의학 박사학위 논문
자
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자살
살
살유
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전
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자
자치
치
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아 주 대 학 교 대 학 원
의 학 과
안 영 민
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지 도 교 수 :조 경 기
이 논문을 의학 박사학위 논문으로 제출함.
2007년
2월
아 주 대 학 교 대 학 원
의 학 과
안 영 민
안영민의
안영민의
안영민의
안영민의 의학
의학
의학
의학 박사학위
박사학위
박사학위
박사학위 논문을
논문을
논문을 인준함
논문을
인준함
인준함
인준함
심사위원장
심사위원장
심사위원장
심사위원장
조
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아 주 대 학 교 대 학 원
2006년
12월 22일
-국문요약-자
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자
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치
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악성 신경교종은 성장 속도가 빠르고,주위 정상 뇌 조직 내로 침윤 (invasion)하므로 완전 수술적 절제가 불가능하고,재발성 성향이 높기 때문 에 수술 후 방사선치료나 화학요법 등 기타 치료를 하더라도 일 년 미만의 생존율을 갖는 매우 악성 종양이다. 최근 수술기법의 개발과 고해상도의 진 단기기 및 최첨단 수술기계의 도입 등으로 적극적인 종양제거 수술이 가능 해졌으며, 면역치료 및 유전자치료 등의 보존 요법이 시도되고 있으나 아직 까지는 악성 신경교종 환자의 예후에 큰 영향을 미치지 못하고 있다. 최근에 신경줄기세포가 종양을 추적할 수 있다고 (tropism)보고된 이후 이tropism의 특성을 이용하여 신경줄기세포를 항암치료제의 vector로 이용하 는 연구가 활발히 진행되고 있다.본 연구는 김 등이 개발한 사람 신경줄기 세포인 HB1.F3가 정상조직내로 침투된 악성 신경교종을 추적하는 사실을 확인하기위해 성인 쥐의 대뇌반구에 악성 신경교종을 이식하고 난 뒤 반대 쪽 대뇌반구에 HB1.F3신경세포를 이식해서 F3의 이동 경로를 관찰하였다.자살유전자로 알려진 대장균 사이토신탈아미노효소 (cytosinedeaminase; CD)는 항진균제인 5-fluorocytosine(5-FC)을 5-fluorouracil(5-FU)로 변환 시켜 FUTP,FdUMP,FdUTP 등의 대사산물을 통해 DNA,RNA 대사에 작용함으로써 종양세포 독성을 나타낸다.따라서 본 연구는 상기 CD 유전자 를 HB1.F3신경줄기세포에 이입한 후 사람 악성 신경교아세포종 (U373MG,
U251MG,U87MG)세포를 쥐의 대뇌반구에 이식한 5일 후 동측의 대뇌반구 의 같은 부위에 이식하여 7일 동안 5-FC (10mg/ml)와 대조군으로 PBS를 복강 주사하여 종양세포의 성장을 관찰하였다. 대조군으로 PBS를 주입한 동물모델과 5-FC를 주입한 모델을 비교하여 5-FC를 주입한 쥐에서 뇌종양의 성장이 급격히 저하됨을 확인하였다. 이는 자살유전자가 이입된 세포뿐만 아니라 주위에 있는 세포까지 죽이는 bystander효과로 종양세포 독성을 보였다. 상기 연구 결과를 토대로 임상에 적용함으로써 수술적 제거 후 남아 있 는 신경교종이나 수술로 제거하기 힘든 부위에 위치한 종양의 치료 가능성 이 있음을 보여주었다.
핵심어:cytosinedeaminase,5-Fluorocytosine,Neuralstem cell, 5-Fluorouracil
차
차
차 례
례
례
국문요약 ···ⅰ 차례 ···ⅲ 그림차례 ···ⅴ I.서론 ···1 A.연구의 필요성 ···1 B.연구 목적 ··· 3 Ⅱ.재료 및 방법 ···4 A.세포 배양 ···4 B.MTT 분석 ···4 C.동물 종양 모델 ···5 D.5-FC 약물 치료 모델 ···6E.Hematoxylin& Eosin(H&E)염색 ···6
F.LacZ염색 ···7 III.결과 ···8 A.CD 유전자에 대한 활동성 측정 ···8 B.HB1.F3가 종양부위로 이동하는 특성 확인 ···12 C.종양동물모델에서의 HB1.F3/CD 이식 후 5-FC를 주입하여 tumormass관찰 ···14 IV.고찰 ···17
V.결론 ···21 참고문헌 ···22 ABSTRACT···29
LIST OF FIGURES
Fig.1.Thehumanstem cellHB1.F3/CD celllineconstruction···9 Fig.2.CytotoxiceffectofHB1.F3andHB1.F3/CDinvitr···11 Fig.3.Co-cultureHB1.F3/CD andhumanglioblastomacelllines···13 Fig.4.Migrationandtropism ofneuralstem cell(HB1.F3/lacZ)for
gliomaU373MG···15 Fig.5.Comparisonoftumormasssizeinratmodelswith
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ.
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.서
서
서 론
론
론
A A A...연연연구구구의의의 필필필요요요성성성 사람의 악성 신경교종은 종양이 자라면서 발생 부위로부터 주변 정상 뇌조직 으로 침윤하고 때로는 반대 측 대뇌반구로 멀리 이동하여 종양을 적출하더라도 다시 재발함으로써 치료하는데 어려움을 가지고 있다.최근 고해상도의 진단기 기와 수술 중 뇌파검사,유발전위 검사 및 항법장치 (navigationsystem)등 최 첨단 수술기계의 도입 등으로 적극적인 종양제거 수술이 가능해졌으며, 면역 치료 및 유전자치료 등의 보존 요법이 시도되고 있으나 아직까지는 악성 신경 교종환자의 예후에 큰 영향을 미치지 못하고 있으며 수술 후 평균 생존 기간이 일년을 넘지 못한다. 신경교종 치료에서의 가장 큰 장애는 신경교종의 주변 조직으로의 침윤 (invasion)으로 인하여 종양의 완전 적출이 불가능하며,주변 정상 조직 내로 침윤된 종양세포를 감별하여 치료 할 수 있는 방법이 현재 의학으로서는 없다 는 점이다.아울러 뇌종양이 생겼을 경우 항암제 약물을 혈관을 통하여 투여하 였을 때 뇌에는 혈관-뇌 장벽 (blood-brainbarrier;BBB)이 있어서 뇌 속으로 혈류나 삼투압에 의한 물질 이동이 제한된다는 점이다.그러나 Aboody 등에 의해 신경줄기세포 (neuralstem cell)가 종양이 있는 곳으로 추적 이동한다 (tropism)는 사실을 배경으로 본 연구에서는 신경줄기세포의 종양을 향해 추적 하는 tropism을 이용하여 종양세포만을 선택적으로 죽일 수 있는 자살유전자를 종양 내로 운송하는 vector로 이용하여 악성 신경교종의 치료에 응용하고자 하 였다 (Aboody 등,2000lBourbeau 등,2004;Brown 등,2003;Chung-Faye등,2001). 최근 활발히 시도되고 있는 유전자치료 중 선택적으로 종양세포만을 효율적 으로 죽일 수 있는 연구가 각광을 받고 있다 (Okada등,2004). 본 연구는 소 위 자살 유전자로 불리는 prodrug-converting enzyme유전자를 종양세포 내에 주입한 후 이를 활성화시킴으로써 종양세포를 죽이는 “suicidestrategy"를 악 성 신경교종 치료에 적용하였다 (Kurozumi등,2004;Park등,2002). 저자들이 사용한 자살유전자로는 대장균 사이토신탈아미노효소(cytosi nede-aminase; CD)를 이용하였다. 이 CD유전자는 항진균제인 5-fluorocytosine (5-FC)을 5-fluorouracil(5-FU)변환시켜 FUTP,FdUMP,FdUTP 등의 대사산 물을 통해 DNA, RNA 대사에 작용함으로써 종양세포 독성을 나타낸다 (Adachi등,2000;Barresi등,2003;Fischer 등,2005;Hadaczek 등,2005; Koyama등,2000).
B B B...연연연구구구의의의 목목목적적적 본 연구는 상기 CD 유전자를 F3신경줄기세포에 이입 (transfection)시킨 후 사람 악성 신경교아세포종(U373MG,U251MG,U87MG)세포를 쥐의 대뇌반구 에 이식 후 신경교종을 이식한 곳과 동일 부위에 CD 유전자가 함유된 사람신 경줄기세포 (HB1.F3)를 이식하여 인체에 독성이 없는 5-FC (10mg/ml)를 쥐의 복강 내에 주사하여 종양세포의 성장 억제 현상을 관찰하였다. 이에 본 실험에서는 신경줄기세포가 종양세포를 추적하여 이동하는 것을 증 명하고,이를 토대로 자살유전자 CD가 이입된 HB1.F3를 종양부위에 이식하여 5-FC를 주입하였을 때 동일한 부위에 있는 종양세포뿐만이 아니라 주위에 있 는 종양세포까지 죽여 효과적으로 치료할 수 있는지를 확인해 보고자 하였다 (Ramnaraine,2003).
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방
방법
법
법
A A
A...세세세포포포 배배배양양양
사람 신경교아세포종 (giloblastoma)세포인 U373MG,U251MG,U87MG은 Dlubecco's modified Eagle medium (DMEM,HyClone)과 10% fetalbovine serum(FBS,HyClone),penicillinstreptomycin(GIBCO)100unit/㎖에서 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 배양하였다.배양된 세포는 2～3일에 한번 씩 계대배 양 하였다. HB1.F3는 임신 15주된 태아의 대뇌조직에서 얻은 세포를 myc oncogene이 저장된 retroviralvector를 이용하여 불멸화시킨 신경줄기세포이다.HB1.F3도 신경교아세포종과 같은 조건에서 배양하였고,배양된 세포는 3일에 한번 씩 배 양액을 교체하였으며 7～9일에 한번 씩 계대배양 하였다. B B B...MMMTTTTTT 분분분석석석 MTT 분석법은 살아있는 세포를 관찰하는 실험방법이다. U373MG,U251MG,U87MG 세포를 3x103개수를 96well플레이트에 100㎕ 씩 분주하여 DMEM 배지로 1일 동안 배양하였다.그리고 새 배지를 교체해준 후 5-fluorouracil(5-FU,Sigma chemical,Germany)을 0.2,0.5,1,2,5,10 and 15㎍/㎖로 처리하고 3일을 배양하였다.5-FU를 처리하고 3일째 되는 날 새 배지로 교체해준 후 MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyl te-trazoliumbromide,sigma,5㎎/㎖)용액을 10㎕/well씩 투여하고 4시간 동안 37℃
에서 반응시켰다.보라색 결정을 육안으로 확인한 후 solubilization buffer (10% SDS buffer:DMFsolution,1:1)를 100㎕/well씩 분주하고 37℃ 인큐베이 터에서 16시간 반응시켰다.반응이 끝난 well을 효소면역검사법 (ELISA)플레 이트 리더를 이용하여 570mm에서 630mm로 흡광도를 측정하였다. C C C...동동동물물물 종종종양양양 모모모델델델 배양되어진 사람 신경교아세포종세포를 헤모사이토메터를 이용하여 1x106세 포를 계산하여 마리당 3㎕씩 동물에게 삽입할 준비를 하였다.Sprague-Dawley rat(Sam: Tac(SD) BR, Korea)으로 230~250g 암컷을 마취제(10% choral Hydrate,400㎎/㎏)로 마취하고 stereotaxic frame에 쥐의 머리를 고정하였다. 쥐의 고정된 머리의 피부를 절단하고 Bregma가 잘 보이도록 하였다.Bregma 를 기준으로 Ap(antero-posterior)+0.4,ML(lateralfrom themidline)-3.1되 는 위치를 표시한 다음 드릴로 두개골을 제거하였다.그리고 Hemiltonsyringe 에 세포를 넣은 상태에서 Dv(depth from dura)-4.0좌표를 잡을 후에 0.2㎕ /min의 rate로 세포를 이식하였다.
D D D...555---FFFCCC 약약약물물물 치치치료료료 모모모델델델 1그룹:종양세포만 이식한 모델 2그룹:종양세포를 이식한 후 5일째 되는 날 HB1.F3/CD 이식 하루 뒤 PBS를 매일 7일 동안 복강 주사한 모델 3그룹:종양세포를 이식한 후 5일째 되는 날 HB1.F3/CD 이식 하루 뒤 5-FC를 매일 7일 동안 복강 주사한 모델 동물 종양 모델을 만든 후 5일째 되는 날에 종양세포의 세포 개수와 동일한 개수로 종양세포를 이식한 동일한 부위에 HB1.F3/CD를 1x106세포를 마리당 3 ㎕씩 준비하여 2그룹,3그룹에게 이식하였다.3그룹에게만 신경줄기세포 이식한 다음 날부터 5-FC (F7129, saline에 10㎎/㎖로 녹임, Sigma chemical, Germany)을 매일 7일 동안 500㎎/㎏로 복강 주사하였다. 7일 동안 5-FC를 주 사한 3그룹과 5-FC를 주사하지 않은 1그룹,2그룹을 같은 날에 모두 perfusion 을 하였다.뇌 속의 피를 모두 뺀 후 4% 파라포름 알데하이드에 하루정도 고 정한 뒤 30% sucrose에 넣어서 down 시켰다.동결절편을 만들어서 30㎛로 coronal방향으로 잘라서 gelatin코팅이 된 슬라이드에 붙여서 -20℃에 저장하 였다.
E E
E...HHHeeemmmaaatttoooxxxyyyllliiinnn&&& EEEooosssiiinnn((H(HH&&&EEE)))염염염색색색
Hematoxylin은 핵에 염색이 되고 eosin은 세포질에 염색이 되는 방법이다. 슬라이드에 올린 조직을 상온에서 말린 다음 흐르는 물에 5분정도 두었다. Harris'Hematoxylin (Sigma)에서 1분정도 염색을 한 뒤 다시 흐르는 물에 5
분정도 세정하고,Acid Ethanol(70% 에탄올,HCl0.5%)에 3번 담그는 작업을 하였다.흐르는 물에 10분 세정한 다음 Ammoniated H2O(3차 증류수,5% NH4OH)에 30초 반응시키고,흐르는 물에 2분 세정한 후 Eosin(sigma)에서 20 초간 반응 시켰다.깨끗한 물에 세정한 다음 에탄올 70%,95%,100%에 차례대 로 탈수과정을 거친 후에 비수용성 봉입제로 봉입하였다.
F F
F...LLLaaacccZZZ염염염색색색
이 염색법은 β-galactosidase를 이용하여 LacZ를 염색하는 방법이다.
-20℃에 저장한 슬라이드에 올린 조직을 상온에서 말린 다음 Dakopen으로 조 직의 둘레를 그렸다.PBS(phosphatebufferedsaline)로 5분씩 3차례 세정의 과 정을 하고 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside) 용액 (2mmol/L MgCl2,35mmol/L potassium ferrocyanide, 35mmol/L potassium ferricyanideinPBS)을 37℃에서 16시간 반응시켰다.PBS로 5분씩 3차례 헹굼 을 거친 후에 Eosin에 20초간 염색한 후 물에 세정을 하였다.마지막으로 탈수 와 투명과정을 거친 후 비수용성 봉입제로 봉입하였다.
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ.
.
.결
결
결 과
과
과
A A
A...CCCDDD 유유유전전전자자자에에 대에 대대한한한 활활활동동동성성성 측측측정정정
HB1.F3 cellline에 retrovirus를 이용하여 대장균 cytosinedeaminase(CD) gene을 삽입하여 자살유전자가 삽입된 새로운 줄기세포 cellline을 만들었다 (Fig.1).
in vitro 실험으로 줄기세포 HB1.F3와 HB1.F3/CD cellline을 가지고 각각 5-FC와 5-FU를 처리하였을 때 세포고사를 MTT분석법으로 분석하였다 (Fig. 2).자살유전자가 이입되지 않은 HB1.F3cellline에서 5-FU를 처리한 것은 세 포고사가 일어났고 대조군과 5-FC를 처리한 것은 세포고사가 일어나지 않았 다.자살유전자가 이입된 HB1.F3/CD cellline에서는 대조군에서만 세포고사가 일어나지 않았으며 5-FC와 5-FU를 처리한 것에는 세포의 고사가 일어나는 것 을 볼 수 있었다. Fig.2사진에서 볼 수 있듯이 HB1.F3/CD cellline에서 5-FC를 처리한 것은 세포고사로 인해 살아있는 cell이 없음을 확인할 수 있었다.이것은 자살유전자 가 삽입되지 않은 F3cellline은 5-FC에 예민하게 반응하지 못하여 세포고사 가 일어나지 않았으며,반면에 자살유전가가 이입된 F3/CD cellline에서는 CD gene에 의해 5-FC에 예민하게 반응하여 세포고사가 일어났음을 확인할 수 있 었다. 결과적으로 CD gene에 의해서 5-FC는 5-FU로 바뀌어서 세포고사를 유도하여 줄기세포 자신도 모두 세포고사가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
Fig.2.CytotoxiceffectofF3andF3/CD invitro.
Thehuman stem cellHB1F3andHB1F3/CD wasassessedcelldeath by convertedtoxicfrom 5-FC.Transducedcellsdecreasedafter5-FC treatment (B,G),butnotdecreased after 5-FC treatment(A,D).Both transduced F3/CD cells (E) and nontransduced F3/CD cells (F) died after 5-FU treatment.
B B B...HHHBBB111...FFF333가가가 종종종양양양부부부위위위로로로 이이이동동동하하하는는는 특특특성성성 확확확인인인 in vivo 실험으로 사람에게서 유래된 신경교종세포를 이식하여 종양모델을 만든 후에 반대쪽 뇌에 신경줄기세포인 HB1.F3/LacZ를 이식하여 이동하는 것 을 LacZ염색실험방법으로 이동되는 신경줄기세포의 이동을 관찰하였다. 먼저 동물모델에 종양세포(U373MG)를 이식한 후 같은 부위에 이식된 것을 확 인한 후 종양의 크기가 일정하게 자라는 것을 확인하였다.그 결과 동물모델에 종양세포를 이식한 후 5일이 지난 것을 종양동물모델로 사용하였다. 종양동물모델에 신경줄기세포 HB1.F3/LacZ를 종양을 이식한 반대쪽에 이식하 여 종양세포를 추적하는 것을 실험한 결과,HB1.F3/LacZ가 corpuscallosum을 따라서 이동하여 종양부위에 LacZ 발현이 되는 것은 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).하지만,종양이 없는 동물모델에서 HB1.F3/lacZ를 이식하여 보았을 때는 그 대로 이식한 자리에 머물러 있음을 확인할 수 있었다 (Fig.3).
결과적으로 종양동물모델에서도 신경줄기세포인 HB1.F3/lacZ는 종양세포를 인 식하여 이동할 수 있는 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
Fig.3.Co-cultureHB1.F3/CD andhuman glioblastomacelllines.5-FU has strong cytotoxic effect against malignant human glioblastoma cells(U251, U87andU373).
C C C... 종종종양양양동동물동물물모모모델델델에에에서서의서의의 HHHBBB111...FFF333///CCDCDD 이이이식식식 후후 5후 55---FFFCCC를를 주를 주주입입입하하하여여여 tttuuummmooorrr m m maaassssss관관관찰찰찰 종양모델에 HB1.F3/CD를 동일한 부위에 이식하고 다음날 5-FC를 7일동안 복강주사 하였을 때 tumormass가 줄었는지 관찰하였다. 그룹별로 실험을 한 뒤 13일째 세 그룹의 동물모델을 죽인 뒤 조직을 H&E 염 색방법으로 tumormass를 비교해 보았다 (Fig.4)a는 1그룹이고 b는 PBS를 주입한 종양모델 1그룹이고,c,d,e는 3그룹이다.결과는 그림에서도 비교가 되 듯이 1그룹과 2그룹의 tumormass크기는 한쪽 뇌를 종양이 차지하고 있지만 3그룹은 종양이 1그룹을 tumor mass를 100%로 보았을 때 3그룹은 tumor mass가 33%밖에 자라지 않았다 (Fig.5).
결과적으로 종양부위에 신경줄기세포가 CD gene에 의해 5-FC가 5-FU로 변 환하여 종양세포를 세포고사 유도를 했다고 관찰되어진다.
Fig 4.Migration and tropism of neural stem cell(F3/LacZ) for glioma U373MG.Three days after U373 transplantation,F3/LacZ implanted into contralateralhemispheretothetumorimplantationsiteandsacrificedonday 4.Tumor tissue sections were stained for 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β -D-galactoside(X-gal)andeosin.HB1.F3,theneuralstem cellscouldtrace throughthecorpuscallosum tothetumorcellinthecontralateralbrain.
Fig.5.Comparison totumormasssizein ratmodelswith 5-FC treatment. AfterU373(1x106cells/ml)transplantation,F3/CD orF3(1x106cells/ml),the humanneuralstem cellweretransplantedatthesamehemisphereonday6 andinjected5-FC (500mg/kg)dailyfor7days.Thesebrainsweretaken14 daysaftertumortransplantation.A,B:control(n=6)C,D,E:5-FC treat-ment(n=9).Thetumormasswith F3/CD transplantation wasreduced 30% inthesizecomparingtoF3transplantation.
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ.
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.고
고
고 찰
찰
찰
본 연구는 자살유전자가 이입된 사람줄기세포를 종양동물모델에 이식하고 약 물을 주입해줌으로서 종양의 크기를 비교 관찰하는 것이다.
실험에 사용된 자살유전자가 이입되는 사람줄기세포(F3)는 임신 15주된 태아 의 대뇌조직에서 얻은 세포를 myconcogene이 저장된 retroviralvector를 이 용하여 불멸화시킨 신경줄기세포로서 스스로 분화할 수 있는 자가분화가 가능 하다 (Kim,2004).최근 연구로는 사람 뇌에 이식된 신경줄기세포는 이식 후에 도 스스로를 분화할 수 있다는 보고와 함께 종양을 인식하여 추적할 수 있다고 한다 (Staflin등,2004).
신경줄기세포가 종양을 추적하여 이동한다고 밝혀졌다.종양세포가 증식할 때 분비되는 epidermalgrowth factor(EGF)에 신경줄기세포가 반응하여 이동 한다는 연구결과도 발표되었고,줄기세포에는 CXCR4라는 chemokine수용체가 존재하는데 종양세포에서 분비되는 stromal-derivedfactor1α (SDF-1α)에 접 착함으로써 신경줄기세포가 뇌종양세포를 추적할 수 있다는 연구도 발표되었다 (Zhou 등,2002).최근에 발표된 연구결과로는 vascular endothelialgrowth factor(VEGF)에 의하여 강하게 신경줄기세포가 종양세포로 추적하여 이동을 한다는 연구결과가 발표되었다 (Schmidt등,2005).이러한 연구발표로 종양세 포를 추적하여 치료할 수 있게 되었다. 또한 줄기세포는 뇌-혈관 장벽에 영향을 받지 않고 이동할 수 있다고 보고되 었다.즉 동물실험 마우스에서 꼬리정맥에 이식하여도 세포들을 통과하여 척추 를 타고 올라가서 뇌 속의 종양 내까지 도달한다는 연구결과가 발표되었다 (Aboody 등,2000).또 중추신경계 (centralnerversystem,CNS)에 있는 줄기
세포에 의하여 손상된 뇌가 자가 치료된다는 보고도 있다.즉 줄기세포는 중추 신경계의 질병에 치료하기 위한 하나의 수단으로 사용하기에는 탁월한 능력이 있다는 것이다. 암유전자치료 중 자살 유전자 (suicidegene)를 이용하여 치료하는 방법이 있 는데 그 종류로는 단순포진바이러스 타이미딘카이네이스 (thymidine kinase; TK)와 대장균 사이토신탈아미노효소가 있다.타이미딘카이네이스는 전구약물 로 항바이러스약제인 acyclovior(ACV)혹은 ganciclovir(GCV)를 이용하여 세 포의 DNA합성을 억제시키고,사이토신탈아미노효소 (CD)는 전구약물로 항진 균제인 5-Fluorocytosine(5-FC)을 5-Fluorouracil(5-FU)로 강한 독성을 나타 내는 물질로 변환시킨다 (Hadaczek등,2005)(Koyama등,2000).타이미딘카이 네이스 (thymidinekinase,TK)과 대장균 사이토신탈아미노효소 (cytosi nede-aminase,CD)는 스스로는 세포에 자극을 주지 않으며 사람 몸속에는 관여하는 gene가 없다는 것이 큰 장점이다.두 가지 모두 독성을 나타내지 않는 약물이 독성을 나타내는 물질로 변화하여 세포를 죽이다는 점은 같고,그 자신뿐만이 아니라 주위에 있는 세포까지 독성을 나타내어 암세포를 죽인다는 bystander 효과가 있지만 TK gene은 그 기능이 뚜렷하게 밝혀진 것이 없다. 5-FU는 1957년에 처음 발견되었으며,유방암,위암,직장암에도 치료제로 사 용하고,방사선에 예민한 반응을 하여 현재 임상에서도 사용하고 있다.(Evoy 등,1997)5-FU는 상기 기술한 다양한 암 등에 대하여 탁월한 항암 효과를 갖 고 있으나 독성이 강해 뇌 암에 사용할 경우 BBB를 통과 하기위해서는 소화 기 암에 사용하는 수십 배의 용량을 전신에 투여 할 경우 인체 특히 골수에 심 각한 합병증을 유발하기 때문에 뇌종양에는 흔히 사용 할 수가 없는 약제이다. 그러나 5-FU의 전구약물인 5-FC는 세포에 독성이 없기 때문에 전신적으로 투
여해도 개체에 미치는 독성을 최소화 시킬 수 있다.CD gene에 의해 5-FC에 서 변환되어진 5-FU는 다시 세포내 효소들에 의해 5-fluorouridine 5'-tri ph-sphate(5-FUTP)와 5-fluoro-2'-deoxyuridine5'-monophosphate(5-FdUMP) 로 바뀌어서 결국 세포의 RNA 및 DNA 합성을 억제시켜 세포를 죽이게 된다. 연구의 가설로 신경줄기세포 (HB1.F3)에 자살유전자(CD)를 이입하고 종양모 델에 이식하고 전구약물인 5-FC를 주입하면 종양세포가 뇌에서 자라지 못하고 세포고사를 유도할 것이라고 생각한다. 자살유전자가 이입된 신경줄기세포 (HB1.F3/CD)가 종양부위에 머물러 있으면서 주입된 5-FC가 5-FU로 변화하여 종양세포를 죽인다는 것이다. 하지만 본 실험에서 사용하는 자살유전자가 이입된 신경줄기세포는 약물에 의해 함께 죽음으로서 뇌에 남아있지 않다.그리고 종양을 이식한 모델에 신경 줄기세포를 이식하고 어느 정도의 시간의 흐름에 따라 다르게 종양부위로 이동 을 보이지만,정확한 연구가 발표되지는 않았다. 종양세포는 2가지 type이 있다.p53을 야생형과 돌연변이형으로 첫 번째 야 생형인 종양세포는 apoptosis로 유도되기 위해서는 DNA에 손상이 되면 p53이 활동하게 되고 그것이 BAX, Fas,또는 tumor-necrosis-factor-related apop-tosis-inducing ligand receptor(TRAIL-R)등과 같은 death receptor들과 결합 을 한다.또 하나 돌연변이형 종양세포도 apoptosis로 유도되기 위해서 Bcl-2는 저해하고 c-jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase (JNK/SAPK)과 같은 deathreceptor와 결합을 한다.2가지 모두 apoptosis에서 는 연관성 있게 활동을 하며 CD gene에 의한 5-FC 실험에 대해서도 영향력 있게 나타내어진다 (Kurozumi등,2004).그러므로 그래프에서 보듯이 대조군 의 tumormass를 100%로 보았을 때 5-FC를 주입한 모델에서는 33%만 자란
것을 확인할 수 있다. 결과적으로 tumormass가 대조군에 비해 커지지 않는 것은 CD gene이 삽입 된 신경줄기세포를 이식한 종양 모델에 5-FC를 주입하면 apoptosis가 일어난 다고 볼 수 있다.즉 약물만으로 종양세포를 줄일 수 있다는 결과를 얻은 것이 고 이것이 수술적인 방법으로 제거하기 힘든 종양을 치료할 수 있는 가능성이 보여 진다고 할 수 있다. 하지만 종양세포를 세포고사를 초래하여 tumormass를 완전하게 동물모델에 서 제거할 수는 없어서 다른 자살유전자와 함께 치료하는 방법이나 세포고사를 유도하는 물질을 함께 처리함으로써 종양을 완전 치료하는 방법을 찾아야 될 것 같다.
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ.
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.결
결
결 론
론
론
본 연구에서는 자살유전자가 삽입된 신경줄기세포를 종양모델에 삽입하여 항진균제인 5-FC를 주입하여 종양의 크기를 대조군과 비교,관찰하는 것이다. invitro에서 CD gene이 삽입된 신경줄기세포가 5-FC에 예민하게 반응하여 세 포를 죽이는 것을 확인하였다. invivo실험으로 신경줄기세포가 종양을 인식 하여 이동할 수 있다는 것을 확인하였고,종양모델을 만들고 CD gene이 삽입 된 신경줄기세포를 이식하여 5-FC를 주입한 것과 PBS를 주입한 것을 관찰한 결과 tumormass의 차이를 보이는 것을 관찰할 수 있었다.대조군과 PBS를 주입한 그룹은 한쪽 뇌를 차지할 만큼 tumormass가 자라는 것을 확인할 수 있었고,5-FC를 주입한 그룹은 대조군에 비해 33%밖에 자라지 않은 것을 확인 할 수 있었다.이것은 약물만으로도 종양의 크기를 줄일 수 있다는 것이고 나 아가 이것이 임상에 적용한다면 수술하기 힘든 종양을 제거할 수 있는 충분한 가능성이 있다고 보인다.하지만,남아있는 종양세포를 완전히 제거하기 위해서 는 세포고사를 직접적으로 유도하는 물질을 함께 처리하는 방법이 고안되어야 될 것으로 생각된다.참
참
참고
고
고문
문
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-ABSTRACT-Suicide
Suicide
Suicide
Suicide Gene
Gene
Gene therapy
Gene
therapy
therapy
therapy for
for Malignant
for
for
Malignant
Malignant Gilomas
Malignant
Gilomas
Gilomas
Gilomas using
using
using
using
Neural
Neural
Neural
Neural Stem
Stem
Stem
Stem Cells
Cells
Cells
Cells
YoungMinAhn
DepartmentofMedicalSciences ThegraduateSchool,AjouUniversity (SupervisedbyProfessorKyungGiCho) I
I
Innntttrrroooddduuucccttitiiooonnn:::Despiteadvancedneurosurgicaltechniquesandvariousmulti -modaltherapeutic approach have been developed for malignant gliomas, thesecannotsavethepatientsfrom thetumorsduetoinfiltrating behavior ofthesegliomacells.
Here,authorinvestigated the possibility oftreatmentforthe malignant gliomaswithneuralstem cell(HB1.F3)transducedwithsuicidalgeneusing thetropism ofstem cells.
M M
MaaattteeerrriiiaaalllsssaaanndnddMMMeeettthhohoodddsss:::E.colicytosine deaminase(CD)ofsuicide gene is enzymethatcatalyzestheconversionofnoncytotoxic5-FC tothecytotoxic and radiosensitizing drug 5-FU.Cytotoxic 5-FU and its toxic metabolites canreadilydiffuseuntosurroundingtumorcellsgivingCD.
HB1.F3 weretransducedwithretroviralvectorsexpressingtheE.coliCD. RatswereimplantedwithU373MG,U251MG humanglioblastoma(hGM)line
and F3/CD wereinjecteddirectlyintothetumormass6dayslater. The ratswith tumorswereinjected IP 5-FC orsalinedaily for7dayssince6 daysafterimplantationoftumors.
R R
Reeesssuuullltttsss:::HB1.F3 which were injected into the contralateralhemisphere to thetumorimplantationsitemigratedthroughthecorpuscallosum tothetu-morcells3daysafterhGM transplantation.
The growth inhibition oftreated cells 5-FU in comparison to untreated controlswasremarkablein vitro.Thetumormassin theratswith trans-plantation ofF3/CD werereduced markedly in sizecomparing tothatwith F3afterinjectionof5-FC.
C C
Cooonnncccllluuusssiiiooonnnsss:::1.Thehuman neuralstem cellscantracetothegliomacells in theratbrain.Systemictreatmentwith 5-FC reduced thesizeoftumor withdirecttransplantationofF3/CD .
2.Ourdataindicatethatsuicidegenetherapyusingneuralstem cellswould bepromisingasanew therapeuticapproachformalignantglioma.
k k
keeeyyywwwooorrrddsdss:::cytosinedeaminase,5-fluorocytosine,neuralstem cell,5-fl uo-rouracil
