의학
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의학 석사학위
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석사학위 논문
논문
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-국문요약-C
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분석
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세포성장인자가 G0/G1phase외의 다른 세포주기에서 어떤 작용을 하는지 아직 잘 연구되어 있지 않은 상태이다.우리 그룹에서는 실제로 성장인자 중의 하나인 간세포성장인자(HGF)가 G2phase에서는 어떻게 영향을 주는지에 대해 연구하였 고,그 과정 중 G2checkpoint억제제로 알려져 있는 caffeine이 성장인자에 의해 나타나는 G2 checkpoint반응에 어떻게 작용을 하는지 알아보고자 하였다. Caffeine을 간세포 성장인자와 함께 처리했을 때,성장인자에 의해 나타나는 지 연현상이 없어질 것이라는 예상과는 달리 오히려 지연현상을 더욱 증가시키는 결과를 볼 수 있었다.Caffeine과 HGF를 처리했을 때 지연현상이 강화되었음을 FACS analysis와 mitoticindex를 통해 확인하였고,세포주기 중 G2phase에서 mitosis로 진행될 때 중요한 요소인 cdk1의 활성도는 어떻게 변하는지 알아보기 위해 cdkkinase assay를,cdk1의 활성을 조절하는 단백질의 변화를 보기위해 cyclinA,B에 대한 western blotting을 수행하였다. Caffeine과 HGF에 의해 증가된 지연현상이 mitosis에 중요한 cdk1의 활성도가 뒤늦게 나타남으로 인해 일어나는 현상이란 것을 확인할 수 있었고,cdk1활성도만큼이나 중요한 cdk1/cyclin B의 핵으로의 위치도 뒤늦게 진행되는 것을 면역형광염색법을 통해 볼 수 있었다.
Caffeine에 의해 증가된 지연현상의 원인이 무엇인지를 알아보기 위해 G2/M 진행에 중요한 pathway들을 siRNA와 inhibitortest,western blotting을 이용해 확인해 보았다.G2checkpoint에 있어서 중요한 pathway에는 DNA손상과 관련된 ATM/ATR pathway외에 JNK,P38,PI3kinase,ERK가 있는데,inhibitortest와 western blot을 통해 ERK pathway가 caffeine에 의한 증가된 지연현상과 가장
관련이 있는 것을 확인하였다.실제로 caffeine과 HGF를 처리할 경우,HGF에 의 한 ERK의 인산화를 더욱 증가시키는 것을 확인하였다.Caffeine은 또한 AKT의 인산화를 감소시켰는데,PI3 kinase 억제제인 LY294002와 HGF를 처리했을 때 caffeine과 HGF를 처리한 결과와 유사한 G2지연현상을 관찰할 수 있었다.G2 phase외에 caffeine이 mitosis에는 어떠한 영향을 미치는지 알아본 결과 mitosis 과정 중에는 caffeine자체만이 지연시키는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들을 봤을 때 caffeine이 PI3 kinase의 억제제로 작용하고,PI3 kinase가 억제됨으로 해서 ERK의 인산화가 증가되어 그 결과 G2phase에서 지 연현상이 일어나는 가설을 세우게 되었다.실제로 이 가설을 확인하기 위해서 PI3kinase와 ERK간에 연관성이 있는지 좀 더 연구해야 할 부분으로 남아있다.
차
차
차 례
례
례
국문요약 ···ⅰ 차 례 ···ⅲ 그림차례 ···ⅴ Ⅰ.서론 ···1 Ⅱ.재료 및 방법 ···4 A.세포주 배양 ···4 B.항체 및 시약 ···4C.Cellsynchronization···4
D.세포처리 ···4
E.Irradiation···5
F.Westernblotting···5
G.면역침강법(immunoprecipitaion)과 CDK1kinaseassay···5
H.Mitoticcellcounting···6
I.Cellcycleprogressionanalysis···6
J.SiRNA 이 입 (transfection)···7
K.면역형광염색 ···7
L.Time-lapseanalysis···8
Ⅲ.결과 ···9
A.HGF에 의한 G2delay현상 ···9
B.G2/M 진행 중 caffeine에 의해 증가된 HGF 지연현상 ···9
C.ATM/ATR 관련성 확인 ···10
D.G2/M 진행에 영향을 주는 pathway들의 관련성 확인 ···11
E.Caffeine,HGF 처리 시 JNK/SAPK,P38,AKT, ERK1/2pathway에 주는 영향 확인 ···12
Ⅳ.고찰 ···29
V.결론 ···33
참고문헌 ···34
그
그
그림
림
림 차
차
차례
례
례
Fig. 1.HGF inducesG2delaythroughERK/RSK pathway
inHeLacells.···14 Fig. 2.HGF-inducedG2delayisaugmentedbycaffeine.···15 Fig. 3.G2delayinducedbyHGF andcaffeinewasaccompanied
bythedelayofthechangeofrelatedcellcycleregulators
andcdk1activity.···16 Fig. 4.CyclinB1nucleartranslocationwasdelayedbycaffeine
inHGF-treatedHeLacells.···17 Fig. 5.ATM/ATR kinaseswerenotinvolvedinG2delay
inducedbyHGF andcaffeine.···18 Fig. 6.JNK/SAPK pathwaywasnotinvolvedinG2delay
inducedbyHGF andcaffeine.···19 Fig. 7.P38pathwaywasnotinvolvedinG2delayinduced
byHGF andcaffeine.···20 Fig. 8.LY294002treatmentaugmentedtheHGF-induced
G2delay.···21 Fig. 9.AugmentedG2delaybyHGF andcaffeinewasabolished
byblockingofERK pathway.···22 Fig10.CaffeinedidnotaffectpRSK,pP38andpJNK,but
reducedthepAKT.···24 Fig11.CaffeineaugmentedtheERK phosphorylationinducedby
HGF onsynchronizedandasynchronizedcells.···26 Fig12.Model.CaffeineaugmentedtheG2delayinducedby
HGF viaERK1/2pathway.···27 Fig13.Caffeinecoulddelaythemitosisduration.···28
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ.
.
.서
서
서 론
론
론
세포주기는 휴지기인 G0와 간기인 G1,S,G2그리고 분열기인 M phase로 이루어진다.세포주기의 각 부분은 cyclin과 cyclin-dependentkinase로 이루어진 복합체에 의해 조절되고, 특히 mitosis entry에 있어서는 cyclin B와 cdk1 complex가 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다.Cdk1의 activity는 또한 인산 화에 의해 조절된다.이중 중요한 인산화 작용은 CAK(cdk-activating kinase)에 의해 이루어지는데,CAK가 cdk1/cyclin B의 Thr161번 자리를 인산화 시키면서 activation 시키게 된다(Desai등, 1995). 한편 cdk1/cyclin B는 kinase의 ATP-binding domain에 있는 두 군데의 inhibitory site(Thr14,Tyr15)가 wee1 이라는 kinase에 의해 인산화 되면서 inactive form을 유지하게 된다.세포가 mitosis로 넘어가기 위해서는 wee1에 의해 인산화 된 inhibitory site가 탈 인산 화 되어 cdk1/cyclin B가 활성화 되어야 하는데,이때 inhibitory site를 탈 인산 화 시키는 단백질이 CDC25C phosphatase이다(Veronique등,2001;Jayashree등, 2004).
G2phase에서 mitosis로 진행시에는 DNA의 손상을 확인하는 G2checkpoint 가 있다.즉,DNA에 손상이 있으면,자손에게 잘못된 유전정보를 전달 할 수 있 기 때문에 복구 가능한 손상의 경우 checkpoint가 활성화 되어 잠시 동안 mitosis를 넘어가지 못하게 함으로써 손상된 DNA를 복구할 수 있는 충분한 시 간을 제공하게 된다.하지만 복구할 수 없을 정도의 큰 손상이 있을 경우에는 세 포를 죽음으로 인도하는 역할을 하기도 한다.그 예로 ionizingradiation이나 UV 에 의해 DNA가 손상을 입게 되면 damagesensorprotein인 ATM/ATR kinase 가 활성화 된다.활성화된 ATM/ATR은 CHK1/CHK2를 활성화시키고,CDC25C 가 활성화 되지 못하게 해서 cdk1/cyclin B를 비활성화 시키게 되며 그 결과로 세포는 mitosis로 들어가지 못하게 된다(Robert,2001;Hui등,2001;Jacob등, 2001).DNA 손상에 의해 G2 checkpoint를 활성화 시킬 수 있는 또 다른 pathway로는 P38pathway가 있다.알려진 바에 의하면 UV에 의해 P38단백질
이 활성화되고,활성화된 P38 단백질은 CDC25B phosphatase를 억제해서 역시 세포가 mitosis로 들어가지 못하게 한다(Dmitry등,2001).
Caffeine(methylxanthine)은 ATM/ATR signaling과 checkpoint반응 연구에 많이 이용되어 온 약물이다.지금까지의 연구에 의하면 caffeine은 세포의 다양한 부분에 영향을 주는 것으로 알려져 있는데,그 예로,adenosinereceptor의 길항 작용,phosphodiesterase억제,근육 수축 촉진,glucosemetabolism 변형,세포 증식 억제 등이 있고.또한 caffeine을 농도별로 여러 세포주에 처리했을 때 apoptosis를 일으킬 수 있는 것으로도 알려져 있다.Caffeine이 가장 많이 연구된 부분의 하나는 cellcycle checkpoint억제와 radiosensitization으로,caffeine이 ATM/ATR signaling과 checkpoint를 억제시키기 때문에 S phase, G2/M checkpoint연구에 많이 사용되고 있다(Jann등,1999;David,2003;Takashi등, 2004;Jacob등,2005).
간세포성장인자(hepatocyte growth factor;HGF)는 Metreceptortyrosine kinase를 활성화시키는 ligand로서 중배엽 유래세포에서 발현되며,상피세포의 이 동을 촉진하기 때문에 scatter인자로도 불린다(Bottaro등,1991).HGF가 Met에 결합하면 여러 가지 다양한 생물학적인 활성을 보이게 되는데,세포증식,세포생 존,세포이동,그리고 신생혈관생성에 관련이 있고,발생초기의 발달에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Schmidt등,1995;Zhu등,1994).
세포주기의 진행에 있어서 세포성장인자의 주요한 역할은 RAS/ERK pathway를 통한 cyclin D1 mRNA 증가와 PI3 kinase/AKT pathway를 통한 cyclin D1degradation억제,kinaseinhibitor(p27)억제(Surabhi등,2003)가 있다. CyclinD1의 양이 계속 증가하게 되면,결과적으로 cyclinD1과 cdk4,6의 복합 체가 형성되어 활성화되고,활성화된 cyclin D1/cdk 4,6은 RB(Retinoblastoma protein)라는 단백질이 인산화가 되도록 한다.그 결과 RB와 결합되어 있던 E2F 전사인자가 자유롭게 되고,E2F는 cyclin E의 발현을 증가시켜 세포가 S phase 로 들어갈 수 있게 한다.이외에 세포성장인자가 세포주기 중 G1-S 이행 이외의 다른 phase에 작용하는 예로써 EGF에 의해 G2/M 전환이 일시적으로 지연되는
것으로 보고 된 바 있다(Holger등,1996).
본 연구실에서는 세포를 synchronization 시킨 후,HGF를 G2phase에 처리 했더니,G2/M 진행시 일시적인 지연현상이 나타나는 것을 관찰하였으며,이 과 정에 ERK pathway의 aberrantactivation이 관여함을 확인한 바 있었다.
이 지연 현상에 DNA damage checkpoint가 관여하는지 확인하기 위해 ATM/ATR 억제제인 caffeine을 처리해 본 결과,caffeine으로 ATM/ATR을 억 제 시켜도 HGF에 의한 G2/M 지연현상을 억제할 수 없음을 확인할 수 있었으며, 흥미롭게도 HGF에 의한 지연현상이 caffeine과 HGF를 같이 처리했을 때,보다 길어지는 결과를 관찰할 수 있었다. 본 연구에서는 caffeine과 HGF를 같이 처리 했을 때,더욱 길어지는 지연현 상을 확인하고,caffeine이 어떤 기작을 통해 HGF에 의해서 나타난 지연현상을 더욱 증가시켰는지 알아내고자 하였다.
Ⅱ
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Ⅱ.
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방
방법
법
법
A A A...세세세포포포주주주 배배배양양양 사람의 자궁경부암 세포주 인 HeLa cell을 10% 우태아 혈청(FBS),1% antibiotic-antimycotic(Gibco BRL)을 첨가한 F12-DMEM 배양액에서 배양하였 다.세포는 37℃,5% CO2incubator에서 배양하였다.B B
B...항항항체체체 및및및 시시시약약약
CyclinB,cyclinA,alpha-Tubulin,ATM,ATR,pP38,P38,securin,pJNK 에 대한 항체는 Santa Cruz(Santa Cruz,CA)로부터 구입하였다.CDK1 pY15, pRSK, RSK, pERK, ERK, pAKT, AKT에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Beberly, MA)에서 구입하였다. Thymidine, Caffeine, U0126, LY294002,SP600125,SB203580시약은 Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)에서 구입 하였고,Histon H1은 RocheDiagnostics(Indianapolis,IN)에서,Acetoorcein 은 Merck에서 각각 구입하였다. Horseradish peroxidase(HRP)가 결합된 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG는 Amersham Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway,NJ)에서 구입하였다.
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C...CCCeeellllsllssyyynnnccchhhrrrooonnniiizzzaaatttiiiooonnn
Doublethymidineblock 방법을 이용하여 HeLa cell을 synchronization했다. HeLa cell을 seeding하고 24시간 후에 1mM thymidine을 처리하고,18시간 후 PBS로 2번 washing해서 cell을 release했다. Washing 8시간 후 두 번째 thymidine을 같은 농도로 14시간동안 처리해서 G1/S 에 synchronization시켰다.
D D
D...세세세포포포처처처리리리
DTB로 cell을 synchronization하고, release시켰다. Release 후 6시간째에 U0126(5uM), LY294002(30uM), SB203580(30uM), SP600125(10uM),
caffeine(5mM)을 각각 처리했고,7시간째에 HGF(25ng/ml)를 처리했다. E
E
E...IIIrrrrrraaadddiiiaaatttiiiooonnn
DTB release후 5시간째에 선형가속기(Mevatron,Simens)를 이용해서 10Gy gamma-irradiation을 처리했다.
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F...WWWeeesssttteeerrrnnnbbblllooottttttiiinnnggg
HeLa cell을 100mm dish에 1.5x105개 seeding하고 24시간 후부터 DTB로 synchronization 시켰다.Synchronization된 HeLacell을 cold PBS로 washing해 서 release시켰고,이후 6시간,7시간째에 caffeine과 HGF를 각각 처리했다. HeLa cell을 figure에 표시된 시간대로 harvest하고 lysis buffer(20mM Tris, pH7.4,150mM NaCl,1% TritonX-100,0.1% SDS,proteaseinhibitor)로 40분간 ice에서 용해시켰다.세포 용해액을 microcentrifuge를 이용,11,000rpm으로 원심 분리하여 상층액을 얻고,이를 단백질 정량 시약 (Bio-Rad,Hercules,CA)으로 정량하였다.정량된 30ug의 단백질을 10% polyacrylamidegel에서 전기영동하고 nitrocellulosemembrane(Schleicher& Schuell,Keene,NH)으로 200mA에서 2 시간 동안 전기이동(electrotransfer)하였다.전기이동 후 blocking buffer(5%탈지 분유가 포함된 TBST)로 1시간 동안 상온에서 blocking하였다.Blocking buffer 에 1:1,000으로 희석한 일차 항체를 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 이후 TBST(0.02% Tween-20이 포함되어 있는 TBS)로 15분씩 3회 씻어준 후, HRP(horseradish peroxidase)가 붙어있는 이차항체를 TBST에 1:2,000으로 희석 하여 상온에서 1시간동안 반응시켰다. TBST로 10분씩 3회 씻어주고 ECL(Amersham Pharmacia)시약을 처리하여 발광시키고 X-ray film(Agfa)에 감 광시켰다.
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G...면면면역역역침침침강강강법법법(((IIImmmmmmuununnoooppprrreeeccciiipppiiitttaaatttiiiooonnn))과)과과 CCCDDDKKK111kkkiiinnnaaassseeaeaassssssaaayyy
시킨 후 6시간,7시간째에 각각 caffeine과 HGF를 처리하였다.이후 figure에 표 시된 시간대별로 harvest를 하고 lysisbuffer로 cell을 용해시켰다.200ug의 단백 질을 anti-cyclinB antibody,lysisbuffer와 혼합하여 4℃에서 하루 동안 반응시 켰다.반응 후 20ul의 protein G slurry(50% v/v)를 넣어 1시간동안 반응 시킨 후,5,000rpm으로,3분간 원심분리 하였다.상층액은 새 튜브에 옮겨 항체와 반응 하지 않은 단백질을 확인하는데 사용하였다.가라앉은 protein G bead를 lysis buffer로 2회 세척하고,kinase buffer(50mM Tris,pH7.5,10mM MgCl2,1mM DTT)로 2회 세척하였다.세척이 끝난 bead에 HistonH1(5mg/ml),[gamma-32P] ATP,kinasebuffer를 각각 넣고 30℃에서 30분간 반응시켰다.2xsamplebuffer 를 30ul넣고 5분간 끓여서 반응을 종결시키고,SDS-PAGE 전기영동을 하고 autoradiography로 확인하였다.
H H
H...MMMiiitttoootttiiicccccceeellllllcccooouununntttiiinnnggg
DTB로 synchronization시킨 cell을 release한 후, 각 시간대별로 세포를 harvest했다.세포에 PBS와 2% aceto-orcein(60% aceticacid)시약을 처리하여 chromosome을 염색했다.광학현미경을 이용해서 염색된 세포의 수를 파악하였 다.
I I
I...CCCeeellllllcccyyycccllleeeppprrrooogggrrreeessssssiiiooonnnaaannnaaalllyyysssiiisss
Synchronization된 cell을 trypsin을 이용해 harvest한 후 원심분리기를 이용 하여 1,000rpm에서 10분간 돌린 후 PBS로 세척하고 70% EtOH로 세포를 얼음 위에서 30분간 고정했다.다시 원심분리 하여 세포를 모은 후에 PBS로 3번 세척 하고 1mg/mlRNase(sigma)가 들어가 있는 PBS로 세포를 풀어주고 상온에서 10분간 반응시켰다.핵을 염색하기 위해 propidium iodide(PI)를 처리하여 10분간 반응시킨 후 FACS Vantageflowcytometer(Becton Dickinson)를 이용하여 시 료 량 104개를 세었다.
J J
J...SSSiiiRRRNNNAAA 이이이입입입 (((tttrrraaannnsssfffeeeccctttiiiooonnn)))
ATM/ATR siRNA를 HeLa cell에 이입시키기 위해 oligofectamine reagent (invitrogen)를 이용했다.HeLacell을 35mm dish에 2x104개를 seeding하고,24 시간 후 thymidine을 처리했다.18시간 후 release를 했고,이때 oligofectamine을 이용해서 controlsiRNA 또는 ATM/ATR siRAN를 100pM씩 넣어줬다.Release 와 siRNA 이입 후 8시간이 지난다음 두 번째 thymidine을 처리했고,24시간이 지난다음 다시 두 번째 release를 해줬다. 결과에 나온 시간대별로 세포를 harvest해서 FACS analysis,mitoticcellcounting,westernblotting을 시행하였 다.
K K
K...면면면역역역형형형광광광염염염색색색
Caffeine과 HGF를 처리한 후 cyclin B의 핵 내 이동정도를 관찰하기 위해 면역형광염색을 실행하였다.Well당 2x104개의 HeLacell을 커버슬립 위에서 24 시간동안 배양한 후, 위의 synchronization 방법인 DTB를 이용하여 cell을 synchronization 시켰다.Cell을 release 시킨 후 6시간째와 7시간째에 caffeine (5mM),HGF(25ng)를 각각 처리하였다.이후 표시된 시간대별로 cell을 차가운 PBS(phosphatebuffered saline)로 세척 후 aceton:methanol(1:1)용액으로 고정 하였다.고정된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 세포에 항체가 들어갈 수 있도록 0.075% Triton X-100이 들어있는 PBS로 5분간 처리하여 항체를 투과 (permeabilization)시켰다.PBS로 2회 세척하여 남아있는 TritonX-100을 완전히 제거하고 1% bovine serum albumin(BSA)이 들어있는 PBS로 상온에서 1시간 동안 blocking하였다.일차항체로 anti-cyclin B를 1% BSA가 들어있는 PBS에 1:200으로 희석하여 4℃에서 하루 동안 반응시켰다.반응 후에 PBS로 5분씩 3회 세척한 후 이차항체 (FITC-conjugatedgoatanti-mouseIgG)를 상온에서 1시간 동안 반응 시켰다.PBS로 충분히 세척하고 슬라이드 글라스 위에 mount한 후, 매니큐어로 밀봉하고 형광현미경 (OlympusFluoview,IX2-I11100)으로 관찰하 였다.
L L
L...TTTiiimmmeee---lllaaapppssseeeaaannnaaalllyyysssiiisss
DTB release후 6시간,7시간째에 caffeine과 HGF를 처리하였다.HGF 처리 직후부터 confocalmicroscope(CarlZeiss,LSM-510)로 5분 간격으로 12시간 동 안 촬영하였다.
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ.
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결
결 과
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A A A...HHHGGGFFF에에에 의의의한한한 GGG222ddedeelllayaayy현현현상상상 세포성장인자는 세포주기 중 G0에서 G1으로 넘어갈 때 필요한 것으로 알려 져 있다.하지만 성장인자가 휴지기 외에 다른 세포주기에서도 어떠한 영향을 줄 가능성을 탐색한 결과,실제로 G2phase에 있는 HeLacell에 간세포 성장인자를 처리할 경우 G2에서 mitosis로 넘어가는 것을 일시적으로 지연시키는 결과를 얻 을 수 있었다(Fig.1A,B).실험을 더욱 진행하면서 이러한 성장인자에 의한 지 연 현상이 ERK/RSK pathway를 통해 일어난다는 것을 알게 되었다(Fig.1C).B B
B...GGG222///MMM 진진행진행행 중중중 cccaaaffffffeeeiininneee에에에 의의의해해해 증증증가가가된된된 HHHGGGFFF 지지지연연연현현현상상상
이러한 지연현상이 G2checkpoint로 잘 알려져 있는 ATM/ATR pathway와 관련이 있지 않을까라는 가정 하에 ATM/ATR kinase 억제제 또는 G2 checkpoint억제제로 알려져 있는 caffeine을 사용하였고,그 결과 성장인자에 의 한 지연현상은 ATM/ATR pathway와는 무관하다는 것을 알게 되었다(datanot shown).오히려 caffeine을 처리할 경우 성장인자에 의한 지연현상이 더욱 심화 되는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 2). DTB를 이용해 HeLa cell을 synchronization 시키고 release후 6시간째에 caffeine5mM을 처리했고,7시간째 에는 HGF를 처리하였다(Fig.2A).6시간째부터 16시간째까지 cell에 trypsin을 처리해서 떼어낸 후,PBS와 aceto-orcein을 1:1로 섞어 cell을 염색 했다.염색 된 세포를 광학 현미경을 이용해서 mitoticcell의 수를 counting해 보았고(Fig. 2B),또한 FACS analysis를 이용하여 세포주기 과정을 보았다(Fig.2C).이 실험 모델에서 우리가 사용하는 농도의 caffeine이 irradiation에 의한 G2checkpoint를 약화시킴을 확인할 수 있었다(Fig.2B 왼쪽그림).이때 caffeine을 처리하면 전반 적으로 mitotic cell의 수가 늘어나는 현상을 관찰할 수 있었지만,caffeine에 HGF를 같이 처리할 경우에는 오히려 HGF 단독 처리한 것보다 더욱 큰 지연현 상이 일어나는 것을 관찰 할 수 있었다.
G2/M 진행시 caffeine과 HGF에 의해서 일어나는 지연 현상을 다른 각도에서 확인하기 위해 cdkkinase의 activity를 관찰 하였다.Cell을 harvest한 후 cyclin B antibody로 IP를 하고,histoneH1을 substrate로 cdk1의 kinase활성도를 알 아보았다.Cdk1activity 또한 caffeine과 HGF를 같이 처리한 경우 지연 현상이 일어나는 것을 볼 수 있었고(Fig.3A),Cdk1activity와 관련 있는 cdk1pY15의 탈 인산화도 늦게 일어나는 것을 보았다.그 외에도 cyclin B나 cyclin A의 degradation도 caffeine에 HGF를 처리했을 경우 더욱 늦게 일어나는 것으로 보 아 G2에서 mitosis로 넘어가는 것이 지연되었음을 확인 할 수 있었다(Fig.3B). 한편,mitosis로 넘어갈 때 일어나는 중요한 현상 중의 하나가 cdk1/cyclinB의 위치 변화인데,cdk1/cyclinB의 경우 세포질에서 활성화 된 다음 핵으로 들어가 mitosis를 시작시키는 역할을 한다.Cell을 harvest한 후 cyclinB antibody를 이 용하여 immunocytochemistry를 시행한 결과, caffeine과 HGF에 의해서 cdk1/cyclin B가 핵 내에 위치하는 것이 늦어지는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4).
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C...AAATTTMMM///AAATTTRRR 관관관련련련성성성 확확확인인인
Caffeine은 일반적으로 세포주기에서 ATM/ATR 억제제, 그리고 G2 checkpointresponse억제제로 많이 이용되어 온 약물이다.HGF에 의한 G2지연 현상을 조장하는 caffeine의 활성이 caffeine이 ATM/ATR kinase를 억제하기 때 문인지 확인하기 위해 ATM/ATR siRNA를 이용하여 결과를 비교해 보았다. siRNA 처리 후 36시간이 지난 다음에 ATM/ATR 단백질이 감소되는 결과를 봤 기 때문에,실제로 DTB 과정 동안 36시간을 얻기 위해 2번째 thymidine시간 을 24시간까지 늘렸다.늘린 실험 결과와 이전 결과와 비교했을 때 세포주기의 과정에는 영향을 주지 않았다(datanotshown).두 번째 release후 6시간,7시간 째에 caffeine과 HGF를 각각 처리했으며 결과에 표시 된 시간대에서 cell을 harvest했다(Fig.5A).Mitoticindex를 본 결과,ATM/ATR이 knock-down된 상 황에서 HGF를 처리해도 HGF 단독에 의한 지연 현상만 나타났고,ATM/ATR이
knock-down된 cell에 caffeine과 HGF를 처리 할 경우 역시 caffeine과 HGF에 의한 지연 현상의 강화가 나타났다(Fig. 5B). 두 결과로 봐서 ATM/ATR pathway는 caffeine과 HGF에 의해 증가된 지연 현상과는 관련이 없음을 알 수 있었다.
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D...GGG222///MMM 진진진행행행에에에 영영영향향향을을을 주주주는는는 pppaaattthhhwwwaaayyy들들들의의의 관관관련련련성성성 확확확인인인
이전에 발표된 논문에 의하면,G2 checkpoint에 영향을 주는 pathway로는 ATM/ATR pathway외에 JNK/SAPK,P38,PI3kinase,ERK1/2pathway가 있 는 것으로 알려져 있어,caffeine과 HGF에 의해 증가된 지연 현상이 위의 4가지 pathway와 연관성이 있는지 알아보기 위해 inhibitorstudy를 이행하였다.
우선 첫 번째로 JNK/SAPK는 외부로부터 stress를 받았을 때에 활성화되는 단백질로서,이 단백질이 활성화되면 CDC25C가 억제되어 G2에서 mitosis로 넘어 가지 못하게 된다.JNK/SAPK가 실제로 caffeine과 HGF에 의한 지연 현상을 매개하는지 알아보기 위해 JNK 억제제인 SP600125를 사용해서 mitoticindex의 변화를 관찰하였다.DTB release후 6시간째에 SP600125와 caffeine을 처리하고, 7시간째에 HGF를 처리하였다.이후 표시된 시간대별로 harvest해서 mitotic index와 세포주기과정을 보았다.그 결과 JNK/SAPK 억제제인 SP600125를 처리 해도 caffeine과 HGF에 의한 지연현상이 회복되지 않은 결과를 얻을 수 있어, JNK/SAPK pathway가 연관성이 없다는 것을 알 수 있었다(Fig.6).
두 번째로 P38은 cell이 UV에 의해 손상을 받았을 때 활성화되는 단백질로 서,이 단백질이 활성화되면 CDC25B가 억제되고,그 결과 G2checkpoint가 활성 화되어서 G2지연현상이 일어나게 된다.실제로 caffeine과 HGF에 의한 G2지연 현상이 P38 pathway 활성화에 의한 것인지 알아보기 위해, P38 억제제인 SB203580을 사용하였다.DTB release후 5시간째에 억제제와 caffeine을 처리했 고,7시간째에는 HGF를 처리하였다.Mitotic index와 세포주기과정을 본 결과, 억제제에 의해 caffeine과 HGF에 의한 G2delay현상이 일부분 극복되는 것을 확 인 할 수 있었다(Fig.7).
세 번째로 PI3kinase는 growth factor에 의해 활성화되는 단백질로서,cell 의 survival에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.최근에 발표된 논문에 의하면 세포주기 과정 중 G2에서 mitosis로 전환될 때,PI3kinase가 부분적으로 활성화되는 것으로 발표되었다 (Surabhi등,2003).그래서 실제적으로 caffeine과 HGF에 의한 지연현상이 PI3 kinase에 연관성이 있는지 알아보기 위해 PI3 kinase억제제로 알려진 LY294002를 이용해서 실험하였다.그 결과 LY294002를 처리한 cell에 caffeine과 HGF를 처리했더니 더욱 심하게 지연되는 현상이 관찰 되었고(Fig.8A),LY294002처리한 cell에 HGF만 처리한 결과는 HGF단독 처리 보다 더욱 지연현상이 일어나는 것을 볼 수 있었다(Fig.8B).이 결과들을 볼 때 caffeine이 LY294002와 유사한 특성이 있지 않을까 추측할 수 있었다.
마지막으로 ERK1/2pathway의 연관성인데,ERK1/2는 PI3kinase와 유사 하게 성장인자에 의해 활성화되고,이것 또한 cell의 survival에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.ERK1/2는 세포주기 과정 중 G2에서 mitosis로 넘어갈 때 cyclinB의 특정위치를 인산화 시켜,cyclinB가 핵 내에 위치하게 함 으로 mitosis를 시작하게 하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.실제로 Xenopussystem에서 p42MAPK가 활성화되면 RSK가 인산화 되고 그 결과 G2 arrest가 일어나는 것으로 알려져 있는데,이러한 과정이 humancell인 HeLacell 에서도 나타나는지 알아보기 위해 ERK1/2pathway억제제인 U0126을 이용하여 실험을 하였다.그 결과 caffeine과 HGF에 의해 일어난 G2지연현상이 U0126을 처리했을 때 대부분이 회복되는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig.9A,B).이 실험결 과는 우리 그룹에서 관찰한 바 HGF 단독에 의해 일어나는 G2 지연현상이 ERK1/2 pathway의 신호가 줄어들면 원래상태로 회복되는 것(data notshown, Fig.1참조)과 같은 맥락의 결과이다.결국 caffeine에 의해 증가된 지연 현상도 ERK1/2pathway를 통해 나타난다는 것을 알 수 있었다. E E E...CCCaaaffffffeeieiinnneee,,,HHHGGGFFF 처처처리리리 시시시 JJJNNNKKK///SSSAAAPPPKKK,,,PPP333888,,,AAAKKKTTT,,,EEERRRKKK111///222pppaaattthhhwwwaaayyy에에에 주 주 주는는는 영영영향향향 확확확인인인
DTB release후 6시간째에 caffeine을 처리하고,7시간째에 HGF를 처리했다. 그 후 각각의 시간대에 harvest를 해서 pJNK,pP38,pAKT,pERK1/2에 대한 항 체를 이용하여 westernblotting을 시행하였다.HGF를 처리 시 JNK와 P38의 인 산화는 볼 수 없었다(Fig.10A,B).이는 두 pathway의 저해제를 처리하였을 때 앞의 결과와 일맥상통 한다.하지만 JNK와 P38의 다른 점은 P38의 경우 저해제 에 의해 지연현상이 일부 회복되는 것을 볼 수 있는 반면에 JNK의 경우는 지연 현상이 회복되는 것을 볼 수 없었다.한편 AKT(Fig.10)와 ERK1/2(Fig.11)는 HGF에 의해 인산화 되는 것을 볼 수 있었다.Caffeine단독으로는 어느 것도 인 산화 시킬 수 없었고,caffeine과 HGF를 같이 처리 시에는 pAKT의 인산화가 감 소되는 것을 볼 수 있었다.아마도 caffeine이 PI3K family 억제제이기 때문에 pAKT가 탈 인산화 되는 것이 아닌 가 생각되며,pERK1/2의 경우에는 오히려 caffeine에 의해 인산화가 더욱 증가되는 것을 볼 수가 있었다.그리고 U0126을 처리해서 G2지연현상이 사라졌을 때 ERK의 인산화 또한 감소되는 것을 확인 할 수가 있었다(Fig.9C).
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F...MMMiiitttooosssiiisss진진진행행행에에에 cccaaaffffffeeeiiinnneee과과과 HHHGGFGFF가가가 미미미치치치는는는 영영영향향향
HeLa cell을 DTB 로 synchronization 시키고 release 후 6시간,7시간째 caffeine과 HGF를 각각 처리했다.이후 12시간동안 5분 간격으로 사진을 찍어 time-lapseimage를 얻었다.사진을 이용하여 cell들이 둥근 모양을 이루기 시작 할 때부터 두개로 분리되고,다시 dish바닥에 붙을 때까지의 시간을 측정한 후 각 sample을 비교하였다.일반적으로 cell이 mitosis로 들어갈 때에는 둥근 모양 을 이루고,다시 mitosis를 지나 G1단계로 넘어갈 때는 바닥에 다시 붙기 때문 에 이 두 단계의 시간을 측정하여 caffeine과 HGF가 mitosis의 진행시간에 어떤 영향을 주는지 알아보았다.HGF는 mitosis의 진행에는 영향이 없었으며(data notshown)한편,HGF와 caffeine을 동시처리 시와 caffeine단독처리 시 같은 양상을 보아 mitosis진행과 관련 caffeine의 단독 효과가 주로 나타남을 보여주 고 있다.(Fig.13).
A AA B BB C CC F F Fiiiggg...111...HHHGGGFFF iiinnnddduucucceeesss GGG222 dddeeelllaaayyy ttthhhrrrooouuuggghhh EERERRKKK///RRRSSSKKK ppapaattthhhwwwaaayyy iiinnn HHHeeeLLLaaa c c
ceeellllllsss...Afterdoublethymidineblock release,cellswereharvested atindicated timepointsandsubjectedto(A)FACS analysisand(B)mitoticcellcounting using aceto-orcein staining.(C)is the cartoon showing the pathway ofG2 delayinducedbyHGF.
A AA B BB C CC F F Fiiiggg...222..H.HHGGGFFF---iiinndndduuuccceeeddd GGG222 DDDeeelllayaayy iiisss aaauuguggmmmeeennnttteeeddd bbbyyy cccaaafffffefeeiiinnneee...(A) After doublethymidineblock release,IR(10Gy),caffeine and HGF weretreated at 5h,6hand7h,respectively.Cellswereharvestedattheindicatedtimepoints and subjected to (B)mitotic cellcounting using aceto-orcein staining cells, and (C)FACS analysis.LeftpannelofB showsthecaffeineeffecton DNA damagecheckpointactivity.(CA:caffeine,IR:irradiation)
A AA B BB F F Fiiiggg...333...GGG222DDDeeelllaaayy iyiinnnddduuuccceeedddbbbyyy HHHGGGFFF aaanndnddcccaaaffffffeeeiiinnneeewwwaaasssaaaccccccooommmpppaaannniieieedddbbbyyy ttthhheee d d deeelllaaayyy oooffftththheeeccchhhaaannngggeeoeoofffrrreeelllaaatteteeddd ccceeellllllcccyycyccllleeerrreeeggguulullaaatttooorrrsssaaannnddd CCCdddkkk111 aaaccctttiiivvviiitttyyy... Caffeine and/or HGF was treated in HeLa cells at6h or 7hr after DTB release,respectively.(A)Celllysateswereimmunoprecipitatedwithanti-cyclin B1 antibody and the precipitates were assayed for kinase activity using histone H1 as substrates.(B)Same lysates were subjected to western blot analysis using anti-phospho tyrosine cdk1,cyclin B1,cyclin A and tubulin antibody.(CA:caffeine)
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Fiiiggg...444...CCCyyycccllliiinnn BBB111 nnnuuucccllleeeaaarrr tttrrraaannnssslllocooccaaatttiiiooonnn wwwaaasss dddeeelllaaayyyeeeddd bbbyyy cccaaaffffffeeeiiinnneee iiinnn H
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HGGGFFF---tttrrreeeaaattteeeddd HHHeeLeLLaaa ccceeellllllsss...Afterdouble thymidine block release,cells were harvested atindicated timepointsand subjected toimmunocytochemistry for cyclin B1.Nuclearlocalization ofcyclin B1wasobservedandcounted.DAPI wasusedfornuclearstaining.(CA:caffeine)
A AA B BB F F Fiiiggg...555...AATATTMMM///AAATTTRRR kkikiinnnaaassseeesss wwweeerrreee nnnoootttiininnvvvooolllvvveeedd idiinnn GGG222 dddeeelllaaayyy iiinnnddduuuccceeeddd bbbyyy H H
HGGGFFF aaanndndd cccaaafffffefeeiiinnnee.e..Afterfirstdouble thymidine block release,ATM/ATR siRNA (A-)weretransfected and aftersecond release,cellswereharvested at indicated time points.(A) The specificity of ATM/ATR siRNA was checked by western blotting.(B) Cells were harvested and subjected to mitotic cell counting using aceto-orcein staining. (CA: caffeine, A-: ATM/ATR-,H:HGF)
A AA B BB F F Fiiiggg...666...JJNJNNKKK///SSSAAAPPPKK pK ppaaattthhhwwwaaayyy wwwaaasss nnnoootttiiinnnvvvooolllvvveeeddd iiinnn GGG222 dddeeelllaaayyy iiinnnddduuuccceeeddd bbbyyy H H
HGGGFFF aaanndndd cccaaaffffffeeeiiinnneee...AfterDTB release,SP600125inhibitorandcaffeinewere treatedat6handfollowedbyHGF at7h.Atindicatedtimepoints,cellswere harvestedandsubjectedtoFACS analysis(A)andmitoticcellcounting using aceto-orceinstaining(B).(CA:caffeine,SP :SP600125)
A AA B BB F F Fiiiggg...777...PPP333888pppaaattthhhwwwaaayyy wwwaaasssnnnoootttiiinnnvvvooolllvveveedddiiinnnGGG222ddedeelllaaayyy iiindnndduuuccceeedddbbbyyy HHHGGGFFF aaannnddd c c
caaaffffffeeeiiinnneee...AfterDTB release,SB203580inhibitorandcaffeineweretreatedat 6handfollowedbyHGF at7h.Atindicatedtimepoints,cellswereharvested and subjected to FACS analysis(A) and mitotic cell counting using aceto-orceinstaining(B).(CA:caffeine,SB:SB203580)
A AA B BB F F Fiiiggg...888...LLYLYY222999444000000222tttrrreeeaaatttmmmeenenntttaaauuugggmmmeenennttteeedddttthhheeeHHHGGGFFF---iiinnndduducucceeedddGGG222deddeelllaaayyy...After DTB release,LY294002inhibitorandcaffeineweretreatedat6handfollowed by HGF at7h.Atindicated timepoints,cellswereharvested and subjected tomitoticcellcounting using aceto-orcein staining.Only LY294002treatment resultshowedin(B).(CA:caffeine,LY:LY294002,H:HGF)
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bllloooccckkkiiinnnggg ooofff EEErrrkkk pppaaattthhhwwwaaayyy... U0126,an MEK inhibitor was treated with caffeine followed by HGF.Cells were harvested and subjected to FACS analysis (A), mitotic cell counting using aceto-orcein staining (B), and westernblotting(C).(CA:caffeine,H:HGF,U:U0126)
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onnn bbbooottthh sh ssyyynnnccchhhrrrooonnniiizzzeeeddd aaannnddd aasassyyynnnccchhhrrrooonnniiizezzeeddd ccceeellllllsss...After double thymidine block release,cells were treated with caffeine and HGF at 6h and 7h, respectively and harvested at indicated time points.Harvested cells were subjectedtowesternblotanalysisusinganti-phosphoErk,totalErkantibody. FoldchangeinErkphosphorylationwascalculatedfrom densitometiccounting ofeach band.In asynchronized cells,from one day aftercellseeding,cells were serum starved for 24hr followed by HGF treatment. Cells were harvestedatindicatedtimepointsandsubjectedtowesternblotanalysis.
F F Fiiiggg...111222...MMMooodddeeelll...CCCaaaffffffeeeiiinnneeeaaauuugggmmmeeennnttteededd ttthhheeeGGG222DDeDeelllaaayyy iiindnndduuuccceeeddd bbbyyy HHHGGGFFF vvviiiaaa E E ERRRKKK111///222pppaaattthhhwwwaaayyy...
F F
Fiiiggg...11133.3..CCCaaaffffffeeieiinnneee cccooouuulllddd dddeeelllaaayyy ttthhhee memmiiitttooosssiiisss ddduuurrraaatttiiiooonnn...AfterDTB release, caffeineand HGF weretreated at6h and 7h,respectively,and subjected to time-lapse analysis.We measured the duration foreach cellfrom the time pointatwhich the cellshowed round shape to the time pointatwhich it regainedflatshape.(CA:caffeine)
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ.
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고
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Caffeine은 methyxanthine으로서 nucleotide의 purine과 유사한 구조를 가지 고 있다. 일상생활에서 매우 쉽게 접할 수 있는 약물로서 커피나 차와 같은 기 호 식품에 많은 양이 첨가되어 있다.Caffeine에 대해 많은 실험이 진행되어 왔 는데 caffeine은 anti-carcinogenicagent로서 알려져 있고,cell에 처리할 경우에 는 apoptosis를 일으킬 수 있는 것으로도 알려져 있다.실제로 UV로 의해 피부 암이 생긴 쥐에 caffeine을 처리할 경우 암이 감소되는 현상도 이미 발표된 바 있다(Lu등,2002).이외에 caffeine은 세포주기의 G2checkpoint를 억제하는 것으 로도 알려져 있는데,DNA damage를 입은 cell에 caffeine을 처리할 경우 G2 checkpoint가 억제됨으로 인해 damage를 고치지 못하고 mitosis단계로 넘어가는 현상이 나타난다.(Jann등,1999;David,2003;Takashi등,2004).
이전에 우리 그룹은 세포성장인자중의 하나인 간세포성장인자가 G2/M 진행 시 지연현상을 일으키는데(unpublished data),지연현상이 DNA damage와 관련 이 있는지 알아보기 위해 caffeine을 처리하는 실험을 하였다.놀랍게도 이 실험 에서 G2checkpoint를 억제하는 caffeine이 오히려 간세포 성장인자와 같이 처리 했을 때 G2지연현상을 더욱 강화시키는 결과를 얻을 수가 있었다.Caffeine에 의해 G2지연현상이 더욱 증가되었는데,그 원인이 무엇인지 알아보기 위해서 G2 checkpoint와 관련이 있는 여러 가지 pathway를 알아보았다.Pathway로는 우선 G2 checkpoint에 가장 주요하게 작용하는 것으로 알려져 있는 ATM/ATR pathway(Jacob등,2005)와 그 밖에 P38(Dmitry등,2001),JNK/SAPK(Valerie등, 2003),PI3kinase(Surabhi등,2003;Kazuhiro등,2005),ERK1/2pathway(Derek 등,1999;Xiaoqui등,2004)를 확인해 보았다.ATM/ATR pathway는 siRNA를 이용하여 ATM/ATR kinase를 knock-down시키고 HGF를 처리했을 때 mitotic index의 변화를 확인해 본 결과 ATM/ATR pathway는 관련이 없다는 결론을 얻을 수 있었다(Fig.5).그리고 UV에 의해 활성화되는 것으로 알려진 P38이 관 련되어 있는지 알아 보기위해 P38억제제인 SB203580을 처리해 보았다.FACS
analysis와 mitoticindex를 본 결과 지연 현상이 조금이나마 회복되는 것을 볼 수 있었다.하지만 실제로 western blotting을 통해 P38이 G2단계에서 인산화 되는지 보았지만 caffeine이나 HGF를 처리한 상태,심지어 control상태에서도 P38은 인산화 되어 있지 않았다(Fig.7,10A).이 실험을 통해 P38억제제가 아 마도 다른 부위에 영향을 주어 나온 결과에 의한 것으로 추정하게 되었다.그 다 음으로 외부 스트레스에 의해 활성화되는 단백질인 JNK/SAPK가 관련 있는지 알아보기 위하여 억제제인 SP600125를 이용하였다.JNK/SAPK의 경우도 역시 억제제를 사용하여 결과를 보았을 때 G2 지연현상을 볼 수 없었고, 또한 western blotting의 결과를 보았을 때에도 G2단계에서 인산화 되는 것을 볼 수 없었기 때문에 JNK/SAPK pathway도 관련이 없다는 결론을 내리게 되었다(Fig. 6,10B 우측 그림)
다음으로 확인한 것은 실제적으로 성장인자에 의해 가장 큰 영향을 받는 PI3 kinase와 ERK1/2 pathway인데,이 두 pathway는 이전에 설명한 세 개의 pathway와는 다르게 G2/M 진행에 영향을 준다.ATM/ATR,P38,JNK/SAPK pathway의 경우는 인산화 되고,활성화되면 G2checkpoint를 활성화시키는 반면 에 PI3kinase와 ERK1/2pathway는 어느 정도 인산화가 되어 있어야만 G2에서 mitosis로 넘어갈 수 있다.PI3 kinase의 경우 LY294002 억제제를 사용 시 caffeine과 HGF에 의한 지연현상이 회복되지 않는 것을 보았다. 하지만 LY294002를 caffeine과 HGF를 처리한 cell에 처리할 경우 오히려 지연현상이 더 욱 증가되는 결과를 얻을 수 있었고,또한 LY294002와 HGF를 처리 시에는 caffeine과 HGF를 처리한 실험 결과와 유사한 것을 볼 수 있었다(Fig.8). Caffeine은 ATM/ATR kinase억제제로도 알려져 있는데,ATM/ATR kinase는 PI3kinasefamily에 속한다.그리고 이전 논문에 의하면 caffeine이 PI3kinase를 억제 할 수 있다는 것도 이미 실험된 바 있다(Foukas등,2002).실제로 우리 실 험에서도 caffeine을 처리한 cell에 HGF를 처리 시 PI3 kinase의 substrate인 AKT의 인산화가 억제되는 것을 확인 할 수가 있었다(Fig.10C).이 결과들로 봐 서 PI3kinase가 어느 정도 caffeine과 HGF에 의한 지연현상에 영향을 주지 않
을까라는 가정을 갖게 되었다.ERK1/2의 경우 U0126억제제를 사용하여 mitotic index와 westernblot결과를 보았다.우리 그룹에서 이미 증명한 결과에 의하면 HGF에 의한 지연현상이 ERK pathway와 RSK pathway를 통해서 일어난다는 것을 확인한 바 있다. Caffeine과 HGF에 의한 지연 현상도 역시 유사한 pathway를 통해 일어난다는 것을 알게 되었다. U0126을 처리해서 MAPK pathway를 억제할 경우 G2 지연현상이 사라지는 것을 볼 수 있었고(Fig.9), western blot을 통해 caffeine과 HGF 처리한 결과와 HGF 단독 처리한 결과를 비교해 봤을 때,ERK1/2의 인산화가 caffeine에 의해서 증가된다는 것을 알 수 있었다(Fig.11).하지만 ERK1/2의 downstream에 있던 RSK의 경우 caffeine에 의해 증가되는 것은 보지 못했다(Fig.10B 좌측 그림).
위의 여러 가지 pathway를 확인해 본 결과,한 가지 가설을 세울 수 있었 다.Caffeine은 PI3kinase억제제로서도 역할을 할 수가 있다.HGF를 처리할 경 우 ERK/RSK pathway를 활성화시켜서 결국 G2/M 진행을 지연시킨다.PI3 kinase가 억제되면 ERK의 인산화가 더욱 증가되었기 때문에,PI3 kinase가 ERK1/2를 평소 억제하고 있다는 것을 가정할 수 있었다.이러한 결과들을 종합 했을 때 caffeine을 처리한 세포에 HGF를 처리할 경우 ERK를 억제하고 있던 PI3kinase가 억제 되고,그 결과 ERK1/2의 인산화가 더욱 증가되면서 G2/M 지 연 현상을 더욱 증가시킨다는 가설을 내릴 수 있었다(Fig.12).하지만 실제적으 로 PI3kinase와 ERK1/2간 에 직접적인 관련성이 있는 지는 좀 더 실험을 해봐 야 할 부분으로 남아있다.
Caffeine과 HGF를 처리했을 시 G2phase외에 다른 phase인 mitosis에는 어떤 영향을 주는지 실험을 하였다. Time-lapse analysis를 통해 본 결과, caffeine자체가 mitosis과정을 지연시키는 것을 알 수 있었다(Fig.13).Caffeine이 처리될 경우 처리 안 된 것과 비교했을 때 약 20분에서 30분정도 mitosis과정에 걸리는 시간이 길어지는 것을 볼 수 있었다.이전에 발표된 논문에 의하면 mitosis의 metaphase에서 anaphase로 넘어갈 때 일어나는 중요한 과정 중의 하 나가 securin이란 단백질의 분해이다.Caffeine을 처리할 경우 이 securin이 과
발현 된다는 보고가 있었는데(Francisco등,2004),실제로 우리 실험에서도 그런 지 알아보기 위해 securin의 발현정도를 보았다.하지만 caffeine과 HGF를 처리 할 경우 securin의 양이 증가되는 것은 볼 수 없었고,단지 G2phase에서 나타난 지연 현상으로 인해 securin의 분해가 지연되는 결과만 얻을 수 있었다(datanot shown).
실험 결과들을 통해 caffeine과 HGF를 처리하면 G2 지연현상이 ERK1/2 pathway를 통해 나타나는 것을 알 수 있었고,이러한 지연 현상이 생리적으로 어떤 의미를 나타낼지는 앞으로 더욱 연구해야 할 과제로 남아있다.
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론
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Caffeine은 세포주기의 G2checkpoint를 억제하는 약물로 알려져 있지만,간 세포 성장인자와 같이 처리할 경우 오히려 성장인자에 의해 일어나는 지연현상 을 더욱 증가시켰다.Caffeine과 HGF를 처리할 경우 G2에서 mitosis로 넘어갈 때 중요한 cdk1activity나 cyclinB의 핵 내 위치하는 조건들이 모두 지연 되는 것을 확인할 수 있었고,이외에도 cyclin A,B의 분해또한 caffeine에 의해 더욱 지연되는 것이 길어짐을 확인할 수 있었다.이러한 증가된 지연현상이 나타나는 것은 살펴본 pathway중 ERK1/2pathway가 관련되어 있다는 것을 확인하였고, 실제로 caffeine을 처리하면 HGF에 의한 ERK1/2의 인산화가 더욱 증가된 결과 를 볼 수 있었는데,이는 caffeine이 갖고 있는 PI3kinase활성억제 기능과 관련 이 있을 것으로 추정된다.G2 phase에서 일어나는 지연현상이 실제적으로 in vivo상태에서는 어떤 영향을 주는지는 앞으로 알아 봐야 할 과제로 남아있다.
참
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참고
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MinWooLeeDepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity (supervisedbyAssociateProfessorJae-HoLee)
Inthepresentstudy,weexploredtheroleofcaffeineinG2delay induced byHGF.Previously,wehaveshownthatHGF inducedtransientG2delayvia ERK pathway. To address the involvement of ATM/ATR kinases in HGF-induced G2 delay, caffeine was used as an inhibitor. Interestingly, caffeinecouldn'tinhibittheHGF-inducedG2delay butratheraugmentedthe HGF-induced delay while caffeine itselfdid notaffectthe duration ofG2 phase significantly.Same observation was obtained by FACS analysis and mitotic index study.Increased G2 delay by caffeine was also accompanied withthedelayincdk1activationandincyclinB nuclearlocalization.Western blotanalysisalsoshoweddelayeddegradationofcyclinA andB.ATM/ATR knock-down cellsdid notshow theaugmentation ofHGF-induced G2delay, stronglysuggestingthatinhibitoryactivityofcaffeineonATM/ATR pathway was notrelated with increased G2delay.Inhibitorstudy revealed thatERK pathwaybutnotp38MAPK,JNK,PI3K pathways,wasinvolvedinincreased G2delay.Westernblotanalysisrevealedcorroborating datawiththeinhibitor
study. In caffeine and HGF co-treated cells, only ERK was more phosphorylatedthaninHGF treatedcells.Inaddition,whethercaffeineaffects the duration of mitosis was addressed.Interestingly,caffeine itself could increase the mitosis duration, which was not influenced by HGF. In conclusion,wefoundthatcaffeineaugmentedHGF-inducedG2delay through ERK pathway.
