Tim-3-Ig 발현 종양 세포의 종양 성장 둔화가 Tim-3-Ig의 효과인지 알아 보고자 3LL 종양 모델에 Tim-3-Ig단백질을 투여한 후 종양 성장을 관찰하였다 (Fig.11).3LL 세포를 주사한 마우스에 종양 주사 직후와 2 일째 4 일째 Tim-3-Ig단백질을 정맥주사 하였다.
PBS 혹은 human IgG를 주사한 대조군 마우스 그룹에서는 종양 세포를 주 사한 후 3일째 두 마리의 마우스에서 종양이 생성되기 시작하였고,5일째 세 마리 모두에서 종양이 생성되었다.반면 Tim-3-Ig을 주사한 세 마리의 마우스에 서는 7일 째 종양이 생성되었다.또한,PBS 또는 humanIgG를 주사한 대조군 마우스의 종양 성장 속도가 Tim-3-Ig을 주사한 마우스의 종양 성장 속도보다 빠른 경향을 보였다.마우스의 종양의 크기는 대조군에 비해서 50.5% 크기였다.
이로보아 Tim-3-Ig을 주사하였을 때 종양의 부피 증가가 둔화되는 것을 관찰할 수 있었다.이러한 결과는 Tim-3-Ig이 종양 성장을 억제할 수 있음을 보여준다.
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FFiiiggg...111111...EEEffffffeeeccctttooofffTTTiiimmm---333---IIIggg aaadddmmmiiinnniiissstttrrraaatttiiiooonnn ooonnn tttuuummmooorrrgggrrrooowwwttthhhiiinnn vvviiivvvooo... C57BL/6 mice were injected with 3×1053LL cells ofintravenously injected intomice.Threedosesof150㎍ Tim-3-Ig wereinjected intothetailveins ofmiceon days0,2and 4after3LL injection.Ascontrol,sameamountof humanIgorPBS wasadministered.Thedatarepresentedaremeanoftumor volumeof3miceineachgroup.
Ⅳ
본 연구 결과는 악성 흑색종 모델에서 Tim-3의 splicing variant(sTim-3)
장을 억제할 수 있다.Tim-3에 대한 항체 투여로 CD11b+단구 수와 기능이 항진 됨이 보고되었으므로 Tim-3-Ig의 투여로 단구의 수와 활성의 증가가 일어나 종 양 면역 증진을 유도할 가능성이 있다.
본 연구에서는 baculovirus를 이용하여 Tim-3-Ig을 생산하고 이의 ligand결 합력을 분석함으로써 Tim-3가 ligand에 결합할 때 Tim-3의 glycosylation이 매우 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다.CHO 세포에서 생산된 Tim-3-Ig과 마찬가지로 baculovirus에 감염된 곤충세포에서 생산한 Tim-3-Ig도 glycosylation이 되었으 나 ligand에 잘 결합하지 않았다.이는 곤충세포에서 일어나는 glycosylation이 CHO 세포에서 일어나는 것과 차이가 있음을 시사한다.또한 이는 효소를 이용 하여 Tim-3의 glycosylation을 제거하거나 혹은 lactose가 있는 조건에서는 Tim-3가 Tim-3L와 결합하지 않는다는 보고와 상응한다.따라서 baculovirus를 이용한 발현 시스템의 장점에도 불구하고 이 시스템은 Tim-3-Ig 생산에는 적합 하지 않음을 알 수 있었으며, 포유동물 세포에서 일어나는 glycosylation이 Tim-3의 ligand결합에 필요함을 알게 되었다.
요약하면,본 연구에서 Tim-3-Ig의 종양 억제 효과가 밝혀졌으며,부수적으 로 Tim-3 당화가 Tim-3―Tim-3L 결합에 중요함이 밝혀졌다.본 연구 결과는 Tim-3경로 조절을 통한 종양 면역 증진 가능성을 보여주며 Tim-3경로 조절 을 위한 Tim-3-Ig생산 방법 선택에 도움을 주리라 생각한다.
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ. . .결 결 결 론 론 론
본 연구에서는 Tim-3-Ig이 종양의 성장에 미치는 영향을 연구하고자,포유 동물 세포인 CHO 세포에서 Tim-3-Ig 단백질을 발현시키고 이를 분리․정제하 는 방법을 확립하고,아울러 마우스에 종양을 발병시키는 실험계도 확립하였다.
Tim-3-Ig를 종양 세포인 3LL 세포에서 발현하게 하여 이 세포를 피하 주사한 마우스에서 종양의 성장을 관찰하였다.그 결과,대조군 세포와 달리 Tim-3-Ig 가 발현되는 종양 세포를 주사한 마우스에서 종양이 성장하지 않음을 관찰하였 다.이러한 결과가 3LL에서 발현하고 있는 Tim-3-Ig의 영향인지 확인하기 위하 여 3LL 세포를 피하 주사한 마우스에 정제한 Tim-3-Ig을 정맥 주사하고 종양의 성장을 관찰한 결과 Tim-3-Ig을 주사한 마우스에서 종양 성장이 PBS와 사람의 면역 글로불린을 주사한 대조군에 비해 둔화되어 3LL 주사 3주 후 종양의 크기 를 비교할 때 Tim-3-Ig을 주사한 마우스의 종양 크기가 대조군 마우스의 종양 크기의 50% 정도임이 관찰되었다.따라서 Tim-3-Ig은 종양의 성장을 저해하는 기능이 있음을 알 수 있었다.
참 참
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ABSTRACT mucin-containing-domain)familyofmolecules,isthefirstmoleculeidentified to be specifically expressed on CD4+ Th1 and noton Th2 cells.Tim-3 negatively regulates Th1 immunity and induces tolerance,butit's function has notbeen clarified in tumor immunity.To explore the effectofTim pathway blockade on tumor growth using Tim-3-Ig fusion protein,two approaches were adopted. First, it was investigated whether Tim-3-Ig expression in lung carcinoma cells (3LL) affects tumor growth in mice.
Second,itwasinvestigatedwhetheradministrationofpurifiedTim-3-Ig into mice influences tumor growth. Tumor growth of 3LL cells expressing Tim-3-Ig wassuppressed ascompared with controlmousegroups.Further tumor growth in mice injected with purified Tim-3-Ig was inhibited as compared with controlmouse groups injected with human Ig and PBS, respectively. Additionally, Mammal I revealed the importance of Tim-3 glycosylation for its binding activity to Tim-3 ligand using Tim-3-Ig expressed by mammalian cells and by Sf9 cells.My results showed
suppressive effectofTim-3-Ig on tumorgrowth,implying significance of Tim-3-Tim-3ligandpathwayintumorimmunology.
K
KKeeeyyy wwwooorrrdddsss:T cellimmunoglobulin- and mucin domain-3 (Tim-3),tumor growth, glycosylation, mammalian expression vector system, Baculovirus expressionvectorsystem,tumorimmunity