Tim-3는 T 세포 immunoglobulin variable region (IgV)―like domain and mucin-domain-containing molecules (TIMs)family에 속 하 는 분 자 로 서 보조 T 세포 1형 (Th1세포)에서 특이적으로 발현되고 보조 T 세포 2형 sequence에 이어 IgV-likedomain과 mucinlikedomain,transmembranedomain 과 intracellulartail로 구성되어있다.마우스의 Tim-1,Tim-2 그리고 Tim-3는
인 자가 면역질환과 연관된 인터페론 (interferon;IFN)―
γ
,인터루킨 (interleukin;IL)―2,종양괴사인자 (tumornecrosisfactor;TNF)―
α
와 lymphotoxin과 같은 사 이토카인을 생산한다.또한,대식세포 (macrophage)의 활성에 중요하며,세포 내 가 면역 뇌척수염 (experimentalautoimmuneencephalitis;EAE)환자의 IFN-γ
생산 T 세포에서 발현된다.Tim-3는 Th2클론에서는 발현되지 않지만 CD11b+Tim-3L의 발현은 Tim-3-Ig이 결합하는 세포를 분석함으로써 알려졌다 galectinfamily의 한 member로서 두 개의 carbohydrate-recognitiondomain을 가 지고 있고,이들이 carbohydrate를 인지하는데 있어서 매우 중요하다고 알려져 있
이를 다발 경화증에서 Tim-3발현 조절 결함에 의해 IFN-
γ
를 생산하는 T 세포을 밝혔다 (Geng,2006).또한 Tim-3와 T-bet을 발현하는 종양에 특이한 Th1 세포를 입양면역 (adoptive immunotherapy)하면 종양 세포의 성장을 억제하는 세포 독성 반응이 유도됨이 보고되었다 (Simmons등,2005).그러나 Tim-3-Ig 의 발현이 종양의 성장에 어떠한 영향을 미치는지에 관해서는 아직까지 연구되 지 않았다.
D.연구 목적
Tim-3경로가 Th1세포의 면역 조절과 면역 관용에 중요함이 밝혀져 있으나, 이 경로의 억제가 종양 성장에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았으므로 본 연구 에서는 Tim-3경로를 억제할 수 있는 Tim-3-Ig을 이용하여 이를 밝히고자 하였 다.이를 위하여 Tim-3-Ig을 발현하는 종양 세포를 마우스에 투여하여 종양 성 장의 변화를 관찰하였고 또한 정제한 Tim-3-Ig 단백질을 투여한 마우스에서 종 양 성장을 측정하였다.
Ⅱ
RNA-Bee-RNA isolationreagent(Tel-Test,Inc.,U.S.A.)를 이용하여 RNA를 분리하였고,이를 주형으로 oligo-dT (Invitrogen,CA,U.S.A.)를 이용하여 cDNA를 생산하였다.생산된 cDNA를 주형으로,Tim-3에 대한 primer를 이용하 여 중합효소 연쇄반응 (polymerasechainreaction;PCR)을 시행하고,PCR 산물 을 TopoTA cloning 벡터 (Invitrogen,CA,U.S.A.)에 cloning함으로 Balb/c 마우스의 Tim-3 유전자 (AY553334)를 확보하였다.pTOPO-Tim-3 플라스미드 를 주형으로,Tim-3F(NheI)와 Tim-3R(BglII)primer셋트를 이용하여 Tim-3의 signal펩티드와 immunoglobulin V likedomain과 mucin domain을 증폭하였다 (Table1).TaKaRaTaqTM (Takarabiomedicals,Korea)을 이용하여 PCR을 다 음과 같은 온도 조건으로 진행하였다.95℃에서 5분 후에,95℃ 1분,55℃ 30초, 72℃ 1분 30초로 5cycles를 수행한 후,95℃ 1분,61℃ 30초,72℃ 1분 30초 로 20cycles를 수행하였다.증폭된 PCR 산물을 pGEM T-Easy 벡터 (Promega, Madison,U.S.A.)에 T4DNA Ligase(Invitrogen,CA,U.S.A.)를 이용하여 삽입한 후 삽입된 유전자의 염기서열을 분석하였다.염기서열이 확인된 Tim-3 유전자를 pIRES2-EGFP의 NheI과 BglII site에 subcloning 함으로써 pIRES2-EGFP-Tim3벡터를 제작하였다.한편,TOPO-humanIgG1constantregiongene(아주대 권명희 박사 제공) 을 주형으로,primerHIgCF(BglII)와 HIgCR(BamHI)을 이용하여 CH2와 CH3 부위 유전자를 증폭하였다 (Table1).TaKaRaTaqTM을 이용하여,95℃ 1분 후 에,95℃ 1분,60℃ 30초,72℃ 1분 30초로 30cycles로 PCR을 수행하였고, 증폭된 유전자는 pTOPO 2.1벡터 (Invitrogen,Groningen,Netherlands)에 삽입
한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열이 확인된 CH2-CH3 유전자를 pIRES2-EGFP-Tim-3의 BglII와 EcoRIsite에 삽입하여 pIRES2-EGFP-Tim3-Ig 벡터를 제작하였다.
곤충 세포에서 Tim-3-Ig를 발현하기 위해 재조합 baculovirus를 생산하였다.
먼저 baculoviral transfer 벡터 pAcSG2에 pAcGP67B의 leader sequence를 subcloning하여 Tim-3-Ig이 배지로 분비되는 벡터 backbone을 만들었다.마우스 의 TIM-3는 pTOPO-Tim-3를 주형으로 Tim-3F(BamHI)와 Tim-3R(EcoRI) primer 셋트를 이용하여 Tim-3의 immunoglobulin V like domain과 mucin domain을 증폭하였다 (Table1).TaKaRa TaqTM을 이용하여 다음과 같은 온도 조건으로 PCR을 진행하였다.95℃ 5분 후에,95℃ 1분,44℃ 30초,72℃ 1분 30초로 5cycles를 수행한 후,95℃ 1분,62℃ 30초,72℃ 1분 30초로 20 cycles를 수행하였다.증폭된 유전자는 pTOPO 2.1벡터에 삽입한 후 염기서열을 분석하였고,염기서열이 확인된 Tim-3 유전자를 BamHI과 EcoRI을 이용하여 pAcSG2-GP67backbone벡터에 삽입하였다.
한편,CH2와 CH3유전자는 TOPO-human IgG1constantregion gene을 주 형으로 primer CH2CH3F(EagI)와 CH2CH3R(BglII)을 이용하여 증폭하였다 (Table1).TaKaRaTaqTM을 이용하여 다음과 같은 온도 조건으로 PCR을 진행하 였다.95℃ 1분 후에,95℃ 1분,60℃ 30초,72℃ 1분 30초로 30cycles를 수행 하였다.증폭된 유전자는 pGEM T-Easy벡터에 삽입한 후 염기서열을 분석하였고, 염기서열이 확인된 CH2-CH3유전자는 Tim-3를 넣은 pAcSG2-GP67-Tim-3벡터 의 EagI과 BglIIsite에 삽입함으로써 pAcSG2-GP-Tim-3-Ig벡터를 제작하였다.
T
TTaaabbbllleee111...PPPrrriiimmmeeerrrsssfffooorrraaammmpppllliiifffiiicccaaatttiiiooonnnooofffTTTiiimmm---333aaannndddhhhuuummmaaannnIIIgggcccooonnnssstttaaannntttrrreeegggiiiooonnn Primer Nucleotidesequence
Tim-3F(NheI) GCTAGCATGTTTTCAGGTCTTACCCTCAACTGTG Tim-3R(BglII) AGATCTTCTGATCGTTTCTCCAGAGTCCTTAATTTCA
TCAG
HIgCF(BglII) GAAGATCTGCACCTGAACTCCTGGGG HIgCR(BamHI) CGGGATCCTCATTTACCCTGCGACAG
Tim-3F(BamHI) GGATCCTTGGAAAATGCTTATGTGTTTGAGGTTG Tim-3R(EcoRI) GAATTCTCTGATCGTTTCTCCAGAGTCCTTAATTTCA
TC
CH2CH3F(EagI) CGGCCGAGCACCTGAACTCCTGG
CH2CH3R(BglII) AGATCTTCATTTACCCTGCGACAGGGAGAG
Italiclettersindicatesequencethatisrecognizedbyrestrictionenzyme.
B.Tim-3-Ig발현 벡터의 이입
Tim-3-Ig을 발현하는 pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig 벡터 DNA를 Chinesehamster ovary(CHO)세포에 polyethylenimine(PEI,Polysciences,Inc.,PA,U.S.A.)을 이 용하여 한시적으로 이입 (transienttransfection)하였다.Opti-MEM 600㎕와 정제한 DNA 16㎍ 그리고 1㎎/㎖ 농도의 PEI16㎕를 5㎖ tube에 넣고 잘 섞어준 후 실온에서 10분간 정치하였다.Viability가 98% 이상인 2× 106개의 CHO 세포가 배양된 100mm dish에 10%의 우태아혈청 (fetalbovineserum;FBS,GibcoBRL) 이 포함된 Dulbeco'smodified eaglemedium (DMEM,GibcoBRL)4㎖에 넣고 24 시간동안 37℃,5% CO2 배양기에서 배양한 다음,FBS가 포함되지 않은 Lipofectamin2000reagent20㎕를 각각 500㎕의 Opti-MEM에 넣고 잘 섞어준 후 실온에서 5분간 정치하였다.이를 합하여 다시 잘 섞어준 후 실온에서 20분 간 정치한 후, 이를 배양한 세포에 넣어주었다. G418 (Duchefa, Haarlem, Netherlands)이 2㎎/㎖로 포함된 배지에서 이입된 세포를 선택 증식시켰다.한 계희석 배양법과 형광 현미경 확인을 이용하여 두 번의 클로닝과정을 거쳐 GFP를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하였다.
C.WesternBlotAnalysis
Tim-3-Ig 발현 벡터를 한시적으로 이입한 뒤 수집한 세포 배양액에 SDS-PAGE sample loading buffer를 첨가하고,5 분간 끓인 후 10% sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)gel에 적하하여 80V (voltage)로 전기 영동하였다.이 acrylamidegel의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF,miliporeCo.,Bedford,MA,U.S.A.)막으로 250mA (Amphere) 에서 2시간 전기 이동시킨 후 3% BSA-PBS로 실온에서 한 시간 동안 반응시켰 다.막을 세척한 후 HRP가 결합된 anti-human IgG 항체를 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다.충분히 세척한 후 enhancedchemicalluminescence(ECL,Amersham Biosciences,Buckinghamshire,England)로 Tim-3-Ig의 band를 확인하였다.
D.친화성 크로마토그래피와 고분자 액체 크로마토그래피
Tim-3-Ig융합 단백질의 정제는 ProteinA SaccharoseFastFlow (Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)를 사용한 친화성 크로마토그래피와 고분자 액체 크 로마토그래피 (Fastproteinliquidchromatography;FPLC)를 이용하였다.
친화성 크로마토그래피는 다음과 같이 수행하였다.20% ethanol에 suspension 상태로 있는 500 ㎕의 protein A agarose bead를 취하여 packaging한 column을 1×PBS 1 ℓ로 충분히 세척한 후,모아놓았던 CHO 세포 배양액을 여과한 후에 proteinA agarose와 반응시켰다.반응시킨 proteinA agarosecolumn을 인산완충 식염수로 충분히 세척한 후 pH 3.0의 0.1 M glycine buffer(elution buffer)로 protein A agarose에 결합된 Tim-3-Ig을 용출하였다.얻은 Tim-3-Ig은 1 M Tris-Cl,pH 8.0buffer로 중화하여 이용하였다.
정제한 Tim-3-Ig 융합 단백질은 AKTA FPLC (Amersham Phamacia Biotech,Sweden) 시스템의 high performance column인 Superdex 75 10/300 (Amersham PhamaciaBiotech,Sweden)을 사용하여 정제하였다.
E.마우스 CD4+T 세포의 분리 (MiltenyiBiotecGmbH,Gladbach,Germany)를 이용하였다.먼저 세포수 107당 40㎕의 degassedbuffer(0.5% BSA와 최종 농도 2mM EDTA가 포함된 PBS, pH 7.2)로 세포를 잘 풀어준 뒤,10 ㎕의 non CD4+ T CellBiotin-Antibody Cocktail(MiltenyiBiotecGmbH)를 넣고 잘 섞어서 4℃에서 10분간 반응시켰 다.이후 degassed buffer30 ㎕를 첨가하고,20 ㎕의 Anti-Biotin Microbeads (MiltenyiBiotecGmbH)를 넣고 잘 섞어서 4℃에서 15 분간 반응시켰다.이후 세포를 degassedbuffer로 1회 세척한 후,다시 500㎕의 degassedbuffer로 부 유하였다.세포 부유액을 MACS Seperator(MiltenyiBiotec GmbH)에 부착된 LD column (MiltenyiBiotecGmbH)에 투과시켰다.Column을 degassed buffer 2㎖로 세척한 후,세포 부유액을 통과시킴으로써 column에 결합하지 않은 CD4+ T 세포를 수집하였다.수집한 세포의 일부를 fluorescein isothiocyanate(FITC) 가 결합된 단일클론 항체 anti-CD4 (BD Biosciences Pharmingen)와 phycoerythrin (PE)이 결합된 단일클론 항체 anti-CD25 (BD Biosciences Pharmingen)를 각각 최종농도 1:500으로 염색하였고 유세포분석기 (Flowcytometer,FACS Vantage,Beckon Dickinson,U.S.A)를 이용하여 분석 함으로써 CD4+T 세포 분리 효율 및 CD4+CD25+regulatory T cell의 빈도를 분석하였다.
F.유세포 분석
정제한 Tim-3-Ig 단백질의 리간드에 대한 결합능을 알아보고자 C57BL/6 마우스의 비장 세포에서 분리한 CD4+T 세포에 Tim-3-Ig 단백질의 결합 정도를 유세포 분석기 (BD BiosciencesU.S.A.)를 사용하여 측정하였다.분리한 마우스 CD4+ T 세포를 Tim-3-Ig 융합 단백질,FITC conjugated anti-CD4 Ab 그리고 PE conjugatedanti-CD25Ab와 각각 최종농도 1:500으로 4℃에서 30분간 염색하 였다.이를 2%의 BSA가 포함된 PBS로 두 번 세척한 다음 Biotin-conjugated anti-human IgG (BD Biosciences,Pharmingen)Ab와 Streptavidin-PerCP (BD Biosciences,Pharmingen)Ab를 차례로 반응시켜 Tim-3-Ig이 결합된 세포를 표지 하였고,이를 유세포 분석기로 분석하였다.
Tim-3-Ig발현 벡터가 이입된 3LL 세포주의 GFP 발현 또한 유세포 분석기 를 사용하여 분석하였다.
G.역전사 중합 효소 연쇄 반응 (ReversetranscriptasePCR;RT-PCR)
Tim-3-Ig을 발현하는 3LL 세포주에서 RNA STAT-60TM (Tel-Test,INC., Texas,U.S.A.)을 이용하여 RNA를 분리하였고,분리된 RNA를 주형으로 oligo-dT (Invitrogen,CA,U.S.A.)와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 생산하 였다. 생산된 cDNA를 주형으로 하고 Tim-3에 대한 forward primer인 Tim-3F(NheI)과 사람의 면역 글로불린의 CH2와 CH3부분의 backwardprimer 인 HIgCR(BamHI)을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하여 Tim-3-Ig의 유전 자가 증폭됨을 확인하였다.
H.재조합 baculovirus생산과 곤충 세포 배양
pAcSG2-GP-Tim-3-Ig벡터와 baculoviralGoldDNA를 Spodopterafrugiperda9 (Sf9)세포 (BD Biosciences,Bedford,MA,U.S.A.)에 동시 이입한 후 배양액을 모 음으로써 Tim-3-Ig을 발현하는 재조합 baculovirus를 생산하였다.
Sf9세포를 60mm dish에 1.5×106개 넣은 후,1시간 동안 27℃,CO2가 없 는 배양기에서 정치시켰다. pAcSG2-GP-Tim-3-Ig 3 ㎍과 linearized lethal mutantbaculovirusDNA 0.5㎍ (BD Biosciences)을 FBS가 없는 TNM-FH 배 지 (BD Biosciences) 1 ㎖에 넣고, liposome reagent (DMRIE-C Reagent, GibcoBRL,Gaithersburg,MD,U.S.A.)8㎕가 들어있는 TNM-FH 배지 1㎖을 첨가하였다.이를 실온에서 15분간 정치한 다음,Sf9세포에 넣고,27℃에서 5 시간 배양한 후,FBS를 총량의 20%가 되도록 첨가하였다.배양 4일째 배양액 을 4℃에서 2,500rpm으로 10분간 원심 분리하여 세포 파편을 제거함으로써 재 조합 baculovirus를 얻었다.1차로 얻은 바이러스를 Sf9세포에 감염시켜 바이 러스를 증폭시켰고,2차로 생성된 바이러스를 Sf9세포에 감염시켜 3차 바이
Sf9세포를 60mm dish에 1.5×106개 넣은 후,1시간 동안 27℃,CO2가 없 는 배양기에서 정치시켰다. pAcSG2-GP-Tim-3-Ig 3 ㎍과 linearized lethal mutantbaculovirusDNA 0.5㎍ (BD Biosciences)을 FBS가 없는 TNM-FH 배 지 (BD Biosciences) 1 ㎖에 넣고, liposome reagent (DMRIE-C Reagent, GibcoBRL,Gaithersburg,MD,U.S.A.)8㎕가 들어있는 TNM-FH 배지 1㎖을 첨가하였다.이를 실온에서 15분간 정치한 다음,Sf9세포에 넣고,27℃에서 5 시간 배양한 후,FBS를 총량의 20%가 되도록 첨가하였다.배양 4일째 배양액 을 4℃에서 2,500rpm으로 10분간 원심 분리하여 세포 파편을 제거함으로써 재 조합 baculovirus를 얻었다.1차로 얻은 바이러스를 Sf9세포에 감염시켜 바이 러스를 증폭시켰고,2차로 생성된 바이러스를 Sf9세포에 감염시켜 3차 바이