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이학 석사학위 논문
C57BL/6J 쥐에서 고지방식이에 의해
유도된 비알코올성 지방간에 대한 SFC
약물의 보호 효과
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
홍 승 아
C57BL/6J 쥐에서 고지방식이에 의해
유도된 비알코올성 지방간에 대한 SFC
약물의 보호 효과
지도교수 강 엽
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2019 년 8 월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
홍 승 아
i
국문요약
비알콜성 지방간질환(Non-alcoholic fatty liver disease, 이하 NAFLD)은 간세포에 지방의 축적만 있는 단순 지방증과 간세포의 괴사, 염증, 간 섬유화를 동반하는 비알콜성 지방간염(Non-alcoholic steatohepatitis, 이하 NASH) 그리고 간 경변증을 포함하는 질환을 의미한다(Browning et al., 2004). 이 병증은 대부분의 선진국에서 흔히 찾을 수 있는 간질환으로 미국의 경우 2017 년에 75 에서 100 만의 인구가 NAFLD 를 앓고 있으며(Rich et al., 2018) 2017 년 기준 전 세계적으로 24%의 인구가 이 병증을 가진 것으로 추산된다(Younossi et al., 2018). 지금까지 밝혀진 NAFLD 의 원인은 다양하며 그 중 유전적 요인과 인슐린 저항성 및 대사질환을 제외하고 주목되는 발병원인은 고지방 및 고과당 섭취에 의한 것이다(Rinella and Sanyal, 2016). 또한 NAFLD 는 단순 지방증에서 약 12-40%의 환자가 NASH 로 진행(Ekstedt et al., 2006)되며 여기서 15-25%의 환자는 간 경변증으로 진행된다(Oliveira et al., 2016). 단순 지방간에서 지방간염 및 간 경변증으로 진행되는 과정은 명확히 밝혀진 것이 없으나 최근까지 밝혀진 요인 중 주목하고 있는 것이 지방산의 과도한 유입에 의한 지방 독성이다(Matteoni et al., 1999). 따라서 앞서 진행된 선행 연구를 통해 얻은 SFC(Sodium Fluorocitrate, 이하 SFC)라는 약물이 이자의 베타세포가 지방독성에 의한 세포사에 이르는 것을 막는 결과(Jung et al., 2017)를 바탕으로 이 약물을 간 세포에 적용하여 NAFLD 도 개선시킬 수 있을지 확인해보았다. 먼저, HepG2 간세포에서 SFC 가 지방산 유입에 의한 지방독성을 막는지 확인해 보았다. SFC 는 HepG2 세포 내로 유입되는 BODIPY-C16 과 지방산
ii 유입에 의한 지방축적을 감소시켰다. 또한, SFC 는 palmitate 에 의해 유도되는 스트레스와 염증 및 세포사멸을 줄이는 것을 확인하였고 더불어 지방산에 의해 감소된 인슐린 신호전달을 회복시키는 것으로 확인되었다. 그리고 C57BL/6J 쥐를 15 주 동안 고지방식이를 통해 NAFLD 환자 모델을 만들어 약물의 효과를 실험해본 결과 고지방식이에 의해 증가된 간 무게와 TG 를 감소시켰고 염증에 관련된 발현을 줄였으며 간 손상 또한 감소시켰다. SFC 는 고지방식이로 유도된 인슐린 저항성과 고혈당을 막았으며 NAFLD 관련된 모든 마커를 줄였다. 따라서, SFC 는 간세포 내로 유입되는 지방산의 흡수를 저해하는 결과를 바탕으로 고지방식이에 의해 유도되는 NAFLD 를 예방하는 하나의 약물로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 핵심 단어: 비알콜성지방간증, 지방독성, SodiumFluorocitrate, 간, 제 2 형 당뇨
iii
차 례
국문요약... i 그림 차례 ... vi 도표... viii 약어... x Ⅰ. 서론 ... １ Ⅱ 연구 재료 및 방법... ４ A. 연구 재료 ... ４ B. 연구 방법 ... ４ 1. 세포주 및 세포배양 ... ４ 2. Palmitate 제작 ... ５ 3. SFC 제작 ... ５ 4. 쥐 조직에서 BODIPY-palmitate 유입 확인 ... ５ 5. HepG2 세포에서의 palmitate 흡수 분석 ... ６ 6. MTT 를 이용한 cell viability 분석 ... ６ 7. DNA fragmentation 분석 ... ６ 8. TG 측정 ... ７ 9. Immunoblotting ... ８iv
10. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction ... ８ 11. 동물모델 제작 ... ８ 12. 인슐린 측정 ... ９ 13. 포도당, 인슐린, 피루브산 내성 실험 ... １０ 14. 혈액 샘플에 대한 생화학적 분석 ... １０ 15. Oil Red O 염색 ... １０ 16. Nile Red 염색 ... １０ 17. F4/80 염색 ... １１ 18. 통계 분석 ... １１ Ⅲ. 결과 ... １２ A. SFC 의 지방산 흡수 억제 효과를 간세포에서 확인 ... １２ B. Palmitate 에 의해 유도된 지방독성을 SFC 가 예방하는지 간세포에서 확인 ... １８ C. 고지방식이에 의해 유도된 단순 지방증에 대한 SFC 의 예방효과를 C57BL/6J 쥐에서 확인 ... ２５ D. 고지방식이에 의해 유도된 간 염증을 SFC 가 감소시키는지 C57BL/6J 쥐에서 확인 ... ３１ E. 고지방식이에 의해 유도된 고혈당증에 대한 SFC 의 예방효과를 C57BL/6J 쥐에서 확인 ... ３７ Ⅳ 고찰 ... ４１ Ⅴ 결론 ... ４５
v
참고문헌... ４７ 영문요약... ４９
vi
그림 차례
그림 1 C57BL/6J 쥐 조직에서 SFC 에 의한 BODIPY-PA 감소 확인. ... 1 4 그림 2. 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인. ... 1 5 그림 3. 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인. ... 1 6 그림 4 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인. ... 1 7 그림 5 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인. ... 2 0 그림 6 SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의해 유도되는 지방독성에 의한 cell viability 회복 확인... 2 1 그림 7 SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의한 지방독성 개선 확인. ... 2 2 그림 8 SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의한 염증 관련 유전자 발현이 감소하는 지 확인. ... 2 3 그림 9 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 몸무게 변화와 먹이 섭취량 확인. ... 2 7 그림 10 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 조직 무게 측정. ... 2 8 그림 11 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에 축적된 지방량 비교. ... 2 9 그림 12 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 발현된 지방대사 관련 유전자 비교. ... 3 0vii 그림 13 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 F4/80 면역염색. ... 3 3 그림 14 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간에서 염증 관련 단백질량 비교 및 인슐린 신호전달계 회복 확인. ... 3 4 그림 15 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 발현되는 염증 및 간 섬유화 관련 유전자 비교. ... 3 5 그림 16 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 염증 수치 확인. ... 3 6 그림 17 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 공복 혈당 및 공복 인슐린 분비 비교. ... 3 9 그림 18 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 항당뇨 효과 확인. ... 4 0
viii
도표
도표 1. Quantitative real time-PCR 에 사용한 Primer 서열과 목록
유전자 GenBank Accession No Forward (5'-3') Reverse (5'-3') Ampli con size SREBP1 c NM_0011480.4 GCTGTTGGCATCCTGCTATC AGCTGGAAGTGACGGTGGT 174 FASN NM_007988.3 CCTGGATAGCATTCCGAACCT AGCACATCTCGAAGGCTACAC A 122 Acaca NM_133360.2 ACATCCCCACGCTAAACAGA GTGCAACTAGGAACGTAAGT 420 SCD1 NM_009127.4 CACACGCCGACCCTCACAAT TTTGACAGCCGGGTGTTTGC 86 MCP-1 NM_011333.3 CAGCCAGATGCAGTTAACGC GCCTACTCATTGGGATCATCT TG 73 TNF-α NM_013693.2 AGCCCCCAGTCTGTATCCTT GGTCACTGTCCCAGCATCTT 113 IL-1β NM_008361.3 TCTCGCAGCAGCACATCAACA CCTGGAAGGTCCACGGGAAA 105 IL-6 NM_001314054.1 CCATCCAGTTGCCTTCTTGGG GCCGTGGTTGTCACCAGCAT 45 TIMP NM_001044384.1 TCCCCAGAAATCAACGAGAC CATTTCCCACAGCCTTGAAT 88 CTGF NM_010217.2 CTTTCTGGCTGCACCAGTGT GGCAGAGTGGTGGTTCTGTG 102 COL1A2 NM_007743.3 CTGGGTGAACCTGGTCCTCT ACCAGGGGCACCATTAACTC 100 COL3A1 NM_009930.2 GTCCAAAGGGTGAAGTCGGT CAGCTCCACCTCTAGCACCA 125
ix
도표 2. Immunoblotting 에서 사용한 항체 목록
항체 회사명 카탈로그 번호
cleaved caspase 3
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)
9661 phospho-AKT 9271 total AKT 9272 phospho-GSK3a/β 9331 total GSK3β 9315 phospho-JNK 9251 total JNK 9252 phospho-P65 3033 total P65 3034 actin Bethyl laboratories(Montgomery, TX, USA) A300-491A
tubulin Santa Cruz Biotechnology
(Dallas, TX, USA) 5286
F4/80 Thermo Fisher Scientific
x
약어
NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease
NASH Non-alcoholic steatohepatitis
PA Palmitate
B-PA BODIPY-Pamlitate
SFC Sodium fluorocitrate
B-fat Brown fat
P-fat Perirenal fat
E-fat Epididymal fat
H&E Hematoxylin & Eosin
Sal Normal Saline
TG Triglyceride
NADH Nicotinamide adenine dinucleotide
SREBP1c Sterol regulatory element-binding
protein1c
FASN Fatty acid synthase
Acaca Acetyl-CoA carboxylase
SCD1 Stearoyl-CoA desaturase-1
MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1
TNF-α tumor necrosis factor-alpha
IL-1β Interleukin 1 beta
IL-6 Interleukin 6
TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 CTGF connective tissue growth factor
xi
COL1A2 Collagen, type I, alpha 2 Chain COL3A1 Collagen Type III alpha 1 Chain
１
Ⅰ. 서론
NAFLD 는 현재 전 세계적으로 문제가 되는 대사질환 중 하나로 단순히 간 세포에 지방의 축적만 있는 단순 지방증과 간세포의 염증과 섬유화 등을 동반하는 NASH 및 간 경변증을 포함한다(Browning et al., 2004). 지방간의 발병기전과 단순 지방간에서 간경변증까지 진행되는 과정에 대해서는 아직 연구가 진행되고 있지만 최근까지 밝혀진 원인은 유전과 환경적인 요인, 간 세포에서 지방의 과축적, 인슐린 저항성, 지방독성 등이 있다. 고지방 식이는 일반적으로 비만과 함께 NAFLD 의 발병을 유래한다(Adams et al., 2005). 지방 조직에서 간으로 다량의 지방산이 축적되는 것이 NAFLD 의 원인 중 하나라고 생각한다. 섭취된 지방이 에너지로 이용된 후 남은 지방은 지방세포에 축적되어 염증과 인슐린 저항성을 유발하고 호르몬 민감 lipase 의 활성으로 지방을 분해해 지방산을 만들고 혈중 지방산의 농도를 높인다. 혈중의 지방산은 간세포로 유입되어 미토콘드리아에서 지방산 산화가 일어나 에너지로 사용하게 되거나 지방합성 과정을 통해 중성지방이 생성되는데 이 과정에서 생기는 중간 산물들인 ceramide 나 diacylglycerol 등의 지질은 지방독성을 유발하여 ER 스트레스, 산화 스트레스, 염증세포의 활성화를 일으키고 세포사멸도 유도한다(Jou et al., 2008; Bosma et al., 2012; Ipsen et al., 2018). 이 과정에는 Free fatty acid 의 지질에 의한 형질막에 손상을 일으켜 리소좀의 투과성을 높여 세포 독성을 일으키는 과정과 염증에 관련된 핵 수용체나 사이토카인의 합성을 촉진시켜 세포사멸을 유도하는 과정 그리고 과도한 지방산의 유입으로 발생한 NADH 가 세포 내의 ROS 를 증가시켜 산화２
스트레스를 유발해 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하고 결국 세포자살을 유도하는 과정 및 ER 스트레스로 인한 스트레스 신호가 증폭되어 결국 간에서의 간 염증 및 간세포 사멸을 일으킨다고 알려져 있다(Krebs and Hilton, 2000).
또한 TG 합성 중 생기는 중간 산물은 염증 신호를 유발하는 과정 중 Protein kinase C(PKC), c-Jun N-terminal kinases (JNK), IκB kinase (IKK)의 활성을 올리고 이런 serine kinase 는 결국 인슐린 신호전달계를 방해해 인슐린 저항성을 유도한다(Sanyal et al., 2001). 다양한 원인에 의해 유도된 인슐린 저항성은 간에서 지방합성을 증가시키는데 이중 생성되는 지방대사 중간물질에 의해 지방 독성을 또 증가시키게 되는 악순환을 반복하게 된다. NAFLD 를 치료하지 않으면 위 과정에 의해 상당히 높은 환자들이 NASH 로 병이 진행되며 이중 15~25%의 환자가 간 경변증으로 병이 심화되니(Oliveira et al., 2016) 간세포로의 지방산 유입의 억제는 고지방식이에 의해 유도된 NAFLD 를 개선시키는 데 중요한 과정이라 생각한다.
SFC 는 TCA cycle 에서 citrate 가 isocitrate 로 변하는 과정에서 citrate 를 cis-aconitate 로 구조를 변형시킬 때 사용되는 효소인 aconitase 를 저해하는 저해제로 알려져 있다. 앞서 진행된 연구에 의해 낮은 농도의 SFC 는 palmitate 에 의한 지방독성으로 유도된 췌장의 베타세포 죽음을 보호하는 효과가 있음을 보여주었고 BCH 와 같은 TCA cycle 에 영향을 주는 다른 약물보다 더 지방산 독성에 의한 세포사를 효과적으로 막는 것을 보여주었다. 낮은 농도의 SFC 는 aconitase 의 억제제로서 세포사멸을 보호하는 것이 아니라 지방의 흡수를 억제하여 베타세포의 죽음을 보호하였다(Jung et al.,
３
2017). 이런 결과를 바탕으로 이 연구에서는 간 세포에 적용하여 SFC 가 간세포로 유입되는 Free Fatty acid 을 억제하는지 조사하였다. palmitate 에 의해 유도되는 지방독성도 감소시키는 지 확인을 하고 C57BL/6J 쥐를 15 주 동안 고지방식이를 섭취하게 하여 만든 NAFLD 모델에 SFC 를 주사하여 NAFLD 에 관련된 마커들을 SFC 를 주사하지 않은 대조군에 비해 효과적으로 낮추는지 검증하여 SFC 가 고지방식이에 의해 유도된 NAFLD 를 개선시키는지 밝히고자 하였다.
４
Ⅱ 연구 재료 및 방법
A. 연구 재료
이 연구에서 사용된 약재 glucose, palmitate, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoilium bromide (MTT), DL-fluorocitric acid barium salt, Oil Red O, Nile Red, hematoxylin, eosin Y 는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid (BODIPY™- C16, BODIPY-palmitate, B-PA)는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. Immunoblotting 에 사용된 항체 cleaved caspase 3, phospho-AKT, total AKT, phospho-GSK3b, total GSK3b, phospho-JNK, Anti-total JNK, Anti-phospho-P65, and Anti-Anti-total P65 는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. actin 은 Bethyl laboratories(Montgomery, TX, USA)에서 Anti-tubulin 은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
B. 연구 방법
1. 세포주 및 세포배양
인간 간 암 세포로 알려진 HepG2 세포는 DMEM 배지에 10% Fetal bovine serum (Capricon Sceintific, Ebsdorfergrund,
５
Germany), 100 U/ml penicillin (Duchefa Biochemie, Haarlem,
Netherlands)과, 100 μg/ml streptomycin (Duchefa
Biochemie)포함하여 37℃의 온도와 5% CO2 의 배양 조건에서
배양한다.
2. Palmitate 제작
Phosphate buffer saline 20ml 에 PA 를 20mM 의 농도로 70℃에 녹인 후 1M NaOH 를 200ul 넣어 비누화 과정을 30 분간 진행한다. Bovine serum albumin(BSA)를 비누화과정을 끝낸 PA 에 3:1 의 비율로 합성해 사용한다.
3. SFC 제작
DL-Fluorocitric acid barium salt 100mg (Sigma-ardrich)에 DIW (3 차 증류수) 1.2ml 를 넣어 풀어준 후 1N HCl 을 60.5ul 넣어준다. 용액이 투명해지면 anhydrous sodium sulfate 511.2ul, Anhydrous sodium carbonate 381.6ul 를 넣어 barium sulfate 를 만든다. Table centrifuge 를 이용해 50g 에서 1 분간 원심분리한 후 상등액을 모으고 남은 pellet 을 다시 DIW 에 녹여 50g 에서 1 분간 원심분리해 상등액을 같이 모아준다(pH 7±1). 4. 쥐 조직에서 BODIPY-palmitate 유입 확인 15~20 주 된 C57BL/6J mice 를 12 h 공복시킨 후 SFC 를 20 mg/Kg 로 복강 주사한다. 복강 주사한지 1 h 후 50 ug/mice 의 BODIPY-PA 를 꼬리의 정맥에 정맥주사하여 2 h 후 쥐를 희생시키고 각 조직을 분리한다. RIPA buffer 로 각각의 조직을 균질화 시킨 후 원심분리를 거쳐 상등액 100 ul 를 96 well plate 에
６
옮겨 담고 (Excitation) 480nm/(Emission) 515nm 파장에서 fluorescence spectrophotometer(PerkinElme Victor X3, Waltham, MA, USA)를 이용해 형광 측정한다.
5. HepG2 세포에서의 palmitate 흡수 분석
96well plate 에 well 당 2 × 104 씩 분주한 후 18 시간동안
incubation 한다. SFC 를 각 조건에 맞게 1 시간동안 전처리한다. 1 시간 후 BSA/PA 를 BODIPY C16(2.0uM)과 섞어 100uM 의 농도로 처리하여 uptake 를 3 시간 진행한다. 3 시간 후 용액을 전부 비운 후 PBS 로 1 회 washing 하고 PBS 100ul 를 채워 fluorescence spectrophotometer(PerkinElme Victor X3, Waltham, MA, USA)로 430/510nm 에서 형광을 측정한다.
6. MTT 를 이용한 cell viability 분석
96well plate 에 MTT(0.5mg/ml)의 농도로 처리한 후 37℃에서
1 시간동안 반응시킨다. 상등액을 모두 제거한 후 100ul 의
isopropanol 을 각 well 에 넣어준 후 상온에서 30 분간
incubation 하여 570nm 에서 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용해 흡광도를 측정한다.
7. DNA fragmentation 분석
Cell death detection ELISA kit (Roche Applied Science., Mannheiem, Germany)를 사용하여 측정하였다. 세포를 96well plate 에 well 당 2 × 104씩 분주한 후 18 시간 동안 배양한다. 각
조건에 맞게 약재를 처리한 후 상등액을 제거하여 kit 에 제공된 lysis buffer 를 200ul 첨가하여 세포를 용해시킨다. 용해된 세포를 모아
７
1250g 에서 10 분간 원심분리 한 후 상등액의 20ul 만 취해 kit 에 제공된 plate 에 넣은 후 anti-histon 용액과 anti-DNA PODs 용액을 kit 에 제공된 incubation 용액에 넣어 각 well 에 80ul 씩 넣는다. 상온에서 2 시간 반응 후 incubation 용액으로 2 회 washing 하여 405nm 의 파장으로 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용해 흡광도를 측정한다.
8. TG 측정
세포는 1 × 104 만큼 12well plate 에 분주한 후 18 시간
incubation 한다. 이후 SFC 를 농도별로 1 시간 전처리 한 후 PA 를 100uM 처리하여 15 시간동안 지방을 흡수하게 하여 sample 을 준비하고 간 조직은 그룹 별 간을 100mg 으로 잘라서 준비한다. 각 sample 은 NP-40% buffer 1ml 을 넣어 homogenize 한다. 이후
80℃의 물에서 heating 하면서 sample 이 뿌옇게 될 때까지
heating 하고 상온에서 식힌 다음 모둔 TG 를 녹이기 위해 한번 더 heating 과정을 진행하고 다시 식힌 후 50g 에서 2 분간 원심분리해 상등액을 얻어 dH2O 에 10 배 희석해 sample 을 준비한다. 96well
plate 에 standard 를 0, 1, 2, 3, 5 nmol 이 되게 TG standard 를 TG assay buffer 에 희석해 준비하고 sample 은 TG assay buffer 62.5ul 에 2.5ul 씩 희석해 duplication 하여 well 에 분주한다. 이후 lipase 를 1ul 씩 standard 와 sample well 에 넣어 shaking 한 후 20 분간 상온에서 incubation 한다. TG reaction mixture (TG assay buffer: TG probe: TG enzyme mix=23: 1: 1)를 모든 well 에 넣어 pipetting 한 후 빛을 차단해 30~60 분간 상온에서 반응시킨 후 570nm 의 파장으로 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용해 흡광도를 측정한다.
８ 9. Immunoblotting
HepG2 세포에 각 실험 조건에 맞게 약제를 처리한 후 세포를 모아 RIPA buffer(1% triton X-100m 1% sodium deoxcolate, 50mM NaCl2, 50mM tris-HCl, 1mM sodium vanadate, 2mM PMSF,
protease inhibitor cocktail(Roche Applied Science)) 이용해 세포에서 단백질을 분리한다. 정량 후 sample buffer(50 mmol/l Tris-HCl at pH 6.8, 2% SDS, 100 mmol/l DL-dithiothreitol, 10%
glycerol)에 희석해 5 분간 끓인 후 8~12%의
SDS-polyacrylamid gel 에서 전기영동하여 단백질을 PVDF
membrane 으로 이동시킨 후 5% skim milk 로 blocking 한다. 각각 항체를 반응시킨 후 조건에 맞는 2 차 항체를 반응시켜 enhanced chemiluminescence system (Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용해 밴드를 확인한다.
10. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction
발현된 mRNA 양을 semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR, Takara RNA PCR kit Ver 3.0,
Takara, Shiga, Japan) 테크닉으로 비교한다. RNA 를
RNAiso(Takara, Shiga, Japan)로 추출한 후 정량하여 1ug RNA 를 RNase inhibitor 0.5ul, MgCl2 4ul, 2.5mM dNTP 4ul, 1000U AMV
0.5ul, Random 9mer 1ul, 10X RT buffer 를 이용해 cDNA 를 제작하여 도표 1 에 나온 primer 를 이용하여 mRNA 양을 비교한다.
９
8 주령 C57BL/6J male 쥐를 Japan SLC Inc(Shizuoka Ken, Japan)을 통해 주문하여 22 ± 2℃로 유지되는 사육실에서 12 시간 간격으로 light/dark cycle 을 맞춰 적응기간을 2 주 진행한다. 2 주 뒤 10 주령이 된 쥐를 무작위로 그룹당 8~10 마리로 3 개의 그룹으로(1. 대조군; 일반 사료(D12450B; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)와 생리 식염수 주사, 2. 고지방식그룹: 고지방 사료(D12492; Research Diets Inc)와 생리 식염수 주사, 3. SFC 그룹: 고지방 사료와 SFC 10mg/Kg 의 농도로 주사) 나눠 15 주동안 주 3 회 약물을 주입하고 몸무게는 주 1 회 측정한다. 혈당을 측정하기 위해 꼬리 정맥에서 피를 모아 Accu-check (Korea Roche Diagnostics, Seoul, Korea)을 사용하여 혈당을 측정하였으며 혈장 내 인슐린 양은 Shibayagi Mouse Insulin ELISA Kit(Cunma, Japan)를 사용해 측정하였다. 실험에 사용된 모든 동물은 아주대학교 실험동물 연구센터의 가이드라인을 따랐다 (허가번호: 2018-0046).
12. 인슐린 측정
Shibayagi Mouse Insulin ELISA Kit(Cunma, Japan)를 사용하여 측정하였으며, 쥐의 혈액을 4℃에서 3000g 로 10 분간 원심분리해 혈장을 얻는다. 키트에 포함된 Anti-Insulin coated plate 를 washing buffer 로 washing 한 후 Biotinylated anti-Insulin antibody 를 1:4000 의 농도로 buffer solution 에 희석하고 이를 plate 에 100ul 씩 넣어 shaking 한다. Standard Mouse Insulin solution 을 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 10ng/ml 의 농도로 plate 에 10ul 넣어 standard 를 정하고 sample 을 10ul 씩 plate 에 넣어 잘 섞어주어 plate 를 sealing 해 2 시간동안 incubation 한다. Plate well 을 washing buffer 로 washing 한 후 HRP-conjugated streptavidin 을 buffer solution 에
１０
1:2000 의 농도로 희석하여 100ul 넣어 30 분간 incubation 한다. Well 을 전부 washing buffer 로 washing 한 후 chromogen(TMB)를 100ul 넣어 발색을 30 분 진행한다. 이후 stop solution 을 100ul 넣어 반응을 중지시킨 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용해 450nm 에서 흡광도를 측정한다.
13. 포도당, 인슐린, 피루브산 내성 실험
쥐들을 6 시간 공복시킨 후 꼬리 정맥을 통해 초기 혈당을 측정한다. 이후 포도당 1g/Kg, 인슐린, 0.7U/Kg 또는 피루브산 1g/Kg 를 복강주사한 후 각 조건의 시간에서 혈당을 Accu-chek (Korea Roche Diagnostics, Seoul, Korea)를 이용해 측정한다.
14. 혈액 샘플에 대한 생화학적 분석
쥐의 꼬리 정맥에서 얻은 혈액을 4℃에서 3000g 로 10 분간 원심분리해 혈장을 얻는다. 혈장내 TG, 총 콜레스테롤, AST, ALT 를 autochemical analyzer(Cobas c111, Roche, Germany)를 이용해 확인한다.
15. Oil Red O 염색
간 조직을 OCT compound 에 넣어 얼린 후 5um 의 두께로 잘라 슬라이드에 붙여 10% formalin 용액으로 고정한다. 그리고 0.5% Oil Red O 용액으로 10 분간 염색한 후 물로 2 회 씻어 준 후 hematoxylin 용액(Abcam, Cambridge, UK)으로 핵 염색을 1 분간 진행한다. 이미지 스캔은 Aperio ScanScope CS (Leica, Wetzlar, Germany)를 이용한다.
１１
HepG2 세포에 PA 0,1mM 을 15 시간동안 처리한다. 이후 well 내의 용액을 모두 비운 후 DMEM 배지를 이용해 2 번 씻어준 다음 Nile Red 용액을 10 분간 incubation 한다. 염색된 지방은 confocal microscope (Zeiss LSM 710)로 540/630nm 에서 확인한다.
17. F4/80 염색
얼린 조직을 잘라 0.3% H2O2 용액에 30 분 담근 후 5% normal
bovine serum 으로 blocking 한다. EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1 antigenes(F4/80)를
anti-mouse F4/80 1 차 항체와 반응시킨 후 horse radish
peroxidase(HRP)-conjugated rabbit anti-rat IgG 2 차 항체와 반응시킨다. 3,3’-diaminobenzidine (DAB, DAB peroxidase substrate kit, Vector, Burlingame, CA, USA)를 이용해 갈색으로 색을 나타낸 후 hematoxylin 용액으로 1 분간 핵 염색을 진행한다. 이미지는 Aperio ScanScope CS (Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 확인한다.
18. 통계 분석
모든 실험은 3 번 반복 실험을 진행하여 통계처리 하였으며 data 는 SE 값으로 오차를 나타냈다. 모든 데이터는 GraphPad Prism 6.0 (GrahPad software, San Diego, CA)로 분석하였고, 두 데이터 그룹은 Student’s t test 를 이용하여 통계처리 했으며, 그보다 그룹이 많을 경우 analysis of variance (ANOVA) with Boferroni post hoc test 를 이용해 통계처리 한다.
１２
Ⅲ. 결과
A. SFC
의
지방산
흡수
억제
효과를
간세포에서 확인
먼저, 10 주령 C57BL/6J male 쥐를 12 시간 공복시켜 복강 주사를 통해 SFC 를 20mg/Kg 농도로 주사한 후 한 시간 후에 꼬리 정맥을 통해 BODIPY-PA 를 50ug/mouse 로 주사하여 2 시간동안 PA 를 흡수시켰다. 이후 쥐의 각 조직을 취해 각 조직 별로 B-PA 의 흡수 정도와 SFC 로 인한 흡수 억제 효과를 분석하였다. 분석한 결과 흡수된 B-PA 는 간 조직과 지방 조직에서 주로 많이 흡수가 되었는데 SFC 에 의해서 특이적으로 간에서 B-PA 의 흡수가 저해된 것을 관찰하였다(그림 1). 오랜 공복 시 체내 필요한 에너지를 공급하기 위해 간에서는 일차적으로 glycogen 분해가 일어나고 저장된 glycogen 을 소모하고 난 뒤 gluconeogenesis 과정과 지방산화 및 ketone bodies 형성을 촉진시켜 에너지를 공급한다(Guan et al., 2009). 때문에 간으로의 지방 축적은 당연한 결과로 여겨진다. SFC 가 간에서 지방산의 유입을 억제한다면 지방산의 유입을 통한 지방간 형성을 제어할 수 있으므로 먼저 공복을 통해 지방조직에서 지방산을 생산하게 유도한 후 이 지방산이 간으로 유입되어 지방간이 된다고 알려졌는데 SFC 가 공복으로 유도되는 지방간의 형성을 막는지 조사하였다. 그림 2 에서 보듯이 SFC 는 공복으로 유도되는 지방의 유입 역시 억제하는 것을 보여줬으며, 간에서 지방 유입으로 인해 증가하는 중성 지방량 역시１３ 감소시키는 것으로 확인되었다. 두 결과를 바탕으로 SFC 가 간 세포에서 지방산유입을 억제하는 효과가 있을 것을 확신하여 간 세포인 HepG2 와 근육세포인 C2C12, 지방세포인 3T3L1 세포에서도 효과가 있는지 조사하였다. 그림 3 에서 보듯이 SFC 는 근육세포와 지방세포에서 지방산 유입 저해 효과는 없었으며 HepG2 세포에서만 지방산 유입 억제 효과를 나타내었다. HepG2 세포에 SFC 를 0.2mM 를 1 시간 전처리 한 후 PA 를 100uM 처리해 흡수시켰을 때. 확실히 세포 내로 들어오는 Free fatty acid 를 SFC 가 억제하는 것을 형광 현미경으로도 관찰할 수 있었다(그림 4).
１４ 그림 1. C57BL/6J 쥐 조직에서 SFC 에 의한 BODIPY-PA 감소 확인. 10 주령의 male C57BL/6J 쥐를 12 시간 공복시킨 다음 SFC 를 20mg/Kg 의 농도로 복강 주사한다. 1 시간 뒤 B-PA 를 50 ug/mouse 의 농도로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하여 2 시간동안 흡수시킨 후 각 조직에 흡수된 B-PA 를 480/515nm 의 파장대에서 형광을 측정하였다. 확인한 조직 중 특이적으로 간에서 증가된 B-PA 를 SFC 가 효과적으로 흡수를 억제한 것이 확인되었다. **p<0.01; ***p<0.001 vs. B-PA-처리하지 않은 쥐 mice. ###p<0.01 vs. B-PA-처리한 쥐 그림 1 C57BL/6J 쥐 조직에서 SFC 에 의한 BODIPY-PA 감소 확인.
１５
그림 2. 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인. 10 주령의 male C57BL/6J 쥐를 normal saline 과 20mg/Kg 의 농도로 SFC 를 복강 주사한 후 15 시간 공복 시켰다. 이후 간을 적출하여 공복 시 간으로 지방이 유입되는 것을 Oil Red O 염색을 통해 확인하였다. 공복을 시킨 쥐는 세포가 전체적으로 lipid 의 droplet 이 많이 관찰되었으며 SFC 를 주사한 쥐는 normal saline 을 주사한 쥐에 비해 관찰되는 lipid droplet 의 개수와 크기가 준 것을 확인하였다. 또한 각 그룹의 간 100mg 을 취해 간에 축적된 TG 의 양을 확인하였는데, 공복으로 인해 증가된 TG 의 양이 SFC 를 주사한 그룹에서는 감소한 것을 확인하였다. *p<0.05 vs. 일반식이를 진행한 쥐, #p<0.05 vs. saline 을 복강 주사한 후 15 시간 공복시킨 쥐. 그림 2. 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인.
１６ 그림 3. 다양한 세포에서 SFC 에 의해 BODIPY-PA 흡수 억제 확인. 간 세포 HepG2 와 근육 세포 C2C12 그리고 지방 세포 3T3L1 에 SFC 를 0.1mM, 0.2mM, 0.4mM 을 전처리 1 시간을 거친 후 PA 를 100uM 농도로 처리하여 3 시간 동안 incubation 하여 형광을 측정한 그래프이다. 간 세포에서는 약물에 의해 농도의존적으로 PA 의 흡수가 감소된 것을 확인하였으나 근육 세포와 지방 세포에서는 SFC 의 효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다. **p<0.01; ***p<0.001 vs. B-PA-처리한 세포. 그림 2. 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인.
１７ 그림 4. HepG2 세포에서 SFC 에 의해 BODIPY-PA 흡수 억제 확인. HepG2 간 세포에서 SFC 를 0.2mM 을 1 시간 전처리 한 후 PA 를 100uM 처리해 흡수시킨 후 형광 현미경을 통해 이미지를 확인하였다. 세포내로 유입되는 PA 가 SFC 에 의해 억제되어 형광 감도가 매우 낮아졌음을 확인할 수 있었다. 그림 3 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인. : :
１８
B. Palmitate
에 의해 유도된 지방독성을
SFC 가 예방하는지 간세포에서 확인
간 세포에서 SFC 를 0.2mM 1 시간 전처리한 후 PA 를 100uM 처리하여 12 시간 동안 지방을 축적을 유도했을 때, PA 에 의해 축적되는 지방산의 양을 SFC 가 줄이는 것을 확인하였으며 PA 에 의해 유입되어 축적되는 중성 지방의 양 역시 감소시킨 것을 확인할 수 있었다(그림 5). PA 에 의해 HepG2 간 세포에 지방 독성을 일으킬 때, SFC 에 의해 지방 독성을 막는지 확인하기 위해 MTT viability assay 와 DNA fragmentation assay 를 진행하였다(그림 6). 약물 자체의 독성도 확인하기 위해 약물을 0.05mM 부터 0,1, 0.2, 0.4 mM 로 처리하였으며, SFC 를 농도별로 처리한 후 가장 효과적이게 지방 독성에 의한 세포 viability 를 회복하는 농도를 찾기 위해 SFC 를 농도별로 1 시간 전처리 한 후 PA 300uM 를 처리하여 실험을 진행하였다. 각 실험에서 지방 독성에 의한 cell death 가 SFC 에 의해 농도 의존적으로 회복됨을 확인할 수 있었다. 하지만 0.4mM 에서는 SFC 자체로 cell viability 가 감소하고 DNA fragmentation 가 증가한 것을 보였다. 따라서 가장 높은 지방 독성에 대한 보호 효과를 가지면서 세포의 viability 를 감소시키지 않는 농도인 0,2mM 을 최적의 농도로 생각하고 실험을 진행하였다. 세포의 지방 독성을 SFC 가 효과적으로 막는지 확인하기 위해 caspase3 단백질을 분석하여 다시 확인하였다(그림 7). 간 세포에 SFC 를 0.025, 0.05, 0.1, 0.2mM 을 1 시간 전 처리를 한 후 PA 를 300uM 처리하여 12 시간 동안 incubation 한 후 RIPA buffer 를 이용해 단백질을 추출하여 western blot 을 통해 caspase3 단백질을１９ 비교하였다. 지방 독성에 의해 세포가 죽으면서 세포 죽음에 연관된 단백질인 cleaved caspase 3 가 증가하였는데, SFC 를 처리하였을 때 농도 의존적으로 cleaved caspase 3 가 감소하였다. 지방독성을 유도하는 데 관련된 스트레스 및 염증 신호인 p-JNK 와 p-P65 의 양을 western blot 을 통해 조사하였을 때도 SFC 의 농도 의존적으로 감소하였다. 또한 지방 독성으로 유도되는 인슐린 저항성을 SFC 가 회복시키는지 확인하기 위해 p-AKT 와 p-GSK3α/β의 양을 확인한 결과 마찬가지로 SFC 농도 의존적으로 회복되는 것을 확인하였다. 또한 SFC 가 지방 독성으로 증가한 염증 관련 mRNA 의 발현양을 감소시키는 것을 확인하였다(그림 8).
２０ 그림 5. SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 유입에 의한 지방 축적이 억제되는 것을 확인. PA 에 의해 유도되는 지방축적을 SFC 가 저지시키는지 확인하기 위해 SFC 를 0.2mM 의 농도로 1 시간 전처리한 후 PA 를 100uM 처리하여 15 시간동안 지방을 축적시켰다. 이후 지방을 염색하는 Nile Red 용액을 이용해 염색을 10 분 진행한 후 형광 현미경을 통해 이미지를 확인했다. PA 를 처리하지 않아도 배지로 인해 축적되는 지방에 비해 PA 를 처리한 경우 축적되는 지방이 매우 증가한 것을 확인하였고 SFC 를 처리하였을 때 축적되는 지방이 통계적으로 의미가 있게 농도 의존적으로 감소한 것을 확인하였다. ***p<0.001 vs. PA 처리하지 않은 세포. ###p<0.001 vs. PA 처리한 세포. 그림 4 공복시킨 C57BL/6J 쥐에서 SFC 에 의한 지방의 유입 억제 확인.
２１
그림 6. SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의해 유도되는 지방독성에 의한 cell viability 회복 확인. PA 300uM 을 15 시간동안 처리하였을 때. 세포의 viability 가 감소하고 DNA fragmentation 이 증가한 것을 확인하였다. 반면 SFC 를 처리한 세포에서는 viability 의 경우 SFC 0.1mM 의 농도에서부터 회복되는 것을 확인하였고 DNA fragmentation assay 의 경우 0.05mM 에서도 DNA fragmentation 이 감소하는 것을 확인하였으며 두 실험에서 모두 SFC 농도가 증가할수록 지방 독성에 의한 cell viability 와 DNA fragmentation 이 감소한 것을 확인하였다. 하지만 SFC 0.4mM 의 농도에서는 약물만 처리한 세포에서 cell viability 가 감소하였고 DNA fragmentation 은 증가하였다. **p<0.01, ***p<0.001 vs. PA 처리하지 않은 세포. ##
p<0.01; ###p<0.001 vs. PA 처리한 세포
그림 5 SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의해 유도되는 지방독성에 의한 cell viability 회복 확인.
２２ 그림 7. SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의한 지방독성 개선 확인. 세포에 PA 를 300uM 의 농도로 15 시간동안 처리하여 유도된 지방독성을 SFC 가 개선하는지 확인하기 위해 세포사멸과 stress, 염증에 관련된 단백질을 western blot 을 이용하여 비교하였다. PA 에 의해 증가한 세포사멸에 관련된 단백질인 cleaved caspase3 와 stress, 염증에 관련된 p-JNK, p-P65 의 단백질 양이 SFC 를 처리한 경우 농도의존적으로 감소한 것을 확인하였다. 또 지방
２３ 독성에 의해 유도된 인슐린 저항성 역시 SFC 에 의해 회복되는 것을 p-AKT, p-GSK 단백질을 이용하여 확인하였다. **p<0.01, ***p<0.001 vs. PA 처리하지 않은 세포. ##p<0.01; ###p<0.001 vs. PA 처리한 세포. $$p<0.01 vs. 인슐린과 PA 를 처리한 세포. 그림 6 SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의한 지방독성 개선 확인.
２４ 그림 8. SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의한 염증 관련 유전자 발현이 감소하는 지 확인. PA 에 의해 유도된 염증이 SFC 를 처리한 경우 감소하는지 염증과 관련된 유전자 발현을 조사하여 확인하였다. 간 세포에 SFC 를 0.2mM 로 1 시간 전처리한 후 PA 를 300uM 처리하여 지방독성을 유도하였고, SFC 를 처리한 세포에서 염증 관련 유전자 발현이 낮아진 것을 확인하였다. *p<0.05; ***p<0.001 vs. PA 처리하지 않은 세포. ##p<0.01 vs. PA 처리한 세포. 확인. 그림 7 SFC 에 의해 HepG2 세포에서 PA 에 의한 염증 관련 유전자 발현이 감소하는 지
２５
C. 고지방식이에 의해 유도된 단순 지방증에
대한 SFC 의 예방효과를 C57BL/6J 쥐에서
확인
In vitro 실험을 통해 SFC 가 간 세포에서 지방의 흡수를 막고 지방으로 유도되는 지방 독성을 회복시켜 세포의 viability 를 증가시키고 염증과 stress, 세포 사멸에 관련된 단백질과 mRNA 의 발현을 감소시킨 것을 확인하였다. 따라서 이 결과가 in vivo 에서도 적용되는지 확인하기 위해 동물 모델을 제작하였다. 10 주령 male C57BL/6J 쥐를 무작위로 세 그룹(n=8~10)으로 분류한 후 한 그룹은 사료의 지방 함량이 10%인 일반적인 식이(D12450B; Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)를 진행하면서 normal saline 을 복강 주사하였으며, 두 그룹은 사료의 지방 함량이 60%인 고지방식이(D12492; Research Diets Inc.)를 진행하면서 normal saline 과 SFC 10mg/Kg 로 복강 주사한 그룹으로 나누어 15 주 동안 주 3 회씩 주사하면서 NAFLD 모델을 제작하였으며 매주 1 회 몸무게와 먹이 섭취량을 측정하였다(그림 9). 15 주 후 쥐에서 간, Brown fat, Epidydimal fat, Perirenal fat 을 떼어 무게변화를 확인하였다(그림 10). 일반 식이를 진행한 그룹보다 고지방식이를 진행한 그룹이 모든 조직의 무게가 증가하였으며, SFC 를 주사한 그룹은 고지방식이를 진행한 그룹에 비해 간과 B-fat, P-fat 이 감소한 것을 확인하였다. 그러나 E-fat 의 경우 SFC 를 처리한 그룹에서 증가하였다. 간 조직에 지방이 얼마나 증가하였는 지 확인하기 위해 Oil Red O 염색과 TG 분석을 진행하였으며(그림 11), 일반 식이에 비해 고지방식이를 진행한 그룹은 세포 내에 지방이 증가해 세포 크기가 증가하였으며, 염색에 의해 관찰되는 lipid２６ droplet 의 크기가 큰 것을 확인하였다. SFC 를 주사한 그룹은 세포 내에 있는 지방의 양과 lipid droplet 이 존재하지만 고지방식이를 진행한 그룹에 비해 그 크기와 개수가 매우 작은 것을 확인하였으며 각 그룹의 간내 축적된 TG 의 양을 비교해 본 결과 고지방식이를 진행한 그룹이 중성 지방의 양이 매우 증가하였으며 SFC 를 주사한 그룹은 유의미하게 축적된 중성 지방의 양이 감소한 것을 관찰하였다. 마지막으로, 각 그룹의 간에서 RNAiso 를 이용해 추출하여 제작한 cDNA 로 지방대사에 관련된 유전자 발현을 조사하였다(그림 12). 그 결과 Sterol regulatory element-binding protein1c, Fatty acid synthase, Acetyl-CoA carboxylase, Stearoyl-CoA desaturase-1 유전자가 의미 있게 감소한 것을 확인하였다.
２７ 그림 9. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 몸무게 변화와 먹이 섭취량 확인. 10 주령 male C57BL/6J 쥐를 무작위로 세 그룹으로 나눠 15 주간 실험을 진행하였으며 첫 번째 그룹은 일반 식이를 진행하면서 normal saline 을 주사, 두 번째 그룹은 지방 함량 60% 사료를 급여하여 고지방식이를 진행하면서 normal saline 주사하고 세 번째 그룹은 고지방식이를 진행하면서 SFC 를 10mg/Kg 로 주사한다. SFC 는 주 3 회 투여하고 몸무게와 먹이 섭취량은 주 1 회 측정하였다. ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. #p<0.01 vs. 고지방식이 그룹. 않은 그룹의 몸무게 변화와 먹이 섭취량 확인. 그림 8 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지
２８ 그림 10. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 조직 무게 측정. 15 주 동안 약물과 고지방식이를 진행한 후 각 그룹의 간과 지방을 분리해 무게를 측정하였다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. #p<0.01; ###p<0.001 vs.고지방 식이 그룹. 그림 9 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 조직 무게 측정.
２９
그림 11. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에 축적된 지방량 비교. 각 그룹의 간 조직을 얼려 section 해서 H&E 염색과 Oil Red O 염색을 진행하였다. 그리고 각 그룹의 간에 축적된 TG 를 확인하였으며 고지방식이에 의해 증가된 지방이 SFC 를 주사한 경우 낮아짐을 확인하였다. ***p<0.001 vs.
일반 식이 그룹. #p<0.05 vs.고지방 식이 그룹. 그림 11 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에 축적된 지방량 비교.
３０ 그림 12. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 발현된 지방대사 관련 유전자 비교. 각 그룹에서 분리한 간으로 지방대사에 관련된 유전자 발현을 조사하였다. 고지방식이에 의해 증가된 유전자의 발현이 SFC 를 주사한 그룹의 경우 낮아진 것을 확인하였다. *p<0.05; ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. #p<0.05; ##p<0.001 vs. 고지방 식이 그룹. 그림 10 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 발현된 지방대사 관련 유전자 비교.
３１
D. 고지방식이에 의해 유도된 간 염증을 SFC 가
감소시키는지 C57BL/6J 쥐에서 확인
고지방식이에 의해 유도된 간 염증이 SFC 에 의해 감소하는지 확인하기 위해 각 그룹의 간으로 유입된 면역세포를 관찰하기 위해 F4/80 염색을 진행하였다(그림 13). 염색을 진행한 후 이미지 스캔을 하여 각 이미지 당 5 회씩 4cm2 의 크기로 구역을 정해 염색된 면역세포의 개수를 세어 그래프를 작성하였다. 염색 결과 일반 식이를 진행한 그룹보다 고지방 식이를 진행한 그룹에서 염색된 면역세포가 더 많았으며 SFC 를 주사한 그룹에서는 F4/80 면역 염색 시 염색된 대식세포의 개수가 매우 줄었음을 확인하였다. 또한 고지방식이로 유도되는 지방 독성을 SFC 에 의해 회복되는지 확인하기 위해 p-JNK, p-P65, p-AKT, p-GSK3α/β의 단백질 양을 western blot 을 이용하여 확인하였다(그림 14). 각 개체별로 오차가 있으나 대부분의 샘플에서 고지방식이에 의해 발견된 염증과 stress, 인슐린 저항성 관련 신호가 SFC 를 처리한 그룹에서는 눈에 띄게 회복됨을 확인하였다. 또한 각 그룹의 간 세포에서 발현되는 염증 관련 유전자인 Monocyte Chemoattractant Protein-1, 1tumor necrosis factor-alpha, Interleukin-1 beta, Interleukin-6 의 mRNA 발현 역시 고지방식이를 처리하였을 때 증가하였다가 SFC 를 처리한 그룹에서는 감소한 것을 확인하였고, 간 섬유화에 관련된 유전자인 Tissue inhibitor of metalloproteinase-1, connective tissue growth factor, Collagen, type I-alpha 2 Chain, Collagen Type III -alpha 1 Chain 발현 역시 감소한 것을 확인하였다(그림 15). ALT 와 AST 는 흔히 간에서 발견되는 효소로 건강한３２ 사람에서는 혈중 ALT 와 AST 의 수치가 낮으나 간 손상 및 염증이 있을 때 이 효소가 혈액으로 방출된다(Kim et al., 2008). 때문에 혈장 내 이 효소의 수치는 간 손상의 지표로 이용할 수 있다. 각 그룹에서 얻은 혈액에서 분리한 혈장으로 AST, ALT 검사를 진행한 결과 고지방식이에 의해 간 염증이 나타난 것을 확인할 수 있었고, SFC 를 주사하였을 때 이 수치가 감소한 것이 나타났다(그림 16).
３３ 그림 13. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 F4/80 면역염색. 고지방식이에 의해 증가된 간 염증을 확인하기 위해 간으로 유입된 면역세포를 F4/80 염색으로 1 차 염색한 후 hematoxylin 염색으로 핵을 염색하여 이미지를 얻었다. 각 간 당 구역 내 염색된 면역 세포의 수를 셌다. *p<0.05; *** p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. ##p<0.01 vs. 고지방 식이 그룹. 그림 11 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 F4/80 면역염색.
３４ 그림 14. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간에서 염증 관련 단백질량 비교 및 인슐린 신호전달계 회복 확인. 각 그룹의 간에서 단백질을 추출하여 고지방식이에 의해 유도된 염증과 stress 에 관련된 단백질 조사와 지방 독성으로 인한 인슐린 저항성을 SFC 에 의해 회복되는지 인슐린 신호전달계 관련 단백질량을 비교하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. # p<0.05 ##p<0.01 vs. 고지방 식이 그룹. $p<0.05; $$p<0.01 vs. 인슐린을 처리한 고지방 식이 그룹. 그림 12 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간에서 염증 관련 단백질량 비교 및 인슐린 신호전달계 회복 확인.
３５ 그림 15. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 발현되는 염증 및 간 섬유화 관련 유전자 비교. 각 그룹의 간 조직에서 RNA 를 추출하여 염증 및 간 섬유화에 관련된 유전자 발현을 비교하였다. 고지방식이에 의해 증가된 염증과 간 섬유화에 관련된 유전자가 SFC 를 주사한 그룹은 발현이 낮아진 것을 확인하였다. *p<0.05; ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. #p<0.05; ### p<0.001 vs. 고지방 식이 그룹. 그림 13 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 간 조직에서 발현되는 염증 및 간 섬유화 관련 유전자 비교.
３６ 그림 16. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 염증 수치 확인. 간 손상의 지표인 혈장 내 AST 와 ALT 양을 분석해 고지방식이에 의한 간 손상이 SFC 에 의해 회복되는지 확인하였다. *p<0.05; ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. #p<0.05; ##p<0.01 vs. 고지방 식이 그룹. 그림 14 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 염증 수치 확인.
３７
E. 고지방식이에 의해 유도된 고혈당증에 대한
SFC 의 예방효과를 C57BL/6J 쥐에서 확인
고지방식이에 의해 유도된 고혈당증을 SFC 가 개선시키는지 확인하기 위해 쥐를 6 시간 공복시킨 후 꼬리 정맥에서 얻은 혈액으로 공복 혈당과 공복 인슐린 양을 확인하였다(그림 17). 인슐린 저항성이 오면 인슐린의 효과가 감소하기 때문에 섭취한 포도당을 세포내로 유입되는 양이 감소하여 혈중 포도당 농도가 높아지게 되고 이를 세포내로 유입하기 위해 인슐린의 생산은 증가하게 된다. 각 그룹에서 얻은 혈액에서 고지방식이를 한 그룹은 공복 혈당과 공복 인슐린 양 모두 높게 결과가 나왔다. 반면 SFC 를 주사한 그룹에서는 공복 혈당과 공복 인슐린 양 모두 감소한 것을 확인하였다. 또한 항 당뇨 효과를 확인하기 위해 포도당, 인슐린 그리고 피루브산 내성 실험을 진행하였다. 공복을 6 시간 진행한 쥐에게 포도당 내성 실험을 진행하기 위해 꼬리 정맥혈을 이용해 공복 혏당을 측정한 후 포도당 1g/Kg 을 복강 주사하여 0, 15, 30, 60, 90, 120 분에 혈당을 측정하여 유입된 포도당을 얼마나 빠른 시간내에 세포내로 흡수하는 지 확인한 결과, 고지방식이를 진행한 그룹은 혈중 포도당 농도가 30 분이 지난 후 감소하였으나 일반 식이를 진행한 그룹과 고지방식이를 했으나 SFC 를 주사한 그룹에서는 15 분 이후 혈당이 감소한 것을 확인하였다. 두 번째로 인슐린을 0.7U/Kg 로 복강 주사한 후 혈당을 측정하여 얼마나 인슐린에 의해 포도당이 세포내로 흡수가 빠르게 진행되는지 확인하였다. 고지방식이를 진행한 그룹은 인슐린 저항성이 있어 인슐린 주사 후 혈당이 천천히 감소하는 형태를 보였고, SFC 를 주사한 그룹은 혈중 포도당 농도가 더 빨리３８
감소하는 것을 확인하였다. 마지막으로 피루브산을 1g/Kg 로 복강 주사한 후 간에서 포도당을 얼마나 빠르게 형성하는지 확인하였다. 고지방식이 그룹은 다른 그룹에 비해 포도당의 생성이 과도한 것을 확인할 수 있었다(그림 18).
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그림 17. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 공복 혈당 및 공복 인슐린 분비 비교. SFC 가 항 당뇨 효과를 보이는지 확인하기 위해 공복 혈당과 공복 인슐린양을 측정하였다. 쥐를 6 시간 공복시킨 후 공복 혈당은 Accu-Check 혈당 측정 기기를 이용하여 측정하였으며 공복 인슐린양은 Insulin RIA kit 를 이용하여 측정하였다. ***p<0.001 vs. 일반 식이 그룹. ##p<0.01; ###p<0.001 vs.
고지방 식이 그룹.
그림 15 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 공복 혈당 및 공복 인슐린 분비 비교.
４０ 그림 18. NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 항당뇨 효과 확인. SFC 가 고지방식이로 인해 발병된 고혈당증에도 개선 효과를 보이는 지 확인하기 위해 쥐를 6 시간 공복 시킨 후 당 내성 검사와 인슐린, 피루브산 내성 검사를 진행하였다. 첫 공복 혈당을 측정한 후 포도당의 경우 1g/Kg, 인슐린은 0.7U/Kg, 피루브산은 1g/Kg 로 복강 주사하고 각 시간마다 꼬리 정맥혈을 이용하여 혈당을 측정한다. **p<0.01; ***p<0.001 vs.일반 식이 그룹. #p<0.05; ##p<0.01; ###p<0.001 vs. 고지방식이 그룹. 그림 16 NAFLD 쥐 모델에서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹의 항당뇨 효과 확인.
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Ⅳ 고찰
NAFLD 는 전세계적으로 발병률이 높은 대사질환 중 하나이다. NAFLD 는 단순 지방증과 간 손상 및 염증을 동반하는 NASH 와 간 경변증까지 포함하는 질환으로 발병 원인으로는 유전 및 환경적인 요인에 의해 발생되는 것이 일반적이다. NAFLD 는 충분히 개선될 가능성이 있으나 과도하게 축적된 지방에 의해 지방 독성이 나타나 간 염증 및 손상을 나타내는 NASH 로 발전하게 되며 더 나아가 간 경변까지 일어날 수 있기 때문에 개선될 수 있는 단계일 때 관리하는 것이 중요하다. 간으로의 과도하게 유입되는 지방이 NAFLD 의 큰 원인이라 생각되기 때문에 INS-1 베타세포에서 지방에 의해 유도되는 세포 사멸에 보호 효과를 보인 SFC 라는 약물을 이용하여 NAFLD 를 치료하는 방향을 제시하고자 연구를 시작하였다. 먼저, 공복시킨 C57BL/6J 쥐를 이용하여 SFC 를 주사하였을 때 BODIPY-PA 의 흡수가 가장 많이 감소되는 곳을 확인해보았으며 흥미롭게도 다른 조직에 비해 간으로 흡수되는 B-PA 를 SFC 가 효과적으로 막으며 공복으로 유도되는 간으로의 지방 유입도 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이 두 결과를 통해 SFC 가 간 세포에서 지방 유입을 억제할 것으로 기대하여 간 세포 이외에 근육 세포와 지방 세포에서 SFC 에 의한 지방산 흡수 억제 효과를 조사하였으며 간 세포에서만 특이적으로 지방 유입을 억제한다는 결과를 얻었다. SFC 가 간 세포로의 지방 유입을 억제하였으므로 PA 를 처리하여 발생되는 간 세포내 지방 축적 역시 감소하였다. 세포에 PA 를 처리한 후 축적되는 TG 를 확인한 결과 SFC 의 농도에 비례하여４２
축적되는 TG 의 양이 감소하는 것을 확인하였다. 지방독성에 의한 세포의 viability 감소와 DNA fragmentation 증가 역시 SFC 에 의해 개선되는 것을 확인하였다. 그런데 약물만 단독으로 처리한 세포에서 가장 지방 유입을 많이 감소시킨 0.4mM 농도에서 약간의 독성이 나타났으며 이는 원래 SFC 가 aconitase inhibitor 로 알려진 약물이기 때문에 TCA cycle 에 영향을 줘 독성을 나타낸 것으로 해석할 수 있으며(Proudfoot et al., 2006) SFC 의 적정 농도를 0.2mM 로 생각하고 실험을 진행하였다. 0.2mM 의 SFC 는 aconitase 의 억제제로서 효과는 미미할 것으로 예상된다(Jung et al., 2017). 간 세포에 PA 를 처리하게 되면 유입되는 지방산은 에너지원으로 사용하는데 과도한 지방산의 유입은 지방산화를 증가시켜 ROS 를 생산해 oxidative stress 를 유발해 염증을 증가시키거나 중간산물에 의한 stress 신호를 활성화시키고 염증신호를 증가시키며 과도한 스트레스 및 염증 신호의 활성화는 세포사멸을 초래한다(Unger and Scherer, 2010). 염증과 stress 의 대표적인 단백질인 JNK 와 p-P65, 세포사멸에 대표적인 단백질인 cleaved caspase 3 의 양이 SFC 를 처리한 세포에서 많이 감소했고, 또한 지방 독성에 의해 유도된 인슐린 저항성 신호 전달계도 회복하는 것을 확인하였으며 염증과 관련된 유전자 발현도 감소시키는 것으로 보아 SFC 가 확실히 지방 대사의 변화로 인한 독성 발생을 낮추는 효과가 있는 것이 밝혀졌고 이는 세포내로 지방산의 유입이 감소하여 이로 인한 과도한 대사가 줄어들기 때문으로 추측된다. SFC 의 지방 흡수 억제 효과는 동물에서도 확인할 수 있었는데, 10 주령 C57BL/6J 쥐를 15 주간 고지방식이를 진행하면서 SFC 를 주사한 그룹과 그렇지 않은 그룹 간의 몸무게 차이와 각 조직의
４３ 무게를 측정한 결과 SFC 를 주사한 그룹이 더 낮은 것을 관찰할 수 있었으며 간으로의 지방 유입이 줄었으나 먹이 섭취량을 보았을 때 섭취량이 고지방식이-saline 그룹과 고지방식이-SFC 그룹에서 크게 차이가 없기 때문에 간으로 축적되지 못한 지질이 epidydimal fat 으로 축적되었을 것이라 추측할 수 있다. 간 조직에 축적된 지방을 확인하고자 Oil Red O 염색을 진행하였고 일반 식이를 진행한 그룹과 비교하였을 때 lipid droplet 이 보였다. SFC 를 주사한 그룹에서는 고지방식이만 진행한 그룹과 동일하게 lipid droplet 이 발견은 되었으나 그 사이즈가 작았으며 H&E 염색을 통해 세포 상태를 관찰하였을 때도 축적된 지방 사이즈가 매우 작았음을 확인하였다. 간 조직에서 RNA 를 추출하여 지방 합성에 관련된 유전자 발현을 조사하였는데 SFC 에 의해 고지방식이에 의해 증가한 지방 합성 유전자 발현도 감소한 것으로 나타났고 동물 모델에서도 간으로의 지방 유입을 SFC 가 억제하여 이런 효과를 나타날 것이라는 결과를 얻었다. 고지방식이에 의해 유입되는 지방이 억제되면서 간 염증도 개선됨을 볼 수 있었다. 염증으로 인해 간으로 유입된 면역 세포를 F4/80 로 면역염색한 결과 고지방식이를 진행한 그룹에 비해 고지방식이를 하면서 SFC 를 투여한 그룹에서 면역 세포의 수가 현저히 감소했음을 확인했으며 염증과 stress 에 관련된 단백질의 양도 감소함을 확인했다. 또한 고지방식이에 의한 인슐린 저항성 역시 개선됨을 확인했다. 그리고 염증과 간 섬유화에 관련된 유전자 발현을 조사한 결과 마찬가지로 고지방식이보다 고지방식이를 하면서 SFC 를 투여한 그룹에서 mRNA 발현이 낮아졌고 간 손상 지표인 혈장 내 AST 와 ALT 의 양 역시 SFC 를 투여한 그룹에서
４４ 낮아졌으므로 SFC 는 고지방식이에 의한 간 염증에도 보호 효과를 가지며 공복 혈당과 공복 인슐린 분비를 낮췄다. 포도당, 인슐린 그리고 피루브산 내성 검사에서는 초기 공복 혈당은 고지방식이를 한 그룹과 고지방식이를 하면서 SFC 를 투여한 그룹에서 큰 차이를 보이지 않았으나 포도당 내성 검사에서는 고지방식이를 진행하면서 SFC 를 투여한 그룹이 혈당이 감소하는 양상이 일반 식이를 진행한 그룹과 비슷하였고, 인슐린 내성 검사에서도 인슐린이 투여된 후 고지방식이를 하였지만 SFC 를 투여한 그룹에서는 인슐린에 민감하게 반응하여 초기 혈당이 고지방식이만 진행한 그룹과 별 차이가 없음에도 불구하고 혈당이 감소하는 속도가 매우 빨랐다. 피루브산 내성 검사의 경우 투여된 피루브산이 다른 대사산물로 사용되거나 전환될 가능성이 있지만 이는 직접적으로 혈당을 변화시키는 요인으로 작용하기 어렵기 때문에 gluconeogenesis 를 보여주는 지표이다(Edgerton et al., 2009). 검사 결과 피루브산을 주입한 후 혈당이 증가하는 폭이 고지방식이를 한 그룹에 비해 SFC 를 투여한 그룹이 낮았으며 혈당이 감소하는 양상 역시 일반 식이를 한 그룹과 비슷한 것을 확인하였다. 따라서 SFC 는 고지방식이로 유도된 간에서 인슐린 저항성을 개선하고 그로인한 고혈당증도 개선하므로 NAFLD 및 2 형 당뇨병을 개선하는 데에 가능성이 있을 것이라 생각된다. 아직 SFC 에 의해 지방 유입이 억제되는 자세한 기작이 밝혀지지 않았기 때문에 이에 대한 후속 연구의 진행이 필요하지만 지금까지의 결과를 바탕으로 SFC 는 NAFLD 에서 지방의 유입을 차단해 간으로 지방이 축적되는 것을 막아 지방 독성에 의한 염증 및 인슐린 저항성을 개선시키므로 NAFLD 에 대한 치료에 도움을 줄 것으로 생각된다.
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Ⅴ 결론
본 연구의 목적은 PA 에 의해 유도되는 INS-1 베타 세포의 죽음을 막는 효과를 보인 SFC 가 지방 흡수를 억제하는 결과를 바탕으로 NAFLD 를 개선시키는지 확인하는 것이다. 먼저 초기 실험에서 SFC 가 다양한 조직과 세포에서 B-PA 의 흡수를 억제하는 데에 있어서 간에서 특이적으로 흡수를 많이 억제하는 결과를 바탕으로 진행되었다. 간 세포에서 농도 의존적으로 B-PA 의 흡수를 감소시키는 결과와 함께 세포에 독성을 주지 않으면서 효과는 최대인 농도를 찾았으며 SFC 약물은 0.2mM 을 사용하는 것이 적합하였다. 지방독성으로 유도된 간 세포의 염증이 SFC 에 의해 관련 단백질과 유전자 발현이 감소하고 인슐린 저항성이 개선됨을 보였다. 또한 C57BL/6J 쥐를 이용하여 15 주간 고지방식이를 진행하면서 주 3 회 SFC 를 투여하였을 때, 몸무게가 고지방식이를 진행한 그룹에 비해 적었으며 간 및 지방 조직의 무게도 대체적으로 감소하는 경향이었다. 간 내 축적된 지방을 확인한 결과 축적된 TG 와 lipid droplet 이 감소하였으며 지방합성에 관여하는 유전자발현 역시 감소하였다. 간으로 유입되는 지방이 억제되었기 때문에 고지방식이에 의해 유도되는 간 염증 또한 개선되었다. SFC 를 투여한 그룹은 간으로 유입된 면역 세포의 수와 염증 및 스트레스에 관련된 단백질 및 유전자 발현도 감소하였으며 인슐린 저항성 또한 개선되었고 간 섬유화에 관련된 유전자 발현 또한 감소시켰다. 그리고 고지방식이에 의해 유도된 고혈당증에도 SFC 는 혈당을４６ 낮추고 다양한 내성 검사에서 고지방식이를 진행한 그룹에 비해 더 개선된 효과를 보였다. 따라서, SFC 는 간으로 지방이 흡수되는 것을 억제하여 NAFLD 에 관련된 마커들을 감소시키며 이는 NAFLD 와 고지방식이로 인해 유도되는 당뇨병의 치료 및 연구 방향을 제시할 것으로 생각된다.
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