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공학석사 학위논문
염료-비드 결합체와 영상처리를 이용한 화이트와인
맛 판별 시스템 개발
Development of a Discriminant system for White Wine Tastes using Dye-bead conjugation and Image Processing Techniques
2013년 8월
서울대학교 대학원
바이오시스템∙소재학부 바이오시스템공학전공
염료-비드 결합체와 영상처리를 이용한 화이트와인
맛 판별 시스템 개발
지도 교수 조 성 인
이 논문을 공학석사 학위논문으로 제출함.
2013년 8월
서울대학교 대학원
바이오시스템․바이오소재학부 바이오시스템공학전공
정 수
정수의 공학석사 학위 논문을 승인함.
2013년 8월
염료-비드 결합체와 영상처리를 이용한 화이트와인
맛 판별 시스템 개발
국문 초록
광학형 맛 센서(optical taste sensor)란 기존의 맛 정보를 전기적 신호를 통 해 측정하는 방식과는 다르게 광학 스펙트럼 또는 색상 변화 측정을 통해 맛 정보를 해석하는 방식이다. 이는 맛의 정보를 광학적으로 받아들일 수 있게 하는 원리로 화학염료가 맛과 관련한 성분의 농도에 선형적으로 반응하기에 가능한 방법이다. 염료는 pH 뿐 아니라 맛과 관련한 특정 화학 성분과의 반응 을 통해 본래의 광반응 특성이 변하는 성질이 있어 이 특성을 활용하여 광학 형 맛 센서의 지표로 활용하였다. 각 염료의 pH와 맛 성분 농도에 대한 색상 변화를 380～780nm의 가시광 영역에서 반사 스펙트럼을 획득하였다. 측정한 결과 파장별 맛 성분 농도의 상관관계가 r=0.7이상으로 매우 높았으며, 염료 마다 상관관계가 높게 나타나는 파장 및 파장대역의 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 대부분의 상관계수 (r) 들이 넓은 파장 범위에서 높은 값을 나타내 색상 값만을 이용하여 맛 성분의 정량이 가능할 것으로 판단된다. 따라서 가 시광 영역에서 시료의 반사 스펙트럼을 측정하기 위한 영상획득 장치와 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 색상 값을 산출하였다. 단일 맛성분의 농도와 염 료의 RGB, HSV 칼라계의 값들과의 상관 계수를 살펴보면 단맛과 신맛을 나 타내는 성분에 대해서는 대부분 0.8 이상의 높은 상관계수를 나타냈다.
성능이 확인된 염료를 센서 칩에 활용하기 위해서 마이크로 비드 (micro-bead)를 지지체로 하는 염료-비드 결합체를 개발하였다. 염료가 결 합된 비드를 활용할 경우 센서 칩에 들어가는 염료의 양은 비드의 양을 통해 조절이 가능하고, 비드는 다루기 용이하기 때문에 센서 칩 개발에 많은 이점 이 있다. 여러 가지 액상 시료 중 와인은 알칼리성 음료로 산성 체질을 개선할 수 있 으며 유기산과 탄닌, 당, 무기질과 비타민 등이 골고루 들어있다. 최근에는 혈 관에 관련된 질병을 예방하거나 치매를 예방하는데 효과가 있다고 알려져 국 내에서도 그 소비량이 많이 증가하고 있는 추세이다. 본 연구에서는 시중에서 판매되는 20종의 화이트와인을 혼합, 희석하거나 특정 성분을 더 첨가하여 45개의 시료를 준비하였다. Sucrose, glucose, fructose, citric acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, acetic acid의 양을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 정량분석 하였다. 주석산 철 비색법을 이용하여 415nm파장에서 PLSR (Partial Least Square Regression) 방법을 이용해 농도 계산식을 각 포도주의 tannin acid의 양을 계산하였다.
맛 성분의 농도에 따른 염료-비드 결합체의 색상변화를 RGB 색상 값으로 구분가능여부를 LED 광원과 RGB 카메라를 이용하여 제작한 이미지 획득 시
서는 유용할 것으로 판단되었다. 또한 인공 신경망을 이용하여 맛 성분별로 3 단계구분이 가능한지 여부를 분석한 결과 단맛 82.5%, 신맛 85%, 떫은맛 77.5%의 정확도로 맛의 단계를 예측하였다. 사람이 인지하기 힘든 단계의 경 계부분에 대한 오차를 제외하면 맛의 단계에 대한 정보를 파악하는데 유용한 수단으로 이용될 수 있을 것으로 보인다. 주 요 어 : 광학형 맛 센서, 마이크로 비드, 염료, 영상처리, 화이트와인 Keyword : Optical taste sensor, Micro bead, Dye, Image process, White
wine
국문초록 ··· Ⅰ List of Figures ··· Ⅶ List of Tables ··· Ⅺ 1. 서론 ··· 1 2. 연구사 ··· 4 2.1. 전극형 맛 센서 ··· 4 2.2. 와인 맛 센서 ··· 5 2.3. 광학형 맛 센서 ··· 6 3. 기초이론 ··· 8 3.1. 맛 센서 ··· 8 3.2. 화학염료 ··· 9 3.2.1. 염료의 발색 원리 ··· 9 3.2.2. 염료의 맛 성분과의 스펙트럼 반응 특성 ··· 12 3.2.3. EDC 크로스링커를 이용한 염료 비드 결합 ··· 26 3.3. 화이트 와인의 맛 성분 ··· 27 3.4. 맛 성분 정량 분석 ··· 29
3.6.1. 이미지 프로세싱의 개념 ··· 39 3.6.2. 디지털 영상처리 기술 ··· 42 3.6.3. 디지털 영상처리의 응용분야 ··· 45 4. 재료 및 방법 ··· 47 4.1. 염료와 비드 결합체와 센서 어레이 제작 ··· 47 4.2. 안정성 실험 ··· 49 4.3. 맛성분과 염료-비드 결합체와의 반응 특성 ··· 50 4.4. 화이트와인 맛 성분의 화학적 정량화 ··· 51 4.4.1. 화이트와인의 단맛과 신맛성분의 정량 실험 방법 ··· 51 4.4.2. 화이트와인의 탄닌 정량실험 ··· 53 4.5. 영상 획득 시스템 구축 및 분석 소프트웨어 개발 ··· 54 4.6. 통계적 기법을 이용한 데이터 처리 ··· 56 5. 결과 및 고찰 ··· 58 5.1. 염료-비드 결합체 ··· 58 5.1.1. 반응성 실험(안정성) ··· 58 5.1.2. 맛 희석액과 반응 ··· 59 5.2. 영상 획득 시스템을 이용한 이미지 색상 분석 ··· 63 5.3. 화이트와인 맛 성분 ··· 64 5.3.1. HPLC결과 및 감미도 산미도 적용 ··· 64 5.3.2. HPLC를 이용한 화이트 와인 시료의 맛 성분 정량 ··· 64 5.3.3. 탄닌 정량 분석을 위한 예측 모델 개발 ··· 66 5.4 스펙트럼 특성 ··· 67 5.5 주성분 분석 및 모델 개발 ··· 72
5.5.1. PCR을 통한 단맛 성분 예측 모델 개발 ··· 73 5.5.2. PCR을 통한 신맛 성분 예측 모델 개발 ··· 75 5.5.3. PCR을 통한 떫은맛 성분 예측 모델 개발 ··· 77 5.5.4. 맛 성분의 주성분 분석 ··· 80 5.5.5. 인공신경망을 이용한 맛 구분 ··· 82 6. 요약 및 결론 ··· 87 7. 참고 문헌 ··· 90 Abstract ··· 95
List of Figures
Fig. 1 Membrane images in acidic (pH 2.06) and basic (pH 12.03) conditions ··· 6 Fig. 2 Image of the colorimetric sensor array before and after exposure
to 7-Up ··· 7 Fig. 3 Average color change profiles from the colorimetric sensor array
for 14 common soft drinks ··· 7 Fig. 4 Comparison illustration between human tongue and electronic
tongue. ··· 8 Fig. 5 Dye structure based on chromophore theory. ··· 10 Fig. 6 Color change by chemical structure change based on quinonoid
theory. ··· 10 Fig. 7 Dye structure and optical property change by ionization. ··· 11 Fig. 8 Correlation coefficient between dyes on acetic acid concentration. ··· 13 Fig. 9 Correlation coefficient between dyes on citric acid concentration.
··· 15 Fig. 10 Correlation coefficient between dyes on lactic acid concentration. ··· 16 Fig. 11 Correlation coefficient between dyes on NaCl concentration. ···· 18 Fig. 12 Correlation coefficient between dyes on CaCl2 concentration. ··· 20
Fig. 13 Correlation coefficient between dyes on glucose concentration 22 Fig. 14 Correlation coefficient between dyes on sucrose concentration. 24 Fig. 15 Chemical structure of EDC. ··· 26 Fig. 16 Process of EDC conjugation. ··· 27
Fig. 17 Application of high performance liquid chromatography. ··· 30
Fig. 18 Back propagation neural network with 4 layers . ··· 37
Fig. 19 Black-and-white photograph image. ··· 40
Fig. 20 Color photograph image. ··· 41
Fig. 21 Digital camera. ··· 42
Fig. 22 Classification of digital image processing techniques. ··· 43
Fig. 23 Examples of edge detection to analyze the digital image. ··· 44
Fig. 24 Example of fingerprint recognition to recognize the digital image. ··· 45
Fig. 25 Chemical structure of selected dyes. ··· 48
Fig. 26 Prepared sensor array with eight dyes conjugated to micro beads. ··· 49
Fig. 27 The feature of ColorMate spectrometer. ··· 50
Fig. 28 The feature of used white wine samples. ··· 51
Fig. 29 Image of HPLC instrument. ··· 52
Fig. 30 Schematics of image acquisition system of sensor array. ··· 55 Fig. 31 Features of the measurement system by color change of dye. 55 Fig. 32 (A) Color change of supernatant of dye-bead conjugated stored
Fig. 38 Procedure of image processing with sensor array image. ··· 63 Fig. 39 HPLC result pattern of carbohydrates from white wine. ··· 65 Fig. 40 HPLC result pattern of organic acid from white wine. ··· 65 Fig. 41 Correlation graph between tannin concentration and spectra by
wavelength. ··· 67 Fig. 42 Correlation coefficient between alizarin-bead conjugate on tastant
concentration. ··· 68 Fig. 43 Correlation coefficient between calconcarboxylic acid-bead
conjugate on tastant concentration. ··· 69 Fig. 44 Correlation coefficient between xylenol orange-bead conjugate on
tastant concentration. ··· 69 Fig. 45 Correlation coefficient between methylthymol blue-bead conjugate
on tastant concentration. ··· 70 Fig. 46 Correlation coefficient between phenol red-bead conjugate on
tastant concentration. ··· 70 Fig. 47 Correlation coefficient between crystal violet-bead conjugate on
tastant concentration. ··· 71 Fig. 48 Correlation coefficient between cresol red-bead conjugate on
tastant concentration. ··· 71 Fig. 49 Correlation coefficient between fluorescein-bead conjugate on
tastant concentration. ··· 72 Fig. 50 (A) Calibration plot of sweetness tastant with 40 samples. (B)
Validation plot of sweetness tastant with 40 samples. ··· 75 Fig. 51 (A) Calibration plot of sourness tastant with 40 samples. (B)
Fig. 52 (A) Calibration plot of tannin with 40 samples. (B) Validation
plot of tannin with 40 samples. ··· 79
Fig. 53 PC score plot clustered according to sweetness level. ··· 81
Fig. 54 PC score plot clustered according to sourness level. ··· 81
Fig. 55 PC score plot clustered according to astringency level. ··· 82
Fig. 56 Comparison between measured sweetness level and predicted sweetness level. ··· 84
Fig. 57 Comparison between measured sourness level and predicted sourness level. ··· 84
Fig. 58 Comparison between measured astringency level and predicted astringency level. ··· 85
List of Tables
Table 1. Specifications of the aminomethyl MPS resin used in the study
... 47
Table 2. Concentration of prepared basic tastant component ··· 50
Table 3. Condition of HPLC for tastants analysis in white wine ··· 53
Table 4. Concentration of tannin used on tannin calibration model ··· 54
Table 5. Specification of A601fc Basler camera ··· 56
Table 6. Combination of configuration variable for ANN ··· 57
Table 7. Wavelength value of the best correlation coefficient after react with taste component with dye-bead conjugate ··· 63
Table 8. Calibration and validation result of sweetness tastant with 45 samples ··· 73
Table 9. Calibration and validation result of sweetness tastant with 42 samples ··· 74
Table 10. Calibration and validation result of sweetness tastantwith 40 samples ··· 74
Table 11. Calibration and validation result of sourness tastant with 45 samples ··· 76
Table 12. Calibration and validation result of sourness tastant with 42 samples ··· 76
Table 13. Calibration and validation result of sourness tastant with 40 samples ··· 77
Table 14. Calibration and validation result of astringency tastant with 45 samples ··· 78 Table 15. Calibration and validation result of astringency tastant with 42
samples ··· 78
Table 16. Calibration and validation result of astringency tastant with 40 samples ··· 79
Table 17. Result of ANN training ··· 83
Table 18. Determination ratio of sweetness level with ANN ··· 85
Table 19. Determination ration of sourness level with ANN ··· 86
1. 서 론
소비자가 음식 상품을 구입하는데 ‘맛’은 결코 무시할 수 없는 요소이다. 건 강식을 추구하는 웰빙(well-being) 음식문화가 생겨나고, 영양소가 고루 갖추 어진 음식이나 무농약 농산물에 대한 관심이 높아지고 있긴 하지만, 음식의 맛을 느낌으로 얻을 수 있는 즐거움의 가치를 중요시하는 소비자들이 늘고 있 어 식품에서 맛은 매우 중요한 비중을 갖는다고 할 수 있다. 근래 음식 산업 은 비슷한 상품이라도 개인이 추구하는 맛의 성향이 다르고 정도가 다르기 때 문에 다양한 음식상품이 개발되거나, 다양한 상품을 맛보고자 하는 욕구에 의 해 발전하고 있다고 할 수 있다. 국내 와인 시장의 경우에 소비량은 국민 생활수준과 건강에 대한 관심이 높아 짐에 따라 점차 증가하고 있다. 2004년 대한 주류공업협회의 통계자료에 따 르면 국내 주류시장에서 유통 중인 전체 주류 중 과실주가 차지하는 비율은 전체의 1.37%이며 총 출고 가격으로는 1.96%를 차지하는 것으로 보고되고 있다.(한국주류협회,2008) 또한 한국수입주류협회의 주류 수입량은 최근 5년 간 와인 수입량이 매년 11%가량씩 증가한다고 한다. 하지만 와인은 출산지나 그해의 기후에 따라서 포도의 품질이 달라지고 당분이나 산도 등에 많은 차이 를 나타내기 때문에 같은 브랜드라도 빈티지에 따라서 맛이 다르며 일반 소비 자들이 와인의 맛을 쉽게 예측하기가 어렵다는 단점이 있다. 이는 제조 방법, 재료, 숙성방법에 따라 맛 차이가 매우 크기 때문인데, 그렇기에 새로운 상품 출시나 과거에 먹어본 경험이 없는 상품을 소비하였을 때 입맛에 맞지 않아 종종 실망하는 경우가 있다. 이는 상품 구입 당시에 맛을 예상할 수 없기 때 문으로 근래 와인의 경우 대형 마트에서는 맛 정보를 'dry-sweet' 또는 ‘light-heavy'로 표기해 놓는 경우도 있지만, 그럼에도 불구하고 처음 접하는 상품을 구입하는데 정보가 충분하다고 할 수는 없으며 특히 사람이 평가한 맛 은 전문가 사이에서도 개인의 주관적인 기준의 차이로 인해 맛의 평가에 큰차이를 나타낸다(Lenote et al., 2006). 이러한 점은 와인 사업이 발전하는데 있어서 저해요소가 될 수 있다. 와인의 맛 성분을 정량화하여 표기하여 준다 면 소비자들이 자신의 기호에 맞는 종류를 선택하기가 보다 용이할 것이며, 판매자 또한 특별한 지식 없이도 와인 판매가 가능해 짐에 따라 와인 시장이 보다 활성화 될 수도 있을 것이다. 특히 신맛에 해당하는 맛 성분의 정량화는 맛에 대한 정보뿐만 아니라 와인 제작 공정 중에 와인의 산화 정도를 판단하 여 제품에 이상이 발생하는지 여부를 측정하는데 이용 될 수도 있을 것이다. 이러한 음식의 맛 특히 액상식품의 맛을 평가하기 위한 여러 가지 방법이 연구되었고 초기에는 multi-channel 전극을 이용한 방법을 통해 맛 성분들을 측정하는 연구가 활발히 이루어졌으며(Legin et al., 1997, Kim N., 2005) 이 후에 스펙트로미터를 이용한 광학적인 방법으로 맛을 측정하고자 하는 연구들 이 진행되었다.(Zang C., 2006,2007) 하지만 이러한 방법들은 전문적인 기술 이 필요하거나 시료의 전처리 기술이 필요하며 비용이 많이 들고 측정하는데 시간이 많이 걸렸다. 그리고 한정된 장소에서 고가의 장비를 이용해야 한다는 단점들이 존재하였다. 이에 본 연구에서는 기존 연구된 광학적 맛 센서를 개 량 및 보완하여 보다 안정적이며 쉽게 이용 가능한 맛 센싱에 대한 연구를 수 행하고자 한다. 기존에 연구된 화학 염료와 맛 성분과의 반응이 특정 파장영 역에서 맛 성분의 농도에 따라 높은 상관관계를 나타낸다는 결과를 바탕으로
트와인의 맛 구분이 가능한지 여부를 판단하는데 있으며 세부 목표는 다음과 같다. 1) 칩 내부에 정량의 염료를 넣을 수 있도록 염료들과 마이크로 비드와 안정 적으로 결합시키는 방법에 관한 연구, 2) 기본 맛 성분 중 와인을 구성하는 주된 맛 성분인 단맛, 신맛, 떫은맛의 농도에 따른 염료의 색상 변화에 대한 연구, 그리고 3) 2)번 실험을 토대로 와인의 맛 구분가능 여부에 대한 성능 테스트를 수 행한다.
2. 연구사
2.1. 전극형 맛 센서
초기의 맛 센서 연구 개발은 이른바 전극형 맛 센서라 일컬어지는 막 전위차 측정법에 의해 이루어져 왔다. 이는 특정 이온과 반응을 일으키는 고분자 막 을 제조하여 이온전극에 장착하여 센서 어레이를 구축하는 방법이다.
Toko(1996, 2000)는 처음으로 액상 식품에 multi-sensor system을 이용한 non-specific 센서를 통해 “electric tongue”를 개발하였다. 이는 사람이 맛을 느끼는 방식을 따라한 것이기 때문에 “taste sensor”라 불리기 시작했으며 이 후 lipid membrane을 이용한 taste sensor를 이용하여 맥주, 사케, 커피 우유 등의 음료의 맛을 평가하였다. Iiyama 등(2000)은 8종의 고분자 막 전극과 기준 전극을 이용하여 일본에서 생산되는 간장 25가지를 구분하는 결과를 보 여 주었으며 Park 등(2004)은 시중에서 많이 판매되고 있는 식혜, 수정과, 감 귤 주스, 이온 음료, 매실 음료, 녹차 6종류의 24가지 시료에 8종의 이온 전 극을 사용하여 얻어진 신호를 주성분 분석을 통해 판별이 가능함을 확인하였 다. 그리고 Kim 등(2005)은 8-channel 맛센싱 시스템을 통해서 시중에서 판 매되는 매실주, 소주, 맥주를 주성분 분석을 통해서 분석하였다. Vlasov 등
한다면 광학형에 비해 측정 시간과 편리성이 떨어지는 문제가 있다. 따라서 아직 전극형 센서가 측정 감도에서는 더 우수하다는 점에도 불구하고 비교적 측정 시간이 짧고 적은 양의 시료로도 센싱이 가능한 광학형 맛 센서 개발이 필요한 것으로 사료된다.
2.2. 와인 맛 센서
와인 시장이 세계적으로 커짐에 따라 이처럼 포도의 품종이나 생산 장소 등 에 의한 분류에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.Legin 등(2003)은 23개의 전위차 전극을 이용하여 Glycerol, Antocianins, polyphenols, Sulphur dioxide, Potassium, Calcium, acid등을 측정하고 성분 에 따라서 분류함으로써 같은 해에 생산되었지만 포도의 생산지가 다른 와인 들의 구분이 가능함을 보였다. Di Natale(2004)는 금속 포르피린을 기반으로 한 센서로 와인의 맛을 사람 의 감각기관을 통한 분류와 유사하게 분류가 가능함을 보였고 Antonio(2004) 는 Langmuir-Blodgett film과 지질 및 레이어 별로 키토산이 증착된 골드전 극을 이용하여 여섯 종류의 레드와인의 주요 구성 요소를 주성분 분석을 통해 구분이 가능함을 보였고, 또한 Bae와 Cho(2005)는 전위법을 이용한 고분자 막 센서를 이용하여 3종류의 적포도주와 3종류의 백포도주를 구분하기 위해 5종의 전기활성 물질이 도핑 된 전극과 기준전극을 이용한 맛 센서를 제작하 였다.
Santos(2005)는 센서 표면에 polyepichlorohydrin (PECH),
polyetherurethane (PEUT) and polydimethylsiloxane (PDMS)를 코팅한 surface acoustic wave(SAW) 센서 어레이를 이용하여 와인 기체를 측정하여 주성분 분석과 선형판별분석법을 이용하여 다른 포도종과 동화작용에 의한 차
이를 구분해 낼 수 있는 실험을 진행하였다.
2.3. 광학형 맛 센서
광학형 화학 센서에 대한 연구 성과로는 Huigi 등(2003)에 의해 개발되어 Ca2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mg2+, Fe3+ 이온을 구분하는 것이 가능한 마이크로 어레이 칩이 있다. Huigi는 이 금속 이온들과 반응하여 색 변화를 보이는 염 료 물질을 고분자 마이크로 비드에 결합시키고 이를 마이크로 칩에 위치시킨 후 시료를 흘려서 나타나는 광 특성을 분석하였다. Marquez(2005)는 NIR 센서를 이용하여 올리브 오일의 산성도와 쓴맛, 지방 산의 함량을 partial least squares 방법을 통해 예측하는 모델을 개발하여 예 측한 화학적 성분이 실제 올리브 오일의 화학적 성분을 실험적으로 분석한 값 과 유사한 결과를 나타내었다.CaroFig.lio(2006)는 16개의 부분으로 이루어진 금속이온 센서를 통해 그림 1과 같이 azo-dye를 이용하여 색상정보를 통해 pH를 예측 가능함을 보여주 었다.
하여 이를 발표하였다. 이미지 처리를 이용한 맛 센싱은 Zang 등(2006,2007)이 18종류의 상용 맥 주를 특정 염료가 프린트된 소수성 멤브레인에 반응시켜 색상 변화를 측정하 여 그림 2와 같이 맥주의 종류별로 선정된 염료의 색상 변화가 다름을 이용하 여 주성분분석을 실시한 결과 맥주를 종류별로 분류할 수 있음을 보였고, 나 아가 그림 3과 같이 시중에서 판매되는 탄산음료들에도 적용하여 탄산음료별 로도 분류가 가능함을 보였다.
Fig. 2 Image of the colorimetric sensor array before and after exposure to 7-Up.
Fig. 3 Average color change profiles from the colorimetric sensor array for 14 common soft drinks.
3. 기초이론
3.1. 맛 센서
식품의 맛은 신맛, 단맛, 짠맛, 쓴맛의 기본적인 맛으로 구분될 수 있으며 또 한 이들 맛의 혼합으로 표현 될 수 있다. 여러 연구결과 신맛은 수용액 상에 서 수소이온을 발현할 수 있는 유기산 등과 같은 물질들에 의해 느껴지며 짠 맛은 다양한 전해질 물질들에 의해 기인한다는 것이 확인되었다. 인간의 맛 감지 메커니즘은 그림 4와 같이 표현될 수 있다.Sensor array Multivariate Analysis
Electronic tongue
Taste stimuli Electrolyte, non-electrolyte
Detect Recognition Human gustation mechanism
electric signal
할 수 있으며 이는 소비자의 맛의 세부적인 기호를 충족시키는데 도움이 된 다. 전자 혀는 또한 여러 식품의 맛 차이를 평가하는데 활용할 수 있으며 식 품의 제조 공정에서 원료 또는 제조 방법의 변경에 따른 맛 차이 유무를 신속 하고 객관적으로 평가 할 수 있도록 한다.
3.2.화학염료
3.2.1. 염료의 발색원리
물질이 가시광선 스펙트럼의 일부를 선택적으로 흡수할 경우 반사 혹은 투과 되어진 스펙트럼의 빛들은 우리 눈에서 색으로 느껴지며 염료가 눈에 인지되 어지는 색과 이들의 화학구조에 관한 학설로 발색단설(Chromophore theory), 퀴노이드설(Quinonoid theory), 공명구조설(Resonance theory), 전자론에 의 한 발색설이 있다.발색단설에 의하면 염료는 반드시 발색단 및 조색단을 포함하여야 하며, 발 색단은 유기화합물이 색을 갖기 위하여 그 분자 내에 발색의 원인이 되는 불
포화 원자단 구조를 갖는 관능기를 말하고 –N=N-, -NO2, -N=O, -C=O,
-C=C- 등의 관능기가 대표적인 발색단이다. 이러한 발색단을 분자구조 중 에 포함하고 있는 방향족 화합물을 색원체(chromogen)라 하며 이러한 색원체 가 염료가 되려면 조색단(auxochromes)이 필요하며 색원체에 심색효과와 염
착성을 부여하는 원자단으로는 –OH, -COOH, -SO3H, -NH2, NHCH3 등이
Fig. 5 Dye structure based on chromophore theory.
퀴노이드설은 분자 내에 퀴노이드구조를 가져야만 유기화합물이 색상을 나타 낸다는 이론으로 분자 중에 o-quinone 혹은 p-quinone의 형태를 직접 포함 하거나, tautomerism등으로 인한 구조적 변화로 quinone형으로 되면 발색이 가능하다는 이론이다. 예를 들면 그림 6의 모습과 같다.
화 할 때 얻을 수 있는 Malachite Green의 이온은 색상을 나타내는데, 이러한 이유는 분자전체에 걸쳐서 염료이온의 원자가 재분포가 일어나 분자구조 전체 에서 공명을 이루기 때문이다.
Fig. 7 Dye structure and optical property change by ionization.
전자론에 의한 발색설은 유기물질의 발색이 발색단의 유무와 상관없이 전자 파의 흡수에 의하여 일어나는 현상으로, 가시광선영역에서의 흡수대가 존재하 기 때문으로 설명할 수 있다. 유기화합물이 자외선 및 가시광선 영역에서 빛 을 흡수할 때 선택적인 흡수대를 가지는 원인은 분자의 에너지 변화에 따라 일어나는 현상으로 유기화합물의 기저상태의 에너지 준위와 여기상태의 에너 지 준의의 차이가 흡수파장을 결정한다. 두 상태의 에너지 차는 다음과 같은 광화학 법칙으로 설명할 수 있다.
ΔE= E
e- E
g= hν
,ν = c
λ
··· (3-1)ΔE : 여기에너지 차이 Ee : 여기상태의 에너지 준위 Eg : 기저상태의 에너지 준위 h : plank 상수 ( 6.626×10-34 J․s ) ν : 흡수광의 진동수 c : 빛의 속도( 2.9979 × 108 m/s ) λ : 흡수광의 파장 즉, 에너지의 차이는 진동수 v에 비례하며 흡수광의 파장λ에 반비례하여 파 장이 작을수록 ΔE는 커지게 된다. 따라서 화합물이 색을 나타내기 위해서는 가시광선의 파장에 상응하는 에너지를 가져야 한다.
3.2.2. 염료의 맛 성분과의 스펙트럼 반응 특성
염료와 중요한 맛 성분과의 반응에 대한 분광 특성을 분석했다. 맛 물질로는 acetic acid, citric acid, lactic acid, NaCl, CaCl2, glucose, sucrose가 사용되었이온 솔루션 염료의 색 변화의 경우(NaCl 및 CaCl2) 일반적으로 모든 염료는
높은 상관 계수(그림 11, 12)를 보여 주었다. 특히 산성과 거의 관계를 보이지
않았던 o-cresolphthalein은 CaCl2 이온에 매우 높은 상관관계를 보여 주었다.
또한 염료는 glucose, sucrose(그림 13, 14)와 상관관계를 보여 주었다.
calconcarboxylic acid 및 fluorescein은 sucrose와 각각 380~560nm, 380~
490nm의 파장에서 거의 완벽한 상관관계를 나타냈다. o-cresolphthalein의 경 우 상관 계수는 sucrose 농도의 모든 파장에서 그 절대값이 0.9보다 높았다.
Fig. 8 Correlation coefficient between dyes on acetic acid concentration. (a): alizarin, (b): calconcarboxylic acid,
(e): fluorescein, (f): methylthymol blue, (g): phenol red, (h): xylenol orange
Fig. 9 Correlation coefficient between dyes on citric acid concentration. (a): cresol red, (b): crystal violet,
(c): fluorescein, (d): methylthymol blue, (e): phenol red, (f): xylenol orange
Fig. 10 Correlation coefficient between dyes on lactic acid concentration. (a): alizarin, (b): calconcarboxylic acid,
(e): fluorescein, (f): methylthymol blue, (g): phenol red, (h): xylenol orange
Fig. 11 Correlation coefficient between dyes on NaCl concentration. (a): alizarin, (b): calconcarboxylic acid,
(e): methylthymol blue, (f): phenol red, (g): xylenol orange
Fig. 12 Correlation coefficient between dyes on CaCl2 concentration. (a): alizarin, (b): calconcarboxylic acid,
(e): fluorescein, (f): methylthymol blue, (g): o-cresolphthalein, (h): phenol red, (i): xylenol orange
(e): fluorescein, (f): methylthymol blue, (g): xylenol orange
(e): fluorescein, (f): methylthymol blue, (g): o-cresolphthalein, (h): xylenol orange
3.2.3. EDC 크로스링커를 이용한 염료 비드 결합
EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)는 carboxylic group과 amine group을 연결 시켜주는 zero-length 크로스링커로 그림 15와 같은 구조를 이루고 있다.
이 크로스링커는 펩티드 합성이나 면역원을 형성하기 위해서 운반 단백질에 haptens를 부착하거나 5-인산 그룹을 통해 핵산 레이블링 및 생체 분자의 아 민 반응 NHS-ester를 만드는 등 다양한 애플리케이션에서 사용되어왔다. EDC는 carboxylic group과 반응하여 amine 반응성 O-acylisourea 중간체를 형성하며 이 중간체가 amine과 반응하지 않는 경우 가수 분해가되어 다시 carboxylic group을 생성한다. N-hydroxysulfosuccinimide(sulfo-NHS)가 존 재하면 EDC는 amine 반응성 sulfo-NHS ester로 carboxylic group을 변환 할 수 있으며 이 carboxylic group 함유 분자와 EDC를 혼합하고 sulfo-NHS 를 추가하여 결합을 시킨다. 반응 과정은 다음 그림 16과 같다.
Fig. 16 Process of EDC conjugation.
3.3. 화이트 와인의 맛 성분
와인은 기본적으로 물과 알코올의 혼합물이다. 하지만 이외에도 다른 여러 미세한 구성 요소들로 인해 와인의 품질과 맛이 결정되어 진다. 그 구성 요소 들은 다음과 같다. 가장 높은 비율을 차지하는 것은 물이며(80%-85%) 와인 에 포함되어 있는 물은 전부 포도 과액에서 추출되기 때문에 불순물이 전혀 없는 생물학적으로 맑은 물로, 여러 가지의 복잡한 화학반응을 가능케 하는 기본 요소이다. 알코올은 10%-17% 가량 차지하고 있으며 천연효모균이 당 분을 이용하여 만들어낸 생성물이다. 와인의 알코올은 대부분 에틸(ethyl)이 라는 모노 알코올로 구성되어 있다. 그리고 에틸 다음으로 많은 것은 글리세 롤(glycerol)이라는 달콤한 맛의 폴리 알코올이다. 그 밖에도 부틸렌 글리콜 (butylene glycol)과 시클릭 알코올(cyclical alcohol)이 와인을 구성한다. 그 리고 독한 와인들은 증류작업을 통해 생성된 것으로, 다량의 알콜이 추가되어진다. 유기산(0.4%-1%)은 다른 원소들과 균형을 맞추어 어느 정도의 신맛과 샤 프한 맛을 와인에 선사한다. 포도에서 추출되는 3가지 산 중에서 타르타르산 (tartaric)이 가장 큰 비중을 차지하며, 그 뒤로 말릭산(marlic)과 시트르산 (citric)이 와인에 다량 함유되어 있다. 그 외의 숙신산(succinic), 젖산 (lactic)과 아세트산(acetic:휘발성)은 단순히 발효과정의 생성물이다. 포도는 또한 발효과정을 통해 알코올이 되는 포도당, 과당과 기타 당분을 함 유하고 있다. 담백하고 드라이한 와인에는 보통 소량(0.1%)의 당분이 남아있 으나, 달콤한 와인의 당분 함유량은 10%까지 되기도 한다. 와인의 달콤함은 당분뿐만 아니라, 알코올과 다른 원소들에 의해서도 좌우된다. 그 밖에 무기산 과 유기산으로부터 생성된 무기염류(0.2%-0.4%)는 와인에 산뜻한 맛을 더해 준다. 그 종류로는 칼륨(potassium), 나트륨(sodium), 마그네슘(magnesium), 칼슘(calcium)과 철(iron) 등이 있다. 화이트 와인과 레드 와인의 색을 결정짓고 맛에 있어 근본적인 차이를 느끼 게 되는 것은 바로 페놀(0.01%-0.5%)의 존재 때문이다. 색소가 붉은 안토시 아닌(anthocyanine)과 탄닌(tannin)의 형태로 존재하는 폴리페놀은 포도 껍질 에 함유되어 있다. 그러나 화이트 와인은 껍질이나 나무숙성통의 탄닌, 그리고 색소에 거의 영향을 받지 않기 때문에 적색으로 변하지 않는다.
3.4. 맛 성분 정량 분석
정량 분석은 물질을 구성하는 양적 관계를 명확하게 하는 분석법으로 어떤 물질이 시료에 얼마나 포함되어있는지를 밝히기 위하여 화학반응 등을 이용한 다. 주요 방법으로는 침전을 만들어 중력을 측정하는 것, 반응성인 작용기를 적정하는 것, 발생하는 기체의 부피를 측정하는 것, 정색반응에 의해 생긴 물 질의 흡광도를 측정하는 것 등이 있다. 단맛을 내는 성분인 sucrose, glucose, fructose와 신맛을 내는 성분인 citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid 와 같은 유기산은 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이 용하여 정량 분석하였고, 떫은맛을 나타내는 탄닌은 주석산 철 비색방법을 통 해 정량 분석하였다.3.4.1. HPLC 분석
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 모든 분리 분석 방법 중에서 가장 널리 사용되고 있는 방법이다. 그 이유는 높은 감도를 가지고 있고, 쉽고 정확 하게 정량분석 할 수 있으며, 비휘발성 화학종 또는 열적으로 불안정한 물질 도 쉽게 분리할 수 있기 때문이다. 또한 공업 분야 및 공중위생 분야 등 많은 다른 과학 분야의 물질들에 널리 응용될 수 있다. 이런 물질들로는 아미노산, 단백질, 핵산, 탄화수소, 탄수화물, 유기산 등이 있다. 분자량이 10,000 이상인 용질에 대해서는 배제 크로마토그래피가 종종 사용 되며 분자량이 작은 이온성 화학종의 경우 이온-교환 크로마토그래피가 널리 사용되고 있다. 극성이 작고 비이온성인 화학종은 분배방법으로 다루는 것이 가장 좋다. 또 이 방법은 동족계열의 화학종들을 분리하는데도 자주 이용된다. 흡착 크로마토그래피는 비극성 화학종, 구조 이성질체 그리고 지방족 알코올에서 지방족 탄화수소와 같은 화합물들을 분리하는데 사용된다. 그림 17은 여러 가지 액체 크로마토그래피들이 응용 영역에서만 본다면 서로 상호보완적 이라는 것을 잘 보여준다.
Fig. 17 Application of high performance liquid chromatography.
분배 크로마토그래피는 네 가지 액체 크로마토그래피 방법 중에서 가장 널리 이용되고 있으며 분자량이 3000이하인 비 이온성 극성 화합물 분석에 많이 응용되었다. 하지만 최근에는 방법이 개량되어 분배 분리를 이온성 화합물에
분배 크로마토그래피는 이동상과 정지상의 상대적 극성에 따라 두 종류로 구 분하고 있다. 초기의 액체 크로마토그래피에서는 정지상으로 실리카나 알루미 나 입자에 도포시킨 물 또는 트리에틸렌글리콜과 같은 극성이 매우 큰 것을 사용하였다. 그리고 이동상으로는 핵산 또는 이소프로필에테르와 같이 비교적 비극성인 용매를 사용하였다. 먼저 사용되었다는 이유 때문에 이러한 종류의 크로마토그래피를 정상 크로마토그래피(normal-phase chromatography)라 한 다. 역상 크로마토그래피(reversed-phase chromatography)에서는 정지상이 비극성인 것으로 종종 탄화수소를 사용하며 이동상은 비교적 극성인 것(물, 메탄올 등)을 사용한다. 정상 크로마토그래피에서는 극성이 가장 작은 성분이 상대적으로 이동상에 가장 잘 용해되기 때문에 먼저 용리된다. 이동상의 극성 을 증가시키면 용리시간이 짧아진다. 반대로 역상 크로마토그래피에서는 극성 이 가장 큰 성분이 먼저 용리되고 이동상의 극성을 증가시키면 용리시간도 길 어진다. 결합상 충전물은 결합된 피막이 비극성 성질을 가지고 있으면 역상으로, 피 막이 극성 작용기를 가지면 정상으로 분류된다. 현재 고성능 액체 크로마토그 래피의 75% 정도는 역상 충전물을 사용한 관을 이용하고 있다. 이러한 피막 에 있는 실록산의 R기는 대부분 C8 사슬(n-octyl)이나 C18(n-octadecyl)이 다. 대부분의 역상 크로마토그래피의 응용에서는 메탄올, 아세토나이트릴 또는 테트라히드로푸란과 같은 용매를, 여러 가지 농도로 포함하고 있는 수용액과 같이 극성이 큰 이동상으로 용리를 한다. 이 경우 pH값이 7.5를 넘지 않도록 조심하여야 하는데, 그 이유는 pH가 높아지면 실록산이 가수분해 되어 충전물 이 분해 또는 파괴되기 때문이다.
3.4.2. 주석산 철 비색법
주석산 철 비색법은 phenol성 수산기가 철염과 착염을 형성하여 청색계통의 색깔을 나타내는 반응을 응용한 것으로, 비색법으로서 이용되기 위해서는 착 염이 장시간 안정적으로 용해되어 있지 않으면 안 되는데, 여기서 사용되는 주석산 철 시약이 이와 같은 역할을 수행한다. 탄닌에 대한 정색도는 pyrogallol형의 phenol기를 가진 것이 예민하게 반응한다. 와인의 탄닌 조성은 대체로 같은 정도의 범위 내에 있으며 그 범위이면 흡광도에 대한 영향을 크 지 않기 때문에 하나의 표준곡선으로 충분히 측정 할 수 있다. 시료 중의 탄닌의 양은 표준곡선으로부터 시료의 흡광도에 상당하는 ethyl gallate의 양을 구하여 다음 식에 의해 계산한다. Tannin(catechin %) = G X 1.5X 100/S (3-2) G:표준곡선으로부터 구한 시료의 흡광도에 상당하는 ehtyl gallete의 양 (mg/100mL) S:건조 시료의 채취량(mg) (표준식품분석학, 채수규 등, 지구문화사)경에 의한 노이즈가 함께 포함되어 있다. 스펙트럼 분석을 통해 시료의 성분 함량을 예측하기 위해서는 획득한 반사 스펙트럼(반사도)을 흡광도로 변환한 뒤, 스펙트럼의 노이즈를 제거할 필요성이 있다. 또한 스펙트럼을 측정할 때 시료의 상태나 시료와 센서의 상대적인 거리 및 방향 차이, 산란(scattering) 의 정도 혹은 경로길이 등의 차이로 스펙트럼의 기준선 혹은 기울기가 변하여 스펙트럼에 변형이 발생한다. 이러한 변형은 분석할 때 많은 오차를 유발하는 데 스펙트럼 전처리는 위와 같은 변화를 보정해 주고, 회귀 분석 시 변화를 줄이며 검량선을 안전하게 하여 정량 및 정성분석의 필수적인 도구로 사용되 고 있다. 스펙트럼 전처리 방법에는 평활화(smoothing), Normalization, MSC(Multiplicative Scatter Correction), SNV(Standard Normal Variate), 미 분(derivative) 등이 있다.
3.5.2. 정량 모델 개발 및 성능평가
시료를 대상으로 측정한 스펙트럼을 이용하여 시료 내의 특정 화학성분의 농 도를 예측하기 위해 다중선형 회귀(Multiple Linear Regression, MLR) 모델, 주성분 회귀(Principle Component Regression, PCR) 모델, 부분최소자승 회 귀(Partial Least Square Regression, PLSR) 모델, 신경망(Neural Network, NM) 모델 등이 개발되어 이용되고 있다. 개발된 모델의 성능을 평가하기 위
해서 상관계수 r, 결정계수 R2, bias, SEP(standard error of prediction) 또는
RMSEP(root mean square error of predictio)를 이용한다.
주성분 분석은 최대한의 정보를 가진 신호에서 가장 상관성이 없는 직교의 성질을 가지는 최소의 변수들을 선형으로 결합하여 신호를 표현하는 기법으로 주로 데이터 압축, 데이터 분석, 패턴 인식 및 독립성분 분석의 전처리 방법이 며 신호의 백색화(whitening)에도 사용된다. 주어진 데이터가 m차원의 벡터
(3-3) 일 때, 주성분 분석 알고리즘은 x를 (3-4) 와 같이 행렬 W를 통해 선형 변환하여 s의 분산이 최대가 되는 직교 방향을 찾는 것이다. 여기서 s의 k번째 성분을 k번째 주성분이라고 한다. 이때 W의 k번째 행은 스펙트럼 벡터 x의 공분산 행렬에서 k번째로 큰 정규화 된 고유 벡터와 일치하게 된다. 주성분을 구하기 위해서는 특이 값 분해 방법이나 번 복적인 방법인 power method 및 orthogonal iteration 방법 등을 이용하여 구 할 수 있다. 스펙트럼 데이터를 대상으로 하는 주성분 분석은 주어진 시료 집단을 구성 하는 각 시료가 N개의 화학 성분으로 구성되었다고 가정할 경우 각 시료를 대상으로 측정한 스펙트럼은 N개의 성분이 갖는 고유 스펙트럼 데이터의 선 형 조합으로 표시된다는 가정 하에서 이루어진다. 주성분 분석을 이용한 데이 터의 분석은 각 시료 스펙트럼에 가장 큰 영향을 미치는 고유 스펙트럼을 구 하는 것으로 수학적으로는 각 파장 변수가 갖는 공분산 혹은 공상관 행렬의 분해를 통해 구한다. r개의 시료와 c개의 파장으로 구성되는 스펙트럼 행렬 X 가 주어질 경우 X의 공분산 행렬은 다음과 같이 정의한다. ′ (3-5)
T : 스코어 행렬(score matrix)(r×K),
P : 로딩행렬(loading matrix)(K×c),
E : 잔차 행렬(residual matrix)( × ), K≤min(r,c).
식 (3-19)에서 로딩벡터 는 cov(X)의 고유벡터(eigenvector)에 해당되며
각 에 대해 다음과 같은 관계가 있다.
(3-7)
여기서 번째고유값
로딩벡터는 일반적으로 로딩, 펙터(factor) 또는 주성분(principle component)
이라고 불리며, 스펙트럼 행렬 X를 에 투영한 것이 스코어벡터 이다. 즉, (3-8) 식 (3-21)에서 스코어와 주성분의 쌍은 고유 값 에 의해 정렬될 수 있으 며, 는 (, )에 의해 설명되는 스펙트럼 변이의 척도가 된다. 즉, 의 크 기에 따라 (, )가 정렬될 수 있기 때문에 첫 번째 쌍이 스펙트럼 행렬 분 해에서 가장 큰 정보를 가지게 된다. 두 번째 쌍은 X에서 첫 번째 쌍에 의한 변이를 제거한 후 남아있는 변이를 대상으로 구하기 때문에 두 번째로 큰 변 이를 포함한다고 말할 수 있다. 이와 같은 과정을 거치면 시료 스펙트럼 X가 원래의 파장 변수 c개 보다 훨씬 적은 K개의 주성분으로 차원 축소가 가능함 을 알 수 있다. 검량식 개발을 위해 사용된 시료의 성분 예측 값 은 다음과 같이 구할 수 있다.
(3-9) ′ ′ (3-10) 여기서 y=평균 보정 농도 벡터 q=농도데이터 로딩 벡터 미지 시료의 스펙트럼 데이터 를 이용하여 농도 를 예측하는 방법은 다음 과 같다. (3-11) ′ (3-12) (3-13) 식 (3-23)에서 계산된 농도 데이터 로딩벡터 와 스코어 벡터 를 이용하여 농도의 예측 값을 계산한다. (3-14) 여기서, : 검량식 개발 시료의 평균 농도, 검량식으로 구한 예측 농도
각의 뉴런은 여러 입력을 받지만 활성화 함수를 사용하여 하나의 출력신호만 을 생성한다 (Negnevitsky, 2004). 다층 신경망은 하나 혹은 그 이상의 은닉 층이 있는 피드포워드 신경망이다. 일반적으로 인공 신경망은 그림 18과 같이 공급 뉴런으로 이루어진 입력층과 계산 뉴런들로 이루어진 출력층, 그리고 그 사이에 있는 하나 이상의 은닉층으로 이루어져 있다.
Fig. 18 Back propagation neural network with 4 layers.
다층 신경망의 학습을 위해서는 역전파 알고리즘이 사용된다. 역전파 알고리 즘은 2단계로 구성된다. 우선 훈련 입력 패턴을 신경망의 입력층에 전달하고, 출력층에서 출력이 생성될 때까지 층에서 층으로 입력을 전파한다. 출력이 목 표값과 다르다면 그 오차를 계산한 후 출력층에서 입력층까지 신경망을 따라 거꾸로 전파하는데, 이 때 가중치가 수정된다. 인공신경망은 컴퓨터 시뮬레이션을 이용하여 문제를 해결하는 한 가지 기법으 로, 다차원의 데이터에 대해서 비교적 적은 계산량으로 양호한 해답을 얻을 수 있는 특징이 있다. 특히 데이터들 간의 모델을 만들기 어렵거나 복잡한 경 우 유용하게 사용될 수 있어 다양한 분야에서 활용되고 있다. Kang et al. (2006)은 인공신경망을 이용하여 영상자료를 통해 토지피복분류를 시도했고,
Sung과 Lee(2005)는 인공신경망 모형을 이용하여 벼 수확량 예측을 시도하 였다. Riul 등(2004)은 LB film과 LBL film을 이용하여 임피던스 검출방식으 로 6가지 레드와인을 각 다섯 병씩 30회 측정하여 총 900개의 와인 샘플을 데이터화 하여 ANN기술을 적용해 와인의 품종, 브랜드, 저장 방식 등이 식별 가능함을 보였다. Xin 등(2004)은 11 종류의 미네랄워터를 엔트로피 값을 바 탕으로 퍼지 신경망이론을 적용하여 종류별로 구분이 가능함을 보였다. Raptis 등(2000)은 숙성 와인의 성분을 정량분석하기 위하여 추출물의 맛과 향을 퍼지 이론과 인공신경망 방법을 이용하여 분석하였다. 또한 Verhagen와 Scott (2004)은 인공신경망을 이용하여 쥐의 시상하부 맛 반응을 분석하였다. 상기의 사례에서와 같이 다양한 조건에 의해서 나타나는 양상을 판단할 때 인 공신경망이 유용하게 사용될 수 있다.
3.5.3. 모델 성능 평가
개발된 회귀 모델의 성능 평가는 예측 정밀도(RMSEC, root mean square error of calibration), 실측치와 예측치의 상관성을 나타내는 상관계수(r,
correlation coefficient), 값의 선형적인 적합성을 나타내는 결정계수(R2,
(3-16)
(3-17) (3-18) yi = 측정된 주요인자 값 yci = 회귀모형식에 의한 예측값 y = y 값들의 평균값 n = calibration에 이용된 샘플 수 m = validation에 이용된 샘플 수 결정계수 R2가 1에 가까울수록, RMSEC, RMSEP의 오차가 0에 가까울수록 회귀식의 정확도는 높다. 예측 성능이 우수할수록 CV 값이 작아지고 서로 다 른 시료 혹은 한 시료에 대해 다양한 스펙트럼이 획득된 경우 모델 평가에 적 합해진다.3.6. 이미지 프로세싱
3.6.1. 이미지 프로세싱의 개념
일반 사진기로 촬영하여 얻은 사진 영상은 1800년대에 처음 등장하였는데, 최근까지 여러 측면으로 발전하였다. 처음에는 그림 19과 같이 흑백으로 된사진 영상이었으나, 오늘날에는 그림 20와 같이 실제 눈에 보이는 그대로 표 현하는 컬러로 된 사진 영상을 제공한다. 사진 영상 기술이 발전하면서 촬영 대상을 표현하는 방법은 더욱 정교해졌으며, 표현하는 색도 실제와 거의 차이 가 없다. 사진 영상은 물체에 반사되는 빛 신호를 표현한 것이다. 그런데 빛 신호는 아날로그 신호라서 이를 표현한 사진 영상도 당연히 아날로그 신호이다. 아날 로그 신호는 조작이 쉽지 않고 영구 보관하기도 어렵다. 그래서 사진처럼 아 날로그 영상을 조작해 변형하거나 영구적으로 보관하는 작업을 할 때는 특수 한 장비와 아주 전문적인 기술이 필요하다.
Fig. 20 Color photograph image. 이와 달리 디지털 신호는 아날로그 신호에 비해 장점이 많고, 아날로그 신호 에서도 쉽게 얻을 수 있다. 아날로그 신호로 구성된 사진 영상을 디지털 신호 로 변환한 게 바로 디지털 영상이다. 컴퓨터 기술이 발전하면서 데이터양이 많은 디지털 영상처리도 가능해졌다. 고속 및 대용량 데이터를 처리할 수 있 는 최신 컴퓨터로 인해 여러 가지 디지털 영상처리 기법을 사용 할 수 있게 되었으며, 그것을 활용할 수 있는 범위도 점차 넓어졌다. 디지털 영상은 다음 디지털 신호의 장점을 그대로 보인다. 디지털 데이터의 값이 명확하므로, 아날로그 영상보다 화질이 우수하며 컴퓨터 기술의 발전을 그대로 반영하였다. 그리고 디지털 데이터를 처리하는 여러 가지 방법으로 다 양한 영상처리 기술을 활용할 수 있으며, 디지털 데이터 저장장치를 이용하여 영구적으로 데이터를 저장할 수 있다. 또한 데이터 통신을 응용하는 분야에서 도 디지털 영상 전송을 가능하게 한다. 디지털 영상처리는 스캐너, 디지털 카메라 등으로 획득한 디지털 영상을 원 하는 목적에 맞게 조작하는 것이다. 원래 영상보다 품질이 높은 영상으로 변 환할 수 있으며, 오래되거나 전송 중에 변질 또는 훼손된 영상을 복원할 수도 있다. 또한 디지털 영상 내의 특징을 추출하여 활용할 수도 있고, 영상의 일부
분만으로도 새로운 영상을 생성할 수 있다. 이 밖에도 디지털 영상 데이터의 크기를 압축해 편리하게 저장과 전송을 할 수도 있다. 최근에 등장한 그림 21 과 같은 디지털 카메라는 누구나 조작하기 쉬워 이미 널리 대중화되었는데, 소비자의 관심을 디지털 영상처리 기술을 활용하는 방법에 집중시켰다. 점점 더 디지털 영상처리 기술을 활용하는 방법에 소비자의 관심은 집중될 것이고, 일상생활에서도 널리 활용될 것이며, 더 발전된 영상처리 기술을 요구할 것이 다.
Fig. 21 Digital camera.
3.6.2. 디지털 영상처리 기술
Fig. 22 Classification of digital image processing techniques. 컴퓨터를 이용해 디지털 영상을 분류하거나 판독할 수 있다. 이것을 하려면 디지털 영상이 지닌 속성을 수치화하거나 디지털 영상에서 특정 영역 등을 추 출하는 작업이 필요한데, 이 작업을 디지털 영상 분석(Digital Image Analysis)이라고 한다. 디지털 영상을 분석하는 데는 디지털 영상의 크기나 특정 영역의 크기를 알아내는 과정과 디지털 영상의 형태를 파악하는 과정이 필요하다. 이 밖에 그림 23과 같이 디지털 영상의 윤곽선을 찾거나, 색상 및 무늬를 구별하며, 질감을 알아내는 작업도 해야 한다. 이렇듯 디지털 영상을 분석하는 방법은 여러 가지이다.
Fig. 23 Examples of edge detection to analyze the digital image.
디지털 영상 인식(Digital Image Understanding)은 인식하려는 객체나 형상에 서 주요 속성을 추출하여 식별할 수 있는 클래스나 카테고리로 분류하는 기술
용량 면에서 유리하다. 네 번째 단계에서는 분할한 디지털 영상 데이터에서 지문의 특징을 추출한다. 그리고 마지막 단계에서는 카테고리나 클래스 내에 서 분류되었던 지문의 특징과 추출된 지문의 특징을 서로 비교하여 지문을 인 식한다. 그 결과 그림 24와 같이 디지털 이미지가 획득 된다.
Fig. 24 Example of fingerprint recognition to recognize the digital image.
3.6.3. 디지털 영상처리의 응용분야
멀티미디어는 텍스트 미디어, 사운드 미디어, 영상 미디어, 비디오 미디어 등 여러 미디어를 서로 조합한 것을 말한다. 이 중 영상 미디어(그중에서도 특히 디지털 영상 미디어)는 멀티미디어의 효율을 극대화시킨다. 멀티미디어는 많 은 분야에서 사용되므로 당연히 디지털 영상 미디어와 디지털 영상처리 기술 도 많은 분야에서 활용된다. 최근에는 일상생활 속에서도 디지털 영상처리 기술을 많이 응용하는데, 이는 일반 사용자도 웹에 디지털 영상을 쉽게 올릴 수 있게 되었기 때문이다. 앞으 로 UCC(User Created Contents, 사용자 제작 콘텐츠)가 많이 활성화되면 디 지털 영상 사용과 영상처리 기술에서 사용자의 요구는 더욱 증가할 것이다. 디지털 영상처리 기술은 방송과 영화 분야, 의료 산업 분야, 보안 응용 분야,출판 및 문서 제작 분야, 과학 분야, 군사 분야, 우주 원격탐사 분야 등에서 폭넓게 사용된다.(영상처리 입문, 신종홍 등, 한빛미디어)
Test Results
Appearance White beads
Substitution 0.71mmol/g
Bead Size 100-200 mesh
Swelling 6.9ml/g in DMF
Core Polymer PS crosslinked with 1% DVB
Loss on Drying 1.1% (Vacuum / 35℃/3hr)
Storage Keep cool and dry
Table 1. Specifications of the aminomethyl MPS resin used in the study
4. 재료 및 방법
4.1. 염료와 비드 결합체와 센서 어레이 제작
화학염료는 pH와의 반응성을 토대로 alizarin, calconcarboxylic acid, xylenol orange, phenol red, methylthymol blue, crystal violet, cresol red, fluorescein(Sigma-aldrich, MO, USA)을 선정하였다. 화학 염료의 구조는 그 림 25와 같으며 모든 염료들은 carboxyl group 또는 hydroxyl group의 작용 기를 가지고 있다. Carboxyl group과 hydroxyl group은 EDC crosslinker를 이용하여 amino group과 결합이 가능하기에(Panchaud A. et al., 2008, Shao-Hua C. et al.,2003) amino group이 표면 처리된 PS 마이크로 비드 (BeadTech, Seoul, Korea)를 사용하여 비드에 염료를 부착 한다. 이를 위한 마이크로 비드의 제원은 표 1과 같다.
Fig. 25 Chemical structure of selected dyes.
EDC 10mg/ml와 carboxyl 또는 hydroxyl group을 가진 염료 0.02M을 pH7의 MES buffer(Sigma-aldrich, MO, USA) 내부에서 약 15분간 18-25℃의 상 온에서 교반을 해주며 반응시켜 intermediate를 형성한 뒤 amino group이 표
Fig. 26 Prepared sensor array with eight dyes conjugated to micro beads.
4.2. 안정성 실험
결합된 염료-비드 결합체는 가역적인 반응에 의해서 결합이 끊어질 수 있기 때문에 pH를 적절하게 유지시켜야만 결합체를 유지 시켜줄 수 있다. 이를 위 해서 pH7의 PBS buffer에 염료-비드 결합체를 보관하였고 온도에 의해서도 결합이 영향을 받을 수도 있어 이에 대한 영향을 알아보기 위해 PBS buffer 10ml에 염료-비드 결합체 100mg을 넣고 4℃에서 냉장 보관했을 때와 상온 (20℃)에서 보관했을 때의 상층액의 색상을 측정하였다. 일주일 동안 하루에 한번 씩 Colormate(SCINCO., Korea, 그림 27)를 이용하여 380~780nm의 가 시광 영역의 투과 스펙트럼을 획득하여 L, a, b 색상 값으로 변화한 값을 보 고염료 유실량을 측정하였다.Fig. 27 The feature of ColorMate spectrometer.
4.3. 맛성분과 염료-비드 결합체와의 반응 특성
염료를 결합시킨 비드를 Colormate(SCINCO. Korea)를 이용하여 380～ 780nm의 가시광 영역에서 반사 스펙트럼을 이용하여 다음 맛성분의 농도와 의 파장별 상관관계를 분석하였으며 준비한 sucrose, fructose, glucose, citric acid, malic acid(Sigma-aldrich, MO, USA)을 3차 증류수를 이용하여 만든 희석액의 농도는 표 2와 같이 준비하였다.
ColorMate를 이용하여 스펙트럼을 획득하는 실험을 진행하기 위해서 기기와 연결된 컴퓨터의 전원을 켜고 광원 안정적인 작동을 위해 30분 이상 예열한 뒤, 280nm ~ 1000nm 파장의 투과 스펙트럼을 염료별로 획득하여 상관관계 분석에 이용하였다.
4.4. 화이트와인 맛 성분의 화학적 정량화
4.4.1. 화이트와인의 단맛과 신맛성분의 정량 실험 방법
본 연구에서 사용된 시료는 시중에서 판매되고 있는 20개의 화이트 와인이 며 시료를 혼합, 희석, 또는 성분을 추가하여 25개의 시료를 더 준비해 총 45 개의 와인 시료를 이용하여 실험을 진행하였다. 그림 28은 구입한 와인들이 다.와인의 sucrose, glucose, fructose, citric acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, acetic acid의 양을 HPLC (Agilent, HP1100, USA)를 이용하여 정량분석을 하였으며, 이 때 시료의 전처리 과정으로 0.45μ
m 크기의 syringe filter (WhatmanTM BIO, Buckinghamshire, UK)를 이용하
여 필터링을 거친 맑은 용액 2ml만을 분석에 사용하였다. 분석을 마친 각각의 당 성분은 당류간의 감미도(fructose=1.5, sucrose=1, glucose=0.75)를 적용 하여 그 합을 구하였고, 신맛은 유기산의 몰질량의 합으로 계산하였다. 실험에 사용한 HPLC 분석 조건은 표 3과 같고 그림 29에 HPLC 기기의 모습을 나타 내었다.
carbohydrate organic acid
Column BioRad Aminex-87-C BioRad Aminex-87-H
Solvent 3D.W 0.01N H2SO4
Flow rate 0.5ml/min 0.5ml/min
Temperature 80℃ 40℃
Injection volume 5μl 5μl
Table 3. Condition of HPLC for tastants analysis in white wine
4.4.2. 화이트와인의 탄닌 정량실험
탄닌은 분자량이 커서 HPLC를 통해 정량분석이 어려워 주석산 철 비색법을 주로 사용한다. 이를 위하여 간편하게 실험이 가능하도록 kit로 만들어진 tannin-lignin test kit(HACK, USA)를 구입하여 실험을 진행하였다. 정확한 측정을 위해 탄닌의 농도를 표 4와 같이 만들어 탄닌 용액 5ml에
TanniVerTM 3 Tannin-lignin Reagent를 한 방울 넣고 반응시킨 뒤 sodium
carbonate solution을 1ml 넣어주면 청색으로 변하게 된다. 이 변화 정도를 ColorMate 스펙트로미터로 투과도를 측정해서 탄닌의 양을 예측하는 선형 모 델식을 개발하고 이를 적용하여 화이트와인 시료들의 탄닌 함량을 예측하였 다.
Concentration(ppm)
Tannin 0.625 1.25 2.5 5 10 15 20 30
Table 4. Concentration of tannin used on tannin calibration model
화이트와인의 경우 일반적으로 탄닌의 양이 0.05~0.1%정도이므로 100분의 1로 희석하여 실험을 진행하였다.
4.5. 영상 획득 시스템 구축 및 분석 소프트웨어 개발
맛 성분 희석액과 반응한 색상 변화는 그림 30과 같이 광원과 RGB카메라 (A601fc Basler, Ahrensburg, Germany)를 세팅하며 카메라로 촬영하여 MATLAB R2011b(Mathworks, USA)으로 획득한 영역의 평균 색상값 R, G, B와 이를 변환한 H, S, V값과 희석액 농도와의 상관관계를 살펴보았다. 이를 위해 본 연구에서는 그림 31의 영상 획득 시스템을 이용하여 실리콘 아이솔 레이터를 이용해 제작한 센서 어레이에 염료-비드 결합체를 넣어준 뒤 반응 전의 색상 값을 측정하고 화이트와인 시료 100μl를 각 염료-비드 결합체에
Fig. 30 Schematics of image acquisition system of sensor array.
Fig. 31 Features of the measurement system by color change of dye.
위해 화이트 밸런스는 수동으로 설정하여 영상획득에 활용하였고 보다 정밀한 색상정보를 획득하기 위해 기기의 해상도는 VGA급 이상을 사용하였다.
Item Specification
Resolution horizontal/vertical 656 pixels x 490 pixels
Pixel Size horizontal/vertical 9.9 µm x 9.9 µm
Frame Rate 60 fps
Mono/Color Color
Interface FireWire-a
Housing Size (L x W x H) in mm 59 x 44 x 29
Lens Mount C-mount
Power Requirements 8-36 VDC
Power Consumption (typical) 1.7 W
Table 5. Specification of A601fc Basler camera
4.6. 통계적 기법을 이용한 데이터 처리
Artificial Neural Network Library 2.1.0 beta (http://leenissen.dk/fann/wp/) 을 사용하였으며 FANN은 C를 이용하여 다층 인공신경망을 구현한 오픈소스 라이브러리이다. 이를 위한 실험 조건은 표 6과 같다.
Variables Value
Learning rate 0.5, 0.7, 0.9
Activation function Sigmoid Linear
Number of first hidden
layers 5, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 21, 24
Number of second
hidden neurons 0, 5, 7, 9, 10, 13, 15, 17, 21, 24
