서
론
다국적 인간게놈연구사업 (HUGO)이 추진했던 인간게 놈프로젝트가 종료됨에 따라 방대한 염기서열이 해독되 었으며, 사람에 뒤이어 동물, 식물, 미생물의 유전체도 속 속 밝혀졌다. 이에 따라 사람을 비롯한 생명체의 유전질 환, 불치병, 식품유해 등을 진단 및 검지하고 생명현상을 분석하는 많은 장치들이 개발되고 있는데, 그 대표적인 것이 바이오칩의 등장이다 (박 등 2007). 바이오칩 제작 에서 고정화와 관련된 제반사항을 고려하지 않고 검출 기기의 감도 향상에만 관심을 기울여 왔다. 최근 검출기 ─ ─ 25 ──RI
검출 바이오칩의 혈관계 질환 발생 위험인자
검지에 대한 타당성 연구
고경철∙최미희∙박상현*∙조경현1∙이기택2 한국원자력연구원 방사선과학연구소 방사선생명공학연구부 1영남대학교 생명공학부, 2충남대학교 식품공학과Feasibility Study on RI Biochip Application to Detection
of Risk Factors of Atherosclerosis
Kyong-Cheol Ko, Mi Hee Choi, Sang Hyun Park*, Kyung-Hyun Cho1and Ki-Teak Lee2 Radiation Research Division for Biotechnology, Advanced Radiation Technology Institute,
Korea Atomic Energy Research Institute, Jeonbuk 580-185, Korea 1School of Biotechnology, Yeungnam University, Gyeongsan 712-749, Korea 2Department of Food Science and Technology, Chungnam National University,
Deajeon 305-764, Korea
Abstract -- Microarrays can be used to screen thousands of binding events in a parallel and high
throughput fashion and are of major importance in disease diagnosis and drug discovery. The use of radioisotope is conventionally regarded as one of the most sensitive detection methods. Ather-osclerosis is a common disorder affecting arterial blood vessels. It happens when fat, cholesterol, and other substances made in the arterial blood vessels form a hard substances called plaque. Lipo-protein-associated phospholipase A2(Lp-PLA2), a phospholipase A2enzyme, is used as a marker
for cardiac disease. The detection of Lp-PLA2was accomplished by using radioactive [3H-acetyl]
PAF as a substrate and a feasibility study on RI biochip application to detection of Lp-PLA2, a
risk factors of atherosclerosis was performed. Inhibitive activity of a native plant extract was also determined by using the RI biochip. It was found to be applicable to a high-throughput screening of inhibitors for developing atherosclerosis therapeutic agents.
Key words : Atherosclerotic disease, Lp-PLA2, Biochip, Detection method
* Corresponding authors: Sang Hyun Park, Tel. +82-63-570-3370, Fax. +82-63-570-3371, E-mail. [email protected]
기의 감도가 한계에 달한 시점에서 극미량 검출을 위한 최적의 센서를 구현하기 위하여 센서칩 제작기술에 많 은 연구가 요구되고 있다 (최 등 2007). 본 연구실에서는 생명과학용 바이오칩 개발을 위하여 컨텐츠 개발 및 고 감도의 방사성동위원소 (Radioisotope, RI) 검출기술에 관 해 연구하고 있다. RI를 이용할 경우 단백질의 상호작용 이나 기능을 고분해능 또는 고감도로 검출 및 분석이 가능하다 (Park et al. 2007; Ko et al. 2009).
최근 생활수준의 향상으로 인해 지방질의 과다섭취와 육류 소비량의 증가, 복잡한 사회생활에 따른 스트레스 는 심장 및 혈관계질환의 급격한 증가를 가져오게 되었 다 (박 등 2008). 최근, 미국을 비롯한 선진국에서는 심장 순환기 관련 질병과 관련된 사망률이 1위로 보고되고 있다 (Rosamond et al. 2007). 특히 2005년, ‘Archieves of Internal Medicine’에 발표된 연구를 통해 뇌졸중 환자 194명과 정상인 766명의 의료기록을 분석한 결과, 리포 단백질 관련 포스포라이페이즈 A2(lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp-PLA2)의 혈중수치가 높으면 뇌졸 중 위험이 2배 이상 높아지는 것으로 나타났다. 따라서, 혈액의 Lp-PLA2검사를 통해 심장혈관계질환 또는 뇌졸 중의 위험을 예측할 수 있다 (Packard et al. 2000). 또한, 최근 혈관계 질환의 예방 및 치료를 위해 Lp-PLA2을 목적으로 하여 이 효소의 활성을 저해할 수 있는 후보 물질을 천연 자생식물로부터 탐색하는 연구가 필요하다. 최근 식생활의 변화로 구미 각국뿐만 아니라 현재 우 리나라에서도 동맥경화, 고지혈, 고콜레스테롤에 의한 여 러 가지 혈관 성인병이 가장 심각한 문제로 대두되고 있기 때문에, 혈관질환 발생을 줄이기 위한 각종 기능성 식품 및 치료약제의 개발이 활성화되고 있다. 식물체 등 으로부터 추출된 혼합상태의 추출물 또는 합성된 물질 형태의 기능성 식품 및 치료약제의 개발에 필요한 혈관 계 질환 발생 위험인자 측정용 바이오칩과 같은 형태의 검지기술의 확립이 요구되나 국내에서의 연구는 활발하 지 않은 상황이다. 최근 연구를 통해 Lp-PLA2의 수준이 관상심장질환의 발병 위험률과 직접적인 관련이 있다고 보고되고 있다 (Macphee et al. 2001). 혈장의 Lp-PLA2는
platelet-activat-ing factor acetylhydrolase (Plasma PAF-AH)와 같은 효소 로서 약 80%가 저밀도 지질단백질 (LDL)에 존재하고, 나머지는 고밀도 지질단백질 (HDL)과 초저밀도 지질단 백질 (VLDL)에 분포한다. LDL이 산화되고 변형되기 전 까지 Lp-PLA2는 LDL에 잠복상태로 부착되어 있다가, LDL이 산화되면 활성화되어 산화된 인지질을 빠른 속 도로 분해하여 많은 양의 리소포스파티딜콜린 (lysophos-phatidylcholine, lyso-PC)과 산화된 유리지방산을 생성한 다. 특히 lyso-PC는 염증 유발성 (pro-infammatory) 및 전 죽종형성 (pro-atherogenic) 매개체로 보고되어 있다 (Jang et al. 2006). 이와 같이 LDL은 내막 (intima)에서 산화되 어 Lp-PLA2의 기질로 제공되고, 그 분해산물은 다시 마 크로파지 (macrophage)에 축적되어 만성 염증을 촉진하 고, 또한 마크로파지는 더 많은 Lp-PLA2를 생산하게 하 는 되먹이 기전 (feedback mechanism)이 혈관질환을 가 속화한다 (Macphee et al. 2001). Lp-PLA2는 관상동맥질환
의 독립적인 위험요인으로서, 동맥병변 (atherosclerotic lesion)의 마크로파지에서 발견된다. 따라서 본 연구에서 는 삼중수소가 표지된 [3H]platelet activating factor (PAF,
1-O-alkyl-2-[3H-acetyl]-sn-glycero-3-phosphocholine)을 이용하여 혈중 Lp-PLA2의 활성도를 측정하는 혈관계 질환 발생 위험인자의 검지기술과 Lp-PLA2의 활성을 저해할 수 있는 천연물 추출물을 위한 초고속탐색 (High-Throughput Screening, HTS)에 이용될 수 있는 프로토타 입의 바이오칩을 개발하고자 하였다.
재료 및 방법
1. Lp-PLA2의 반응 조건 확립 및 저해제 탐색 Lp-PLA2의 반응 조건을 확립하기 위하여 효소원으로 인간 LDL 분획 (1.019⁄d⁄1.063)을 초원심분리를 통하 여 분리하고, PBS 완충용액에 투석한 후, 단백질을 정량 하여 2 mg ml-1의 농도로 조정하였다. 기질 용액으로서Platelet activating factor-16 (Calbiochem, MA, USA)와 [3H]-Platelet activating factor [NET-910, 0.1 mCi (3.7 MBq)
ml-1]를 각각 12.5μM과 10 μl [1 μCi (37 kBq)] 혼합하여 질소가스 하에서 건조시킨 후, 3.2 ml의 PBS/EDTA 완충 용액 (pH 7.4)을 첨가하여 현탁액을 만들었다. 반응 튜브에 LDL 효소원 (10μl, 20 μg)과 PAF 기질용 액 [0.3μCi (11.1 KBq) ml-1, 150μl]을 혼합하여 37�C에서 1시간 반응시킨 후, 유기용매 (클로로포름 : 메탄올, 2 : 1 v/v)를 600μl 첨가하여 반응을 종료시키고 교반과 원심 분리 (3,000×g)를 통하여 회수된 상층의 수용액 중 150 μl를 취하여 클로로포름 용액 150 μl와 혼합하여 교반과 원심분리를 하였다. Lp-PLA2의 저해제 탐색을 위한 실 험에서는 상기와 같이 확립된 반응 조건 하에, 저해제원 으로 다양한 농도의 식물추출물 시료 10μl를 첨가하여, Lp-PLA2의 저해 활성이 있는지를 조사하였다. 회수된 수용액상의 100μl를 취하여 신틸레이션 유리병에 옮기 고 액체 신틸레이션 칵테일 3 ml을 가하여 액체 신틸레 이션 섬광계수기 (Liquid Scintillation Counter, Beckman
LS6500, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 시간당 생성되 는 [3H]-acetate의 양을 측정하여 Lp-PLA 2의 활성을 계 산하였다. 2. RI 검출기술이용 혈관계질환 검출의 바이오칩 유효성 검증 [3H-acetyl]PAF를 알데히드 처리된 슬라이드글라스 칩 위에 올리고, 그 칩을 상온의 습윤 챔버 안에서 1시간 동안 고정화한 후, Lp-PLA2가 포함된 인간 혈장 (human plasma) [대한적십자사 전북적십자혈액원] 및 선정된 식 물추출물 저해제와 반응을 하여 바이오칩에 방사성동위 원소 [3H-acetyl]PAF의 적용 유효성을 검증하였다. 슬라 이드에 고정된 기질인 [3H-acetyl]PAF로부터 생성된 상 측액의 [3H]acetate을 제거하고 남아있는 방사선의 강도 를 측정하기 위해, 상기 반응시킨 바이오칩을 X-선 필름 또는 방사형광분석기 (Bioimage Analyzer BAS1500, Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)용 스크린에 감광하여 방사선
강도를 측정하였다. 전체적인 [3H]PAF를 이용한 Lp-PLA 2 의 검출 및 저해제 발굴에 대한 개요는 Fig. 1에 나타내 었다.
결과 및 고찰
상기에 설명한 것과 같이 확립된 반응 조건 하에, 저 해제원으로 자생식물 추출물 시료 (한국생명공학원 자생 식물이용기술개발사업단)를 10μl의 부피로 다양한 농도 로 첨가하여, Lp-PLA2의 저해 활성이 있는지를 조사하 였다. Lp-PLA2의 반응조건은 0.3μCi (11.1 KBq)의 기질 조 건에서 더 우수한 활성이 검출되어 반응조건을 확립하 였고 (Fig. 2), 확립된 조건을 저해제 검색 시스템에 적용 하였다. 저해제로는 다음과 같은 식물 추출물이 사용되었 다. 독활 뿌리 (S/N1, PB3983.4), 팔손이 줄기-심재 (S/N2, PB3966.2), 팔손이 줄기-수피 (S/N3, PB3966.3), 두릅나무 줄기 (S/N4, PB3980.1), 오갈피 줄기 (S/N5, PB3973.1), 송 악 줄기 (S/N6, PB3964.5), 가시오갈피 잎/줄기 (S/N7, PB3977.1), 팔손이 열매 (S/N8, PB3966.4), 외대잔대 전 초 (S/N9, PB4737A1), 황칠나무 줄기 (S/N10, PB3965.2), 지리산오갈피 줄기(S/N11, PB3975.1), 섬오갈피 잎(S/N12, PB3972.1), 섬오갈피 줄기 (S/N13, PB3972.2), 지리산오갈 피 줄기(S/N14, PB3975.2), 황칠나무 잎(S/N15, PB3965.3), 음나무 줄기-수피 (S/N16, PB3967.7), 땃두릅나무 잎 (S/N17, PB3970.1), 땃두릅나무 줄기 (S/N18, PB3970.2), 음나무 줄기-수피 (S/N19, PB3967.6), 넓은잔대 지하부 (S/N20, PB4729.2), 더덕 지상부 (S/N21, PB4754.1), 두릅 나무 뿌리-근피 (S/N22, PB3980.8), 팔손이 잎 (S/N23, PB3966.5), 팔손이 줄기 (S/N24, PB3966.6), 넓은잔대 지 상부 (S/N25, PB4729.3), 더덕 지하부 (S/N26, PB4754.3), 두릅나무 잎 (S/N27, PB3980.9), 모시대 지상부 (S/N28, PB4738.1), 모시대 지하부 (S/N29, PB4738.2), 오갈피 잎/ 줄기 (S/N30, PB3973.2), 음나무 잎/줄기(S/N31, PB3968.8), 인삼 뿌리-주근 (S/N32, PB3984.1), 인삼 뿌리-실뿌리 (S/ N33, PB3984.2), 독활 잎/줄기/열매 (S/N34, PB3983.5), 음 나무 잎(S/N35, PB3967.9), 만삼 지상부(S/N36, PB4756.1) 등 총 36종의 식물 추출물을 대상으로 Lp-PLA2저해효 과를 조사하였다 (Table 1). Table 1의 모든 시료를 메탄올에 녹이고 0.1 mg ml-1 과 0.01 mg ml-1의 농도시료로 희석하여 10μl씩 처리한 결과 1~15, 25~36의 시료에서 30% 이상의 활성을 얻 Substrate concentration 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 20 40 60 80 [ 3H]-acetate CPM 0.15μCi 0.3μCiFig. 1. Scheme of detection of Lp-PLA2using 1-O-alkyl-2-[3
H-acetyl]-sn-glycero-3-phosphocholine. 3H Reaction [3H]PAF Plasma Inhibitor Detection - ++ ++ - - ++ 3H 3H 3H 3H
을 수 있었다 (Fig. 3). 이 결과들로써 Lp-PLA2의 저해제 를 검색할 수 있는 활성 검색체계가 확립되었고, 이를 바탕으로 새로운 저해제의 스크리닝에도 효과적으로 적 용이 가능함을 확인하였다. 이 결과들로써 Lp-PLA2저 해제를 검색할 수 있는 활성 검색체계가 확립되었고, 분 리되는 분획에 대한 검색이 추후 요구된다. 또한, Lp-PLA2가 포함된 인간 혈장 및 선정된 특정 자생식물 추출물 저해제 스크리닝에 대해 바이오칩의 방사성동위원소 [3H-acetyl]PAF의 적용 유효성을 검증 하기 위하여 Fig. 1의 모식도를 바탕으로 실시하여 Fig. 4에 결과를 나타내었다. 양성대조군인 [3H-acetyl]PAF (a-1)와 달리 인간 혈장으로 반응 시킨 a-2의 기질에는 방 사성 신호 (radioactive signal)가 검출되지 않았다. 이것은 인간 혈장에 포함되어있는 Lp-PLA2가 [3H-acetyl]PAF로 부터 [3H]acetate를 제거하였기 때문이다. 또한, [3 H-ace-tyl]PAF의 적용 RI 바이오칩을 이용한 저해제 스크리닝 유효성을 검증하기 위하여, 자생식물 추출물 중 저해활 성도가 높은 모시대 (S/N28, PB4738.1)를 선정하여 인간 혈장과 함께 첨가하여 반응을 하였다. 그 결과 인간혈장 으로만 반응시킨 b-1의 기질에는 방사성 신호가 검출되 지 않았고, 모시대를 첨가한 b-2의 기질에는 방사성 신 호가 그대로 남아있었다. 자생식물 추출물인 모시대는 인간 혈장에 들어있는 Lp-PLA2가 기질인 [3H-acetyl]PAF 로부터 [3H]acetate를 제거하지 못하도록 저해했음을 알 수 있다. 자생식물 추출물을 바이오칩 반응에 적용 시 높은 재현성 실현을 위하여 유기용매에 의한 추출물 외 에 열수추출법에 의한 자생식물 추출물의 획득도 요구 되어 진다. 따라서, 본 연구의 RI검출 바이오칩의 혈관계 질환 발 생 위험인자 검지기술은 혈관계질환의 저해제에 대한 HTS에 활용될 수 있을 것이다.
사
사
이 연구는 교육과학기술부에서 시행하는 원자력연구 개발사업의 일환으로 수행되었습니다.Table 1. Samples of native plant extracts
S/N Bar code Description 1 PB3983.4 Aralia continentalis 2 PB3966.2 Fatsia japonica 3 PB3966.3 Fatsia japonica 4 PB3980.1 Aralia elata 5 PB3973.1 Acanthopanax sessilifolrus 6 PB3964.5 Hedera rhombea 7 PB3977.1 Acanthopanax senticosus 8 PB3966.4 Fatsia japonica
9 PB4737A1 Adenophora racemosa
10 PB3965.2 Dendropanax morbifera 11 PB3975.1 Acanthopanax chiisanensis 12 PB3972.1 Acanthopanax koreanum 13 PB3972.2 Acanthopanax koreanum 14 PB3975.2 Acanthopanax chiisanensis 15 PB3965.3 Dendropanax morbifera 16 PB3967.7 Kalopanax pictus 17 PB3970.1 Oplopanax elatus 18 PB3970.2 Oplopanax elatus 19 PB3967.6 Kalopanax pictus
20 PB4729.2 Adenophora divaricata var. manshurica
21 PB4754.1 Codonopsis lanceolata
22 PB3980.8 Aralia elata
23 PB3966.5 Fatsia japonica
24 PB3966.6 Fatsia japonica
25 PB4729.3 Adenophora divaricata var. manshurica
26 PB4754.3 Codonopsis lanceolata 27 PB3980.9 Aralia elata 28 PB4738.1 Adenophora remotiflora 29 PB4738.2 Adenophora remotiflora 30 PB3973.2 Eleutherococcus sessilifolrus 31 PB3968.8 Kalopanax pictus 32 PB3984.1 Panax ginseng 33 PB3984.2 Panax ginseng 34 PB3983.5 Aralia continentalis 35 PB3967.9 Kalopanax pictus 36 PB4756.1 Codonopsis pilosula 0 -30 -20 -10 10 20 30 40 50 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 Sample number % Inhibition 0.1 mg ml-1 0.01 mg ml-1
Fig. 3. Inhibitive activities of native plant extracts (0.1, 0.01 mg
ml-1) against Lp-PLA 2.
(a) (b)
1 2 1 2
Fig. 4. Detecting Lp-PLA2and inhibitive activity using a
radioiso-tope for RI biochip. a-1: positive control ([3H-acetyl]PAF);
a-2 & b-1: [3H-acetyl]PAF++serum; b-2: [3H-acetyl]PAF++
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Manuscript Received: February 5, 2009 Revision Accepted: March 16, 2009
