contralateral.
기계적 이질통에 대한 반응검사에서는 동측 뒷발바닥에서의 통증 역치가 1일 째부터 유의하게 감소되어(p<0.01),5일 (p<0.01),10일 (p<0.01),20일 (p<0.01),
30 일 (p<0.01) 까지 유의하게 감소되었으며, 반대측 뒷발바닥에서는 20일
(p<0.01)부터 30일 (p<0.05)까지 유의하게 감소된 결과를 나타내었다.(Fig.4)
Fig. 4. Comparison of mechanical allodynia. Hindpaw withdrawal thresholds in response to a von Frey filamentofthe experimental(lumbar disc herniation) and sham groups.A significant reduction in mechanical withdrawalthreshold was seen during 1 day through 30 days in the left hindpaw aftersurgery in experimentalgroup. *p<0.05,†p<0.01 indicate the values significantly different from contralateral sham value Values are mean±SD (n=10).Left:ipsilateral,Right:contralateral
B.RealTimePCR
동측 후근신경절에서의 CX3CR1mRNA의 발현량은 24시간 반대측 sham 군
의 후근신경절에서의 발현량에 비하여 1일째 유의한 감소를 보였으며(p<0.05),
-10-보였으며 이후 감소되는 양상을 보였다.반대측 후근신경절에서는 1일째에만 유 의하게 감소되었고(p<0.05),이후에는 유의한 차이를 나타내지 않았으나 동측과 비슷하게 20일째까지 증가되었다가 이후 감소하는 경향을 보였다.동측과 반대측 후근신경절 간의 mRNA 발현 정도는 시간경과에 따라 유의한 차이를 나타내지 않았다.(Fig.5)
Fig.5.CX3CR1mRNA expression ofipsilateraland contralateraldorsal rootganglion in theexperimentalgroup,andsham group.
The expression amount of mRNA for CX3CR1 in the ipsilateralDRG of experimentalgroup wasincreased at10daysaftersurgery.*p<0.05 indicate the values significantly differentfrom contralateral24h sham value.Values aremean±SD (n=5).ipsi:ipsilateral,contra:contralateral.
C.면역형광염색검사
3일째부터 시작하여 5일,10일,20일에 후근신경절 내 미세아교세포 및 미세 아교 세포에서의 CX3CR1발현 정도가 점차적으로 증가되었으며 30일에는 증가
Fig.6.Expression ofCX3CR1 in dorsalrootganglion 1,3 and 5 days after surgery,low power view.Gradualincrease ofimmunoreactivity for CX3CR1wasnotedespeciallyinipsilateraldorsalrootganglia.Scalebar=200μ m
-12-Fig.7.Expression of CX3CR1 in dorsalrootganglion 10,20 and 30 daysaftersurgery,low powerview.Gradualincreaseofimmunoreactivity for CX3CR1 was noted especially in ipsilateraldorsalroot ganglia.Scale bar=200μm.
Ⅳ.고 찰
본 연구에서는 흰 쥐의 제5번 척수신경근에 자가 수핵 이식 후 30일간의 장 기추적 조사로 열성 통각과민 및 기계적 이질통의 신경병성 통증이 발생함과 후 근신경절에서 CX3CR1의 시간에 따른 변화 양상을 관찰하였다. 기계적 이질통의 경우 동측에서는 수핵 이식 1일째부터 유의하게 감소되어 10일째 최고조를 나타낸 후 30일째까지 유지되었고,손상이 없는 반대측의 경우 에도 20일째부터 유의하게 감소되어 30일째까지 지속되었다.열성 통각과민의 경 우 동측에서는 수핵 이식 1일째부터 발생하여 10일째 최고조를 나타낸 후 30일 까지 유지되었으며,반대측에서는 1일째와 10일째에만 유의하게 감소되고,이후 에는 유의한 결과를 보이지 않았다.반대측의 통증은 동측보다 늦게 발현되었고, 통증 정도도 약한 결과를 나타내었다. 다른 연구들의 자가 수핵 이식 모델에서 통증의 시작과 지속 기간이 대부분 술후 1일째부터 기계적 이질통 및 통각과민이 발생하여 3주 내에 줄어든다고 보 고하고 있다(Olmarker등,1993;Yaburi등,1998;Kallkuri등,2005).본 연구에 서는 술후 1일째부터 통증이 발생하는 것은 타 연구들과 차이가 없었으나,통증 이 30일째에도 감소되지 않고 지속되는 양상을 보여 차이를 보였다.이러한 차이 는 타 연구들의 경우엔 자가 이식을 후근신경절의 원위부에 하였지만 본 연구에 서는 임상적 상황과 좀 더 유사한 위치인 후근신경절의 근위부와 후근신경절이 만나는 부위에 이식함으로써 장기간 신경병증성 통증이 유지된 것으로 판단된다. 또한 통증이 동측에 국한되지 않고 손상이 유발되지 않은 반대측에서도 나타 나는 양상을 보였으며 이는 다른 연구들과의 결과와 일치한다(Koltzenburg 등, 1999; Milligan등,2003; Hubbard등,2005).손상이 없는 반대측의 통증 발현,즉 거울상 신경병증성 통증(mirror-imageneuropathicpain)은 통증의 질은 비슷 하나,통증의 강도가 적고,지속 시간은 더 짧은 것으로 알려져 있다.거울상 신
-14-경병증성 통증이 발생되는 추정 기전으로는 신경이 손상되면서 발생되는 부산물
의 혈액 내 순환으로 인한 체액 기전(humoralmechanism)과 표적으로의 양측
신경 투사 및 경중앙 발아(transmedian sprouting),중추신경계를 통한 반대측과 의 교통(communication),맞교차 사이신경세포(commissuralinterneuron)를 통한 교통 등의 신경세포 기전(neuronalmechanism)(Koltzenburg 등,1999),척수 신 경아교세포의 광범위한 틈새이음 연접성(gap junctionalconnectivity)에 의한 비 신경세포 기전(non-neuronalmechanism)(Spataro 등,2004),신경아교세포와 염
증성 사이토카인에 의한 기전(Milligan등,2003)등이 제시되고 있다. 후근신경절에서의 CX3CR1의 발현양상은 24시간 반대측 sham 군의 후근신 경절에서의 발현량에 비하여 양측 모두에서 1일째 유의한 감소를 보이다가 20일 째까지 서서히 증가되어 동측에서는 20일째에 유의한 증가를 보인 반면 반대측 은 유의한 증가를 보이지 않았으며,이후 30일에는 감소하였다.면역형광염색검 사에서는 3일째부터 시작하여 20일째까지 미세아교세포에서의 CX3CR1의 발현이 증가되는 양상을 보이다가 30일째에는 증가되지 않았다.통증의 발현 양상이 10 일째 최고조를 나타낸 반면 CX3CR1의 발현은 20일째 최고조를 나타내어 통증 발현보다는 약간 지연되는 양상을 보였다.통증 반응과 함께 CX3CR1의 발현이 증가되는 것으로 보아 신경병증성 통증의 발생에 CX3CR1의 발현이 연관성이 있 을 것으로 생각해 볼 수 있다.하지만 시간적으로 약간 지연되는 것으로 볼 때 TNF-α,인터루킨-1 등과 같은 전염증성(proinflammatory) 사이토카인이 초기 염증성 통증을 매개하고,이후 아급성기에 CX3CR1등이 화학주성인자로 작용하 면서 더욱 염증반응을 증폭시키던지,직접적으로 염증반응이나 신경병증성 통증 을 악화시키는 역할을 한 것으로 보인다.이는 이전의 보고에서 Ahn 등(Ahn et al,2002)이 수술이 필요한 정도의 아급성기의 방사통이 심한 환자들에서 케모카 인의 한 종류인 인터루킨-8이 증가하고,TNF-α,인터루킨-1의 증가는 미미하다 고 보고한 것으로 유추할 수 있다.또한 척수의 후각에서의 CX3CR1의 발현은 미세아교세포의 발현 증가와 함께 초기부터 증가된다고 보고되고 있으나,(Verge
etal.,2004,Zhuang etal.,2007) 본 연구에서의 후근신경절에서의 CX3CR1의 발현 양상은 초기에는 오히려 감소되었다가 이후 20일째까지 증가되어 최고조를 이루고 이후 감소하는 양상을 보여 척수 후각에서의 CX3CR1의 발현양상과는 차 이를 보였다.하지만 면역형광염색 검사상 손상시부터 20일까지 지속되는 것은 통증 반응이 지속되는 것과 연관이 있을 것으로 생각된다.면역형광염색 검사 소 견은 열성 통각과민의 패턴과 유사한 경향을 보였다.CX3CR1의 발현이 열성 통 각과민을 반영할 수도 있는데,이를 밝혀내기 위해선 CX3CR1이 염색되는 세포 에서 transientreceptorpotentialvanilloid(TRPV)가 동시 염색되는 지를 확인하 는 추후 연구가 필요할 것으로 보인다. 임상적으로 환자들이 병원에 치료를 받으러 올 때는 아급성인 경우가 많은 점을 고려한다면 본 연구에서 수술 20일까지 지속되는 CX3CR1은 많은 경우 치 료의 중요한 표적이 될 수 있을 것으로 보인다.특히 경추간공 경막외스테로이드 주사는 후근신경절을 포함하여 신경근 전체를 주사액으로 적시게 되어 CX3CR1 을 억제하여 통증을 감소시킬 수 있으며,CX3CR1에 대한 선택적 길항제 투여도 통증 억제에 도움을 줄 수 있을 것이다.그러나 본 연구에서 자가 수핵 이식으로 생긴 신경병증성 통증에 대해 CX3CR1의 길항제를 투여하여 통증이 억제되는 지 를 확인하지 못한 것은 CX3CR1과 신경병증성 통증과의 직접적인 연관성을 규명 하지 못한 제한점이며,향후 이에 대한 규명이 필요할 것으로 생각된다.
-16-Ⅴ.결 론
자가 수핵 이식을 이용한 흰 쥐의 요추 추간판 통증 모델에서 신경병증성 통증이 나타나 장기간 지속되었으며,후근 신경절에서의 CX3CR1의 시간에 따른 발현은 아급성기 신경병증성 통증의 발생과 연관성이 있을 것으로 생각된다.
참고문헌
1. Abbadie C: Chemokines, chemokine receptors and pain. Trends Immunol 26(10): 529-534, 2005
2. Ahn SH, Cho YW, Ahn MW, Jang SH, Sohn YK, Kim HS: mRNA expression of cytokines and chemokines in herniated lumbar intervertebral discs. Spine 27(9): 911-917, 2002
3. Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL: Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods 53(1): 55-63, 1994
4. Goupille P, Mulleman D, Valat JP: Radiculopathy associated with disc herniation. Ann Rheum Dis 65(2 ): 141-143, 2006
5. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J: A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 32(1): 77-88, 1988
6. Hashizume H, DeLeo JA, Colburn RW, Weinstein JN: Spinal glial activation and cytokine expression after lumbar root injury in the rat. Spine 25(10): 1206–1217, 2000
7. Hubbard RD, Winkelstein BA: Transient cervical nerve root compression in the rat induces bilateral forepaw allodynia and spinal glial activation: mecanical factors in painful neck injuries. Spine. Sep 1;30(17): 1924-1932, 2005
8. Ito T, Ohtori S, Inoue G, Koshi T, Doya H, Ozawa T, Saito T, Moriya H, Takahashi K: Glial phosphorylated p38 MAP kinase mediates pain in a rat model of lumbar disc herniation and induces motor
-18-dysfunction in a rat model of lumbar spinal canal stenosis. Spine 32(2): 159–167, 2007
9. Kalluakuri S, Takebayashi T, Ozaktay AC, Chen C, Yang S, Wooley PH, Cavanaugh JM: The effects of epidural application of allografted nucleus pulposus in rats on cytokine expression, limb withdrawal and nerve root discharge. Dec;14(10): 956-964, 2005
10. Koltzenburg M, Wall PD, McMahon SB: Does the right side know what the left is doing? Trend Neurosci. Mar 22(3): 122-127, 1999 11. McCarron RF, Wimpee MW, Hudkins PG, Laros GS. The
inflammatory effect of nucleus pulposus. A possible element in the pathogenesis of low back pain. Spine 12(8): 760-764, 1987
12. Milligan ED, Twing C, Chacur M, Biedenkapp J, O'connor K, Poole S, Tracey K, Maise SF, Watkins LR: Spinal glia and proinflammatory cytokines mediate mirror-image neuropathic pain in rats. J Neurosci. Feb 1; 23(3): 1026-1040, 2003
13. Mulleman D, Mammou S, Griffoul I, Watier H, Goupille P. Pathophysiology of disk-related sciatica. I.-Evidence supporting a chemical component. Joint Bone Spine 73(2): 151-158, 2006
14. Oh SB, Tran PB, Gillard SE, Hurley RW, Hammond DL, Miller RJ; Chemokines and glycoprotein120 produce pain hypersensitivity by directly exciting primary nociceptive neurons. J. Neurosci. Jul 15;21(14): 5027-5035, 2001
15. Olmarker K, Rydevik B, Nordborg C; Autologous nucleus pulposus induces neurophysiologic and histologic changes in porcine cauda equina nerve roots. Spine 18(11): 1425-1432, 1993
16. Olmarker K, Larsson K, Tumor necrosis factor alpha and nucleus pulposus induced nerve root injury. Spine 23(23): 2538-2544, 1998 17. Raghavendra V, Tanga F, Deleo JA; Inhibition of microglial activation
attenuates the development but not existing hypersensitivity in a rat model of neuropathy. J pharmacol Exp Ther. 306(2): 624-630, 2003
18. Savarin-Vuaillat C, Ransohoff RM: Chemokines and chemokine receptors in neurological disease: raise, retain, or reduce? Neurotherapeutics 4(4): 590-601, 2007
19. Spataro LE, Sloane EM, Milligan ED, Wieseler-Frank J, Schoeniger D, Jekich BM, Barrientos RM, Maier SF, Watkins LR; Spinal gap junctions: potential involvement in pain facilitation. J pain. Sep; 5(7): 392-405, 2004
20. Specchia N, Pagnotta A, Toesca A, Greco F; Cytokines and growth factors in the protruded intervertebral disc of the lumbar spine. Eur Spine J. 11(2): 145-151, 2002
21. Tsuda M, Inoue K, Salter MW; Neuropathic pain and spinal microglia: a big problem from molecules in 'small' glia. Trends Neurosci 28(2): 101-107, 2005
22. Verge GM, Milligan ED, Maier SF, Watkins LR, Naeve GS, Foster AC: Fractalkine (CX3CL1) and fractalkine receptor (CX3CR1) distribution in spinal cord and dorsal root ganglia under basal and neuropathic pain conditions. Eur J Neurosci 20(5): 1150-1160, 2004 23. Watkins LR, Milligan ED, Maier SF: Glial activation: A driving force
-20-24. Watkins LR, Maier SF: A novel drug discovery target for clinical pain. Nat Rev Drug Discov 2(12): 973-985, 2003
25. Yabuki S, Kikuchi S, Olmarker K, Myers RR: Acute effects of nucleus pulpo년 on blood flow and endoneurial fluid pressure in rat dorsal root ganglia. Spine. 23(23):2517-2523, 1998
26. Zhuang ZY, Kawasaki Y, Tan PH, Wen YR, Hung J, Ji RR: Role of the CX3CR1/p38 MAPK pathway in spinal microglia for the development of neuropathic pain following nerve injury-induced cleavage of fractalkine. Brain Behav Immun 21(5): 642-651, 2007
-ABSTRACT-Sequential Changes of CX3CR1 in Dorsal Root Ganglion
in a Rat Model of Lumbar Disc Herniation
Hye Jin Seo
Department of Medical Sciences The Graduate School, Ajou University
Supervised by Professor Ueon Woo Rah
Objective: To investigate the pain-related behaviors and the changes of CX3CR1 expression in the dorsal root ganglion(DRG) in a rat model of lumbar disc herniation.
Method: A total of 98 male Sprague-Dawley rat(200-250g) were used. A laminectomy was performed to expose left L5 nerve roots and associated DRG. Autologous nucleus puplosus was implanted on the left L5 nerve root proximal to the DRG without mechanical compression. The sham operation was also done with the same precedure as mentioned above. Thermal hyperalgesia and mechanical allodynia was assesed by using von Frey filament and hindpaw thermal withdrawal response at 1, 5, 10, 20 and 30 days after surgery. Real time PCR and Immunohistochemistry after behavioral test was performed.
Results: In the lumbar disc herniation rats, a significant reduction of thermal withdrawal latency indicating thermal hyperalgesia was seen on
-22-the ipsilateral hindpaw at postoperative day 1(p<0.01) and peaked at day 10(p<0.05) and maintained throughout day 30(p<0.05). The reduction of mechanical allodynia threshold, indicating mechanical allodynia, was observed on the ipsilateral hindpaw at postoperative day 1(p<0.01) and continued throughout day 30(p<0.01). Real time PCR showed the decrease in mRNA expression of CX3CR1 in the ipsilateral DRG at day 1(p<0.05) and the significant increase at day 20(p<0.05). The immunoreactivity for CX3CR1 was also increased in ipsilateral DRG from day 3 to day 20.
Conclusion: These data suggest that lumbar disc herniation with nucleus pulosus induces thermal hyperalgesia and mechanical allodynia and upregulates the expression of CX3CR1 in dorsal root ganglion. Expression of CX3CR1 might be associated with subacute neuropathic pain after intervertebral disc herniation.
Key words: Dorsal root ganglion, CX3CR1, Chemokine, disc herniation
