The Effect of Tim-3-Ig on Tumor Growth

의

의

의학

학

학 석

석

석사

사

사학

학

학위

위

위 논

논

논문

문

문

T

T

Ti

i

im

m

m-

-

-3

3

3-

-

-I

I

Ig

g

g이

이

이

종

종

종양

양

양 성

성

성장

장

장에

에 미

에

미

미치

치

치는

는

는 영

영

영향

향

향

아

아

아 주

주

주 대

대

대 학

학

학 교

교

교 대

대

대 학

학

학 원

원

원

의

의

의 학

학

학 과

과

과

허

허

허 유

유

유 미

미

미

T

T

Ti

i

im

m

m-

-

-3

3

3-

-

-I

I

Ig

g

g이

이

이

종

종

종양

양

양 성

성

성장

장

장에

에

에 미

미

미치

치

치는

는

는 영

영

영향

향

향

지

지

지도

도

도교

교

교수

수

수 박

박

박

선

선

선

이

이

이 논

논

논문

문

문을

을

을 의

의학

의

학

학 석

석

석사

사

사학

학

학위

위

위 논

논

논문

문

문으

으

으로

로 제

로

제

제출

출

출함

함

함.

.

.

2

2

20

0

00

0

07

7

7년

년

년 2

2

2월

월

월

아

아

아 주

주

주 대

대

대 학

학

학 교

교

교 대

대

대 학

학

학 원

원

원

의

의

의 학

학

학 과

과

과

허

허

허 유

유

유 미

미

미

허

허

허유

유

유미

미

미의

의 의

의

의

의학

학

학 석

석

석사

사

사학

학

학위

위

위 논

논

논문

문

문을

을 인

을

인

인준

준

준함

함

함.

.

.

심

심

심사

사

사위

위

위원

원

원장

장

장

이

이

이 은

은

은 소

소

소

인

인

인

심

심

심 사

사

사 위

위

위 원

원

원

박

박

박

선

선

선

인

인

인

심

심

심 사

사

사 위

위

위 원

원

원

권

권

권 명

명

명 희

희

희

인

인

인

아

아

아 주

주

주 대

대

대 학

학

학 교

교

교 대

대

대 학

학

학 원

원

원

2

2

20

0

00

0

06

6

6년

년

년 1

1

12

2

2월

월

월 2

2

22

2

2일

일

일

국문요약

-T

T

Ti

i

im

m

m-

-

-3

3

3-

-

-I

I

Ig

g

g이

이

이 종

종양

종

양

양 성

성

성장

장

장에

에

에 미

미

미치

치

치는

는

는 영

영

영향

향

향

Tim-3는 T 세포 immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecules(TIMs)의 한 family로서 보조 T 세포 1형에서 특이적으로 발현하는 분자로 발견되었다.이 분자는 그 ligand와 결합하여 Th1세포의 면역반응을 억 제하고 면역관용 유도에 관여한다고 알려져 있으나 종양면역에서 Tim-3의 역 할에 대해서는 많이 연구된 바 없다.본 연구에서는 Tim-3와 Tim-3ligand결 합을 방해할 수 있는 Tim-3-Ig(Tim-3와 면역글로불린의 융합 단백질)이 종양 성장에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.본 연구에서 두 가지 연구 방법을 취 하였다.첫째,Tim-3-Ig을 발현하도록 만든 폐 종양 세포주 3LL의 종양 성장을 대조군 세포의 종양 성장과 비교하였다.둘째,Tim-3-Ig을 생산 정제하여 3LL 종양 모델에 투여한 후 3LL의 종양 성장을 관찰하였다.그 결과 3LL 세포의 Tim-3-Ig 발현 혹은 정제된 Tim-3-Ig의 투여에 의해 마우스 내 3LL 종양 성 장이 억제되었다.부수적으로 포유동물 세포와 곤충세포를 이용한 Tim-3-Ig의 생산법을 비교하여 Tim-3-Ig의 glycosylation이 Tim-3―Tim-3L 결합에 중요 함을 관찰하였다.본 연구 결과는 Tim-3-Ig이 종양성장에 억제작용을 할 수 있 음을 밝힘으로써 종양면역에서 Tim-3―Tim-3L경로의 중요성을 시사한다.

핵심되는 말:T cellimmunoglobulin- andmucin domain-3(Tim-3),종양면역, 당화

차

차

차

례

례

례

국문요약 ···ⅰ 차례 ···ⅱ 그림 차례 ···ⅳ 표 차례 ···ⅵ Ⅰ.서론 ···1 A.Tim-3···1

B.Baculovirus를 이용한 단백질 발현 시스템 ···4

C.종양과 Tim-3···4

D.연구 목적 ···5

Ⅱ.재료 및 방법 ···6

A.Tim-3-Ig발현 벡터의 제조 ···6

B.Tim-3-Ig발현 벡터의 이입 ···9

C.WesternBlotAnalysis···10

D.친화성 크로마토그래피와 고분자 액체 크로마토그래피 ···10

E.마우스 CD4+_{T 세포의 분리 ·········································································11}

F.유세포 분석 ···12

G.역전사 중합 효소 연쇄 반응 ···12

H.재조합 baculovirus생산과 곤충 세포 배양 ···13

I.마우스에서 종양 성장 측정 ···14

Ⅲ.결과 ···15

B.Tim-3-Ig발현 벡터 생산 ···16 C.포유동물 세포에서 Tim-3-Ig의 생산․정제 및 리간드 결합능 분석 ···18 D.Tim-3-Ig을 발현하는 3LL 세포주 확립 ···21 E.3LL 세포의 Tim-3-Ig발현이 종양 성장에 미치는 영향 ···23 F.곤충 세포에서 Tim-3-Ig의 생산과 정제 및 이의 리간드 결합능 분석 ···26 G.Tim-3-Ig의 투여가 종양의 성장에 미치는 영향 ···28 Ⅳ.고찰 ···30 Ⅴ.결론 ···33 참고문헌 ···34 ABSTRACT ···43

그

그

그 림

림

림 차

차

차 례

례

례

Fig.1.DeducedaminoacidsequencesofmurineTim-3proteinsfrom

threedifferentmousestrainsofBalb/c,AKR andDBA/2···15

Fig.2.ConstructionofvectorsforTim-3-Igexpression···17

Fig.3.Tim-3-IgexpressedinCHO cellstransfectedwith pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig···19

Fig.4.PurificationofTim-3-Igfrom thetransfectedCHO cells···20

Fig.5.ThebindingactivityofTim-3-IgproducedbyCHO cells···20

Fig.6.EstablishmentofstablecelllinesexpressingTim-3-Ig···22

Fig.7.Thetumorgrowthinmiceinoculatedwith3LL celllines expressingTim-3-Ig···24

Fig.8.Thephotographofmicewithtumors···25

Fig.9.TheexpressionandpurificationofTim-3-Igprotein producedinSf9cells···27

Fig.10.ThebindingactivityofTim-3-Igproduced

bySf9cells···27 Fig.11.EffectofTim-3-Igadministrationontumorgrowth

표

표

표 차

차

차 례

례

례

Table1.PrimersforamplificationofTim-3andhumanIg

Ⅰ

Ⅰ

Ⅰ.

.

.서

서

서 론

론

론

A.Tim-3

Tim-3는 T 세포 immunoglobulin variable region (IgV)―like domain and mucin-domain-containing molecules (TIMs)family에 속 하 는 분 자 로 서 보조 T 세포 1형 (Th1세포)에서 특이적으로 발현되고 보조 T 세포 2형 (Th2세포)에서는 발현되지 않는 분자로 발견되었다 (Monney 등,2002).Tim-3 는 ligand와 결합하여 Th1세포 면역을 조절하고 다발 경화증이나 천식,실험적 모 델의 뇌척수염 등의 면역 관련된 질병과 관련이 있음이 보고되고 있다 (Sabatos등, 2003;Zhu등,2005). TIMsfamily를 구성하는 분자는 마우스 염색체 11B1.1에서 8개,사람 염색 체 5q33.2에서 3개가 보고되고 있다.각각의 유전자는 서로 상동성을 보이는데, 특히 마우스의 Tim-1과 Tim-2는 사람의 TIM-1과 각각 32%,42%의 염기서열 상동성을 보이고,마우스의 Tim-3와 Tim-4는 사람의 TIM-3,TIM-4와 각각 63%,49%가 동일함이 확인되었다 (Kuchroo 등,2003).각각의 유전자는 signal sequence에 이어 IgV-likedomain과 mucinlikedomain,transmembranedomain 과 intracellulartail로 구성되어있다.마우스의 Tim-1,Tim-2 그리고 Tim-3는 intracellulartail에 타이로신 인산화 모티프를 가지고 있는 반면 Tim-4는 타이로 신이 없는 짧은 intracellular tail을 가지고 있고,이 때문에 Tim-4는 decoy receptor로서 작용하거나 세포막에 신호 전달을 변환해주는 signaling partner를 가질 것이라 제시되고 있다 (Kuchroo 등,2003).이들은 서로 아미노산 서열에 있어서도 유사성을 보이고 면역학적 기능에서도 유사하리라고 생각되고 있다. 사람과 마우스의 Tim-3 발현이 주로 Th1 세포에서 관찰되었다.CD4+_Th 세포의 소집단은 크게 Th1 세포와 Th2 세포로 나뉜다.이들 두 소집단은 생 산․분비하는 사이토카인도 다르고 관여하는 면역 반응도 다르다.Th1세포는 일 반적으로 세포내 병원체에 대한 세포성 면역반응,지연형 과민반응,조직 특이적

인 자가 면역질환과 연관된 인터페론 (interferon;IFN)―γ,인터루킨 (interleukin; IL)―2,종양괴사인자 (tumornecrosisfactor;TNF)―α와 lymphotoxin과 같은 사 이토카인을 생산한다.또한,대식세포 (macrophage)의 활성에 중요하며,세포 내 병원체를 제거하는 역할을 한다.Th1세포의 반응이 적절하지 않으면 병리학적으 로 지연형 과민반응과 기관 특이적 자가 면역 질환이 유도된다.한편,Th2세포 는 세포 외 기생충 감염과 연관되어있고,아토피나 알레르기성 질환을 촉진하는 사이토카인인 IL-4,IL-5,IL-10,IL-13을 생산하며,IgE의 생산과 호산구성 염증 (eosinophilicinflammation)에 특히 중요하다.Th2세포의 반응이 적절하지 않으 면 병리학적으로 알레르기와 천식 등이 유도된다 (Paul등,1994).Tim-3는 Th1 클론과 Th1세포로 유도하는 조건에서 분화된 T 세포에서 발현되며 실험적인 자 가 면역 뇌척수염 (experimentalautoimmuneencephalitis;EAE)환자의 IFN-γ

생산 T 세포에서 발현된다.Tim-3는 Th2클론에서는 발현되지 않지만 CD11b+ 세포 일부에서 발현되고 NK 세포와 NKT세포에서 Tim-3transcript가 발견되었 다 (Sabatos등,2003). Tim-3는 Th1 면역을 억제하고 면역 관용에 관여한다 (Anderson 과 Anderson,2006).Tim-3의 기능을 규명하기 위한 연구 초기에는 Tim-3에 대한 항 체를 투여하여 EAE를 유발시키는 모델이 이용되었다.이 모델에서 Tim-3의 항체 를 처리한 마우스에서 사망률이 증가하고, 중추신경계에서 염증이 증가하며, CD11b+ _{세포의 활성과 수가 증가하는 초급성 질병이 유발되었다 (Monney 등,}

2002).이에 이어서,Tim-3세포외 부분 단백질에 면역글로불린 (immunoglobulin; Ig)을 융합한 Tim-3-Ig단백질을 마우스에 주사한 결과,Th1세포의 증식이 증가 하였으며 IFN-γ와 IL-2의 Th1사이토카인 생산이 증가함을 관찰하였다 (Sabatos 등,2003).이들 결과로부터 T 세포나 다른 항원표지세포 (antigenpresentingcell; APC)에 발현하고 있는 Tim-3ligand(Tim-3L)에 수용성 Tim-3-Ig이 결합함으로 써 Th1세포의 Tim-3가 Tim-3L와 결합하지 못하게 되고,결과적으로 Tim-3를 통한 Th1 세포성 면역이 조절되지 못하게 된다고 제기되었다 (Anderson 과 Anderson,2006).

Tim-3L의 발현은 Tim-3-Ig이 결합하는 세포를 분석함으로써 알려졌다 (Sabatos등,2003).Tim-3-Ig 융합 단백질은 CD11b+_{인 대식세포 일부와 CD11b}+ 인 수지상세포 일부와 같은 세포에도 약하게 결합하지만 특히 naiveCD4+_{T 세포} 에서 높은 발현 레벨이 유지됨이 확인되었다 (Mayers등,2005).NaiveCD4+_{T 세포} 가 활성화되기 전에는 CD4+_CD25+_{와 CD4}+_CD25-_{인 T 세포 모두가 ligand를 발} 현했지만,α-CD3와 α-CD28그리고 IL-2로 활성화시킨 후에는 CD4+_CD25+_{인 T} 세포만이 Tim-3L를 발현하고 있는 것이 확인되었다.(Sabatos등,2003).

Tim-3에 대한 ligand로서 galectin-9이 최근에 동정되었다.Galectin-9은 galectinfamily의 한 member로서 두 개의 carbohydrate-recognitiondomain을 가 지고 있고,이들이 carbohydrate를 인지하는데 있어서 매우 중요하다고 알려져 있 다 (Matsushita 등,2000).Galectin-9은 Tim-3와 결합을 하고 이 결합에는 Tim-3의 IgV 도메인이 중요할 것으로 생각되고 있다.왜냐하면 Tim-3의 mucin 도메인이 없는 형태의 Tim-3가 galectin-9과 결합하였기 때문이다.한편,Tim-3 와 galectin-9의 결합이 α-lactose의 존재 하에서는 억제되므로 Tim-3의 당화가 galectin-9의 결합에 중요함이 밝혀졌다 (Zhu 등,2005).Galectin-9은 Th1세포 에 발현한 Tim-3와 결합하여 Th1세포의 calcium flux를 유도하고 invitro에서 세포의 응집과 세포사를 유도함이 보고되었다.또한,EAE 모델 마우스에 invivo 로 galectin-9을 투여하면 IFN-γ를 생산하는 T 세포가 선택적으로 제거되고 마 우스의 EAE 증상이 개선되는 결과가 유도됨이 밝혀졌다 (Zhu등,2005).종합하 여 보면,Tim-3―galectin-9경로를 통하여 활성 Th1세포가 제거되고 그 결과 Th1세포 면역이 억제됨이 보고되었다 (Anderson과 Anderson,2006).

사람의 질병에서 Tim-3와 관련한 최근 연구 결과는 Tim-3가 면역 병인 기 전에 관여할 것을 제시하고 있다 (Meyers등,2005).다발경화증 환자에서 분리 한 T 세포 클론에서 IFN-γ의 분비가 IFN-γ 를 분비하는 Th1대조군에 비해 증 가되어 있었으나 Tim-3의 발현 수준은 오히려 대조군보다 낮았다.더욱이 환자 CD4T 세포에서 smallinterfering RNA (siRNA)를 이용하여 Tim-3발현을 낮 추면 CD4T 세포의 증식과 IFN-γ 분비가 증가함을 관찰하였다.Koguchi등은

이를 다발 경화증에서 Tim-3발현 조절 결함에 의해 IFN-γ를 생산하는 T 세포 의 증식과 활동이 증가하여 다발경화증이 발생하도록 유도되는 것이라는 해석을 제시하였다 (Koguchi등,2006).

B.Baculovirus를 이용한 단백질 발현 시스템

기존의 연구에서는 Tim-3-Ig 융합 단백질을 포유동물 세포인 CHO 세포를 이용하여 생산하였다 (Monney 등,2002;Okinawa 등,2006).본 연구에서는 Tim-3의 세포외 부분에 많은 glycosylationsite가 있는 점을 고려하여,진핵세포 발현 시스템을 이용하여 Tim-3-Ig을 발현 하고자 하였다.Baculovirus를 이용한 단백질 발현 시스템의 다음과 같은 장점을 가지고 있다.첫째,baculovirus는 사람 이나 척추동물에는 병원성이 없고 오직 곤충에만 병원성을 가지고 있다.둘째, baculovirus에서 만들어지는 단백질은 감염세포 내에서 세포내 전체 단백질의 30-50% 수준까지 대량으로 합성된다.셋째,baculovirus를 이용한 단백질 발현은 원핵세포에서 발현된 단백질과 달리 단백질의 glycosylation 혹은 phosphorylation 이 일어날 수 있다 (Kost등,2005).넷째,baculovirus를 이용한 단백질 발현은 포유동물 세포를 이용한 단백질 발현에 비해 대량생산이 쉽고 비용이 적게 든다. 따라서 본 연구에서는 baculovirus와 Sf9곤충세포를 이용하여 Tim-3-Ig를 생산 하고 이의 ligand결합력을 포유동물 세포주에서 생산한 Tim-3-Ig과 비교하였다. C.종양과 Tim-3 종양 면역에서 Tim-3기능의 중요성은 충분히 연구되지 않았다.악성 흑색 종 마우스 모델에서 Tim-3splicing variant가 발현되도록 하면 종양 성장이 증 가하고.종양에 대한 세포독성 T 림프구 (cytotoxicT lymphocyte;CTL)의 활성 이 감소되었으며,Th1 사이토카인 유전자의 발현이 감소되었다.조절 T 세포 (regulatoryT cell;Treg)의 기능과 관련된 유전자는 변화하지 않는 양상을 보임

을 밝혔다 (Geng,2006).또한 Tim-3와 T-bet을 발현하는 종양에 특이한 Th1 세포를 입양면역 (adoptive immunotherapy)하면 종양 세포의 성장을 억제하는 세포 독성 반응이 유도됨이 보고되었다 (Simmons등,2005).그러나 Tim-3-Ig 의 발현이 종양의 성장에 어떠한 영향을 미치는지에 관해서는 아직까지 연구되 지 않았다. D.연구 목적 Tim-3경로가 Th1세포의 면역 조절과 면역 관용에 중요함이 밝혀져 있으나, 이 경로의 억제가 종양 성장에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았으므로 본 연구 에서는 Tim-3경로를 억제할 수 있는 Tim-3-Ig을 이용하여 이를 밝히고자 하였 다.이를 위하여 Tim-3-Ig을 발현하는 종양 세포를 마우스에 투여하여 종양 성 장의 변화를 관찰하였고 또한 정제한 Tim-3-Ig 단백질을 투여한 마우스에서 종 양 성장을 측정하였다.

Ⅱ

Ⅱ

Ⅱ.

.

.재

재

재료

료

료 및

및

및 방

방

방법

법

법

A.Tim-3-Ig발현 벡터의 제조

Balb/c마우스의 비장세포를 분리하여 24wellplate에 106_{개의 세포를 넣}

고,ConA 1㎍으로 48시간 동안 자극한 후 세포를 모았다.모은 세포에서부터 RNA-Bee-RNA isolationreagent(Tel-Test,Inc.,U.S.A.)를 이용하여 RNA를 분리하였고,이를 주형으로 oligo-dT (Invitrogen,CA,U.S.A.)를 이용하여 cDNA를 생산하였다.생산된 cDNA를 주형으로,Tim-3에 대한 primer를 이용하 여 중합효소 연쇄반응 (polymerasechainreaction;PCR)을 시행하고,PCR 산물 을 TopoTA cloning 벡터 (Invitrogen,CA,U.S.A.)에 cloning함으로 Balb/c 마우스의 Tim-3 유전자 (AY553334)를 확보하였다.pTOPO-Tim-3 플라스미드 를 주형으로,Tim-3F(NheI)와 Tim-3R(BglII)primer셋트를 이용하여 Tim-3의 signal펩티드와 immunoglobulin V likedomain과 mucin domain을 증폭하였다 (Table1).TaKaRaTaqTM _{(Takarabiomedicals,Korea)을 이용하여 PCR을 다}

음과 같은 온도 조건으로 진행하였다.95℃에서 5분 후에,95℃ 1분,55℃ 30초, 72℃ 1분 30초로 5cycles를 수행한 후,95℃ 1분,61℃ 30초,72℃ 1분 30초 로 20cycles를 수행하였다.증폭된 PCR 산물을 pGEM T-Easy 벡터 (Promega, Madison,U.S.A.)에 T4DNA Ligase(Invitrogen,CA,U.S.A.)를 이용하여 삽입한 후 삽입된 유전자의 염기서열을 분석하였다.염기서열이 확인된 Tim-3 유전자를 pIRES2-EGFP의 NheI과 BglII site에 subcloning 함으로써 pIRES2-EGFP-Tim3벡터를 제작하였다.

한편,TOPO-humanIgG1constantregiongene(아주대 권명희 박사 제공) 을 주형으로,primerHIgCF(BglII)와 HIgCR(BamHI)을 이용하여 CH2와 CH3 부위 유전자를 증폭하였다 (Table1).TaKaRaTaqTM_{을 이용하여,95℃ 1분 후}

에,95℃ 1분,60℃ 30초,72℃ 1분 30초로 30cycles로 PCR을 수행하였고, 증폭된 유전자는 pTOPO 2.1벡터 (Invitrogen,Groningen,Netherlands)에 삽입

한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열이 확인된 CH2-CH3 유전자를 pIRES2-EGFP-Tim-3의 BglII와 EcoRIsite에 삽입하여 pIRES2-EGFP-Tim3-Ig 벡터를 제작하였다.

곤충 세포에서 Tim-3-Ig를 발현하기 위해 재조합 baculovirus를 생산하였다. 먼저 baculoviral transfer 벡터 pAcSG2에 pAcGP67B의 leader sequence를 subcloning하여 Tim-3-Ig이 배지로 분비되는 벡터 backbone을 만들었다.마우스 의 TIM-3는 pTOPO-Tim-3를 주형으로 Tim-3F(BamHI)와 Tim-3R(EcoRI) primer 셋트를 이용하여 Tim-3의 immunoglobulin V like domain과 mucin domain을 증폭하였다 (Table1).TaKaRa TaqTM_{을 이용하여 다음과 같은 온도}

조건으로 PCR을 진행하였다.95℃ 5분 후에,95℃ 1분,44℃ 30초,72℃ 1분 30초로 5cycles를 수행한 후,95℃ 1분,62℃ 30초,72℃ 1분 30초로 20 cycles를 수행하였다.증폭된 유전자는 pTOPO 2.1벡터에 삽입한 후 염기서열을 분석하였고,염기서열이 확인된 Tim-3 유전자를 BamHI과 EcoRI을 이용하여 pAcSG2-GP67backbone벡터에 삽입하였다.

한편,CH2와 CH3유전자는 TOPO-human IgG1constantregion gene을 주 형으로 primer CH2CH3F(EagI)와 CH2CH3R(BglII)을 이용하여 증폭하였다 (Table1).TaKaRaTaqTM_{을 이용하여 다음과 같은 온도 조건으로 PCR을 진행하}

였다.95℃ 1분 후에,95℃ 1분,60℃ 30초,72℃ 1분 30초로 30cycles를 수행 하였다.증폭된 유전자는 pGEM T-Easy벡터에 삽입한 후 염기서열을 분석하였고, 염기서열이 확인된 CH2-CH3유전자는 Tim-3를 넣은 pAcSG2-GP67-Tim-3벡터 의 EagI과 BglIIsite에 삽입함으로써 pAcSG2-GP-Tim-3-Ig벡터를 제작하였다.

T

TTaaabbbllleee111...PPrPrriiimmmeeerrrsssfffooorrraaammmpppllliiifffiiicccaaatttiiiooonnonoofffTTTiiimmm---333aaannndddhhhuuummmaaannnIIIgggcccooonnnssstttaaannntttrrreeegggiiiooonnn Primer Nucleotidesequence

Tim-3F(NheI) GCTAGCATGTTTTCAGGTCTTACCCTCAACTGTG Tim-3R(BglII) AGATCTTCTGATCGTTTCTCCAGAGTCCTTAATTTCA

TCAG

HIgCF(BglII) GAAGATCTGCACCTGAACTCCTGGGG HIgCR(BamHI) CGGGATCCTCATTTACCCTGCGACAG

Tim-3F(BamHI) GGATCCTTGGAAAATGCTTATGTGTTTGAGGTTG Tim-3R(EcoRI) GAATTCTCTGATCGTTTCTCCAGAGTCCTTAATTTCA

TC

CH2CH3F(EagI) CGGCCGAGCACCTGAACTCCTGG

CH2CH3R(BglII) AGATCTTCATTTACCCTGCGACAGGGAGAG

B.Tim-3-Ig발현 벡터의 이입

Tim-3-Ig을 발현하는 pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig 벡터 DNA를 Chinesehamster ovary(CHO)세포에 polyethylenimine(PEI,Polysciences,Inc.,PA,U.S.A.)을 이 용하여 한시적으로 이입 (transienttransfection)하였다.Opti-MEM 600㎕와 정제한 DNA 16㎍ 그리고 1㎎/㎖ 농도의 PEI16㎕를 5㎖ tube에 넣고 잘 섞어준 후 실온에서 10분간 정치하였다.Viability가 98% 이상인 2× 106_{개의 CHO 세포가}

배양된 100mm dish에 10%의 우태아혈청 (fetalbovineserum;FBS,GibcoBRL) 이 포함된 Dulbeco'smodified eaglemedium (DMEM,GibcoBRL)4㎖에 넣고 24 시간동안 37℃,5% CO2 배양기에서 배양한 다음,FBS가 포함되지 않은

DMEM 배지 10㎖로 교체하였다.이후 2일간 37℃,5% CO2배양기에서 배양한

후 배양액을 수집하였다.이입이 잘 되었는지는 배지를 교체한 뒤 형광 현미경으 로 확인하였다.

한편,Tim-3-Ig 융합 단백질을 발현하는 종양 세포주를 확립하기 위하여 pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig를 C57BL/6유래 LewisLung Carcinoma(3LL)세포 주에 이입하였다.Viability가 98% 이상인 1× 106_{개의 3LL 세포를 60mm dish}

에 넣고 밤새 배양한 후 Lipofectamin2000(Invitrogen,CA,U.S.A.)을 이용하 여 벡터 DNA를 이입하였다.정제한 벡터 DNA 8 ㎍ 과 1 ㎎/㎖ 농도의 Lipofectamin2000reagent20㎕를 각각 500㎕의 Opti-MEM에 넣고 잘 섞어준 후 실온에서 5분간 정치하였다.이를 합하여 다시 잘 섞어준 후 실온에서 20분 간 정치한 후, 이를 배양한 세포에 넣어주었다. G418 (Duchefa, Haarlem, Netherlands)이 2㎎/㎖로 포함된 배지에서 이입된 세포를 선택 증식시켰다.한 계희석 배양법과 형광 현미경 확인을 이용하여 두 번의 클로닝과정을 거쳐 GFP를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하였다.

C.WesternBlotAnalysis

Tim-3-Ig 발현 벡터를 한시적으로 이입한 뒤 수집한 세포 배양액에 SDS-PAGE sample loading buffer를 첨가하고,5 분간 끓인 후 10% sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)gel에 적하하여 80V (voltage)로 전기 영동하였다.이 acrylamidegel의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF,miliporeCo.,Bedford,MA,U.S.A.)막으로 250mA (Amphere) 에서 2시간 전기 이동시킨 후 3% BSA-PBS로 실온에서 한 시간 동안 반응시켰 다.막을 세척한 후 HRP가 결합된 anti-human IgG 항체를 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다.충분히 세척한 후 enhancedchemicalluminescence(ECL,Amersham Biosciences,Buckinghamshire,England)로 Tim-3-Ig의 band를 확인하였다. D.친화성 크로마토그래피와 고분자 액체 크로마토그래피

Tim-3-Ig융합 단백질의 정제는 ProteinA SaccharoseFastFlow (Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)를 사용한 친화성 크로마토그래피와 고분자 액체 크 로마토그래피 (Fastproteinliquidchromatography;FPLC)를 이용하였다.

친화성 크로마토그래피는 다음과 같이 수행하였다.20% ethanol에 suspension 상태로 있는 500 ㎕의 protein A agarose bead를 취하여 packaging한 column을 1×PBS 1 ℓ로 충분히 세척한 후,모아놓았던 CHO 세포 배양액을 여과한 후에 proteinA agarose와 반응시켰다.반응시킨 proteinA agarosecolumn을 인산완충 식염수로 충분히 세척한 후 pH 3.0의 0.1 M glycine buffer(elution buffer)로 protein A agarose에 결합된 Tim-3-Ig을 용출하였다.얻은 Tim-3-Ig은 1 M Tris-Cl,pH 8.0buffer로 중화하여 이용하였다.

정제한 Tim-3-Ig 융합 단백질은 AKTA FPLC (Amersham Phamacia Biotech,Sweden) 시스템의 high performance column인 Superdex 75 10/300 (Amersham PhamaciaBiotech,Sweden)을 사용하여 정제하였다.

E.마우스 CD4+_{T 세포의 분리}

CHO 세포와 Sf9세포에서 생산․정제한 Tim-3-Ig 단백질의 리간드 결합 능을 분석하기 위해 리간드를 발현한다고 보고된 CD4+_{T 세포를 분리하였다.수}

컷 C57BL/6마우스의 비장과 림프절을 분리한 후 세포분리망을 이용하여 단일 세포 부유액을 만들었다. Ficoll 액 (Lympholyte-M,Cedarlane laboratories, hordy,Canada)을 이용하여 세포 부유액에서 림프구를 분리하였다.수집한 림프 구에서 CD4+ _{T 세포를 분리하기 위해서 mouse CD4}+ _{T CellIsolation Kit}

(MiltenyiBiotecGmbH,Gladbach,Germany)를 이용하였다.먼저 세포수 107_당

40㎕의 degassedbuffer(0.5% BSA와 최종 농도 2mM EDTA가 포함된 PBS, pH 7.2)로 세포를 잘 풀어준 뒤,10 ㎕의 non CD4+ _{T CellBiotin-Antibody}

Cocktail(MiltenyiBiotecGmbH)를 넣고 잘 섞어서 4℃에서 10분간 반응시켰 다.이후 degassed buffer30 ㎕를 첨가하고,20 ㎕의 Anti-Biotin Microbeads (MiltenyiBiotecGmbH)를 넣고 잘 섞어서 4℃에서 15 분간 반응시켰다.이후 세포를 degassedbuffer로 1회 세척한 후,다시 500㎕의 degassedbuffer로 부 유하였다.세포 부유액을 MACS Seperator(MiltenyiBiotec GmbH)에 부착된 LD column (MiltenyiBiotecGmbH)에 투과시켰다.Column을 degassed buffer 2㎖로 세척한 후,세포 부유액을 통과시킴으로써 column에 결합하지 않은 CD4+

T 세포를 수집하였다.수집한 세포의 일부를 fluorescein isothiocyanate(FITC) 가 결합된 단일클론 항체 anti-CD4 (BD Biosciences Pharmingen)와 phycoerythrin (PE)이 결합된 단일클론 항체 anti-CD25 (BD Biosciences Pharmingen)를 각각 최종농도 1:500으로 염색하였고 유세포분석기 (Flowcytometer,FACS Vantage,Beckon Dickinson,U.S.A)를 이용하여 분석 함으로써 CD4+_{T 세포 분리 효율 및 CD4}+_CD25+_{regulatory T cell의 빈도를}

F.유세포 분석

정제한 Tim-3-Ig 단백질의 리간드에 대한 결합능을 알아보고자 C57BL/6 마우스의 비장 세포에서 분리한 CD4+_{T 세포에 Tim-3-Ig 단백질의 결합 정도를}

유세포 분석기 (BD BiosciencesU.S.A.)를 사용하여 측정하였다.분리한 마우스 CD4+ _{T 세포를 Tim-3-Ig 융합 단백질,FITC conjugated anti-CD4 Ab 그리고}

PE conjugatedanti-CD25Ab와 각각 최종농도 1:500으로 4℃에서 30분간 염색하 였다.이를 2%의 BSA가 포함된 PBS로 두 번 세척한 다음 Biotin-conjugated anti-human IgG (BD Biosciences,Pharmingen)Ab와 Streptavidin-PerCP (BD Biosciences,Pharmingen)Ab를 차례로 반응시켜 Tim-3-Ig이 결합된 세포를 표지 하였고,이를 유세포 분석기로 분석하였다.

Tim-3-Ig발현 벡터가 이입된 3LL 세포주의 GFP 발현 또한 유세포 분석기 를 사용하여 분석하였다.

G.역전사 중합 효소 연쇄 반응 (ReversetranscriptasePCR;RT-PCR)

Tim-3-Ig을 발현하는 3LL 세포주에서 RNA STAT-60TM _{(Tel-Test,INC.,}

Texas,U.S.A.)을 이용하여 RNA를 분리하였고,분리된 RNA를 주형으로 oligo-dT (Invitrogen,CA,U.S.A.)와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 생산하 였다. 생산된 cDNA를 주형으로 하고 Tim-3에 대한 forward primer인 Tim-3F(NheI)과 사람의 면역 글로불린의 CH2와 CH3부분의 backwardprimer 인 HIgCR(BamHI)을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하여 Tim-3-Ig의 유전 자가 증폭됨을 확인하였다.

H.재조합 baculovirus생산과 곤충 세포 배양

pAcSG2-GP-Tim-3-Ig벡터와 baculoviralGoldDNA를 Spodopterafrugiperda9 (Sf9)세포 (BD Biosciences,Bedford,MA,U.S.A.)에 동시 이입한 후 배양액을 모 음으로써 Tim-3-Ig을 발현하는 재조합 baculovirus를 생산하였다.

Sf9세포를 60mm dish에 1.5×106_{개 넣은 후,1시간 동안 27℃,CO} 2가 없

는 배양기에서 정치시켰다. pAcSG2-GP-Tim-3-Ig 3 ㎍과 linearized lethal mutantbaculovirusDNA 0.5㎍ (BD Biosciences)을 FBS가 없는 TNM-FH 배 지 (BD Biosciences) 1 ㎖에 넣고, liposome reagent (DMRIE-C Reagent, GibcoBRL,Gaithersburg,MD,U.S.A.)8㎕가 들어있는 TNM-FH 배지 1㎖을 첨가하였다.이를 실온에서 15분간 정치한 다음,Sf9세포에 넣고,27℃에서 5 시간 배양한 후,FBS를 총량의 20%가 되도록 첨가하였다.배양 4일째 배양액 을 4℃에서 2,500rpm으로 10분간 원심 분리하여 세포 파편을 제거함으로써 재 조합 baculovirus를 얻었다.1차로 얻은 바이러스를 Sf9세포에 감염시켜 바이 러스를 증폭시켰고,2차로 생성된 바이러스를 Sf9세포에 감염시켜 3차 바이 러스를 생산하였고,이를 다시 Sf9세포에 감염시켜 4차로 생산된 바이러스를 대량 생산하여 사용하였다.

Viability가 90% 이상인 Sf9세포를 100mm dish에 6.2x 106_{개 넣은 후,}

1시간 동안 27℃,CO2가 없는 배양기에서 정치시켰다.FBS가 포함되지 않은 배

지 4㎖로 교체한 후,4차 바이러스를 M.O.I.가 10이 되도록 400㎕ 넣어주 고 27℃,CO2가 없는 배양기에서 1시간 정치시켰다.6㎖의 FBS가 포함되지 않

I.마우스에서 종양 성장 측정

C57BL/6마우스 (6주령 수컷)에 3LL 세포주와 Tim-3-Ig발현 3LL 세포주 를 주사하여 종양 성장 속도를 측정하였다.마우스는 그룹 당 3마리 혹은 5마 리로 하였고,모든 세포의 viability가 95% 이상 되도록 하여 만든 세포 부유액 (3x 106_{cells/㎖)100㎕를 마우스 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.삼일 후}

부터 종양의 크기를 2일 간격으로 DisimaticCaliber(Mitutoyo,Japan)를 이용 하여 3주간 측정하였다.종양의 부피는 종양의 긴 길이(L)와 너비(w)를 측정하 여 다음과 같은 공식에 대입하여 계산하였다.부피 =0.523Lw2_. 한편, 3LL 세포를 주사한 마우스에 CHO 세포에서 생산 정제한 Tim-3-Ig 융합 단백질을 주사한 후 종양 성장 속도를 측정하는 실험을 다음과 같이 수행 하였다.3LL 세포는 위와 같은 방법으로 주사한 뒤 Tim-3-Ig 융합 단백질은 총 세 차례 주사하였는데,3LL 세포를 주사한 직후에 150㎍을 정맥 주사 하였고, 3LL 세포를 주사한 지 2 일째와 4 일째에도 150 ㎍씩 주사하였다.대조군으로 동량의 PBS와 사람 IgG를 동일한 방법으로 주사하였고,3주간 종양의 크기를 비교하였다.

Ⅲ

Ⅲ

Ⅲ.

.

.결

결

결 과

과

과

A.Tim-3아미노산 서열 분석

본 실험에서는 Balb/c마우스에서 Tim-3유전자를 클로닝 하여 사용하였다. Balb/c마우스 Tim-3의 아미노산 서열을 이미 보고된 마우스 AKR과 DBA/2의 Tim-3의 아미노산 서열과 비교하였다.Balb/cTim-3는 DBA/2의 Tim-3와 220 번째 아미노산 하나만이 다른 결과를 보였으며,AKR의 Tim-3와는 8개의 아미 노산이 차이를 보였다 (Fig.1). F FFiiiggg...111...DDDeeeddduuuccceeeddd aamammiiinnnooo aaaccciiiddd ssseeeqqquuueeenncncceeesss ooofffmmmuuurrriiinnneee TTTiiimm-m--333 ppprrrooottteeieiinnnsss fffrrrooommm t tthhhrrreeeeee dddiiiffffffeeerrreeennnttmtmmooouuussseee ssstttrrraaaiiinnnsss oooffBfBBlllaaabbb///ccc,,,AAAKKKRRR (((AAAFFF445455000222444111)))aaannnddd DDDBBBAAA///222 (

B.Tim-3-Ig발현 벡터 생산

Tim-3-Ig을 발현하는 종양세포주 확립과 Tim-3-Ig 생산․정제에 이용하고 자 Tim-3-Ig 발현 벡터를 제작하였다.pIRES2-EGFP 벡터에 PCR로 증폭한 Tim-3유전자의 extracellulardomain과 사람 IgG1의 constantregion의 CH2와

CH3유전자를 NheI과 BglII,BglII와 EcoRIsite에 각각 삽입하였다.Tim-3-Ig 유전자가 삽입된 것을 NheI과 EcoRI으로 잘라 agarosegel에 전기영동 하였다. 그 결과 1.2 kb의 band를 관찰함으로써 클로닝이 되었음을 확인하였다 (Fig. 2-A).IgG1유전자의 염기 서열 또한 확인하였다 (datanotshown).

Tim-3-Ig을 이용한 기존의 연구는 진핵세포에서 Tim-3-Ig을 발현․정제하 였으며,다른 방법의 단백질 발현 정제 시스템을 이용하지 않았다. 그리고 baculovirus발현 벡터 시스템에 의해 발현 정제된 Tim-3-Ig도 같은 효과를 나 타내는지는 밝혀진 바가 없었다.

Baculovirus발현 벡터와 곤충세포를 이용한 단백질 생산은 진핵세포계를 이 용함으로써 발현된 단백질이 원래의 단백질과 거의 비슷한 특성을 지니고 있으 며,또한 같은 진핵세포인 동물세포를 이용한 다른 발현벡터계에 비해 생산성이 우수하고 경제적이므로 Tim-3-Ig를 발현하는 baculoviral벡터를 제작하였다.

먼저 pAcSG2-GP67B에 PCR로 증폭된 Tim-3-Ig 유전자를 BamHI과 BglII site에 넣었고,삽입된 유전자를 확인하고자 재조합된 plasmid를 EagI와 BglII로 잘라 전기영동 하였다.그림 2-B에서 670bp의 band를 관찰함으로써 클로닝이 되 었음을 확인하였다.삽입된 유전자의 염기 서열도 확인하였다 (datanotshown).

A.

B.

F

FFiiiggg...222..C.CCooonnnssstttrrruucucctttiiiooonnn oofoffvvveeeccctttooorrrsssfffooorrrTTTiiimmm---333---IIIgg egeexxxppprrreeessssssiiiooonnn...A.Mammalian expression vectorforTim-3-Ig.Tim-3 DNA fragmentencoding forsignal peptide and extracellular domain was amplified by PCR and inserted into NheIandBglIIsitesofpIRES2-EGFP.PCR-amplifiedsegmentforhumanIg constantregion 2and 3wasligated tothe3'ofTim-3DNA sequencesin pIRES2-EGFP usingBglIIand EcoRIsites.The recombinantplasmid was digested withNheIand EcoRIand analyzed by agarosegelelectrophoresis. B.Baculoviralexpression vectorforTim-3-Ig.DNA fragmentforTim-3-Ig was incorporated into BamHI and BglII sites of pAcSG2-GP67B. The recombinant plasmid was digested with EagIand BglIIand analyzed by agarosegelelectrophoresis.

C.포유동물 세포에서 Tim-3-Ig의 생산․정제 및 리간드 결합능 분석

pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig의 이입에 의해 CHO 세포에서 Tim-3-Ig이 생산되 는가 알아보고자 하였다. pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig이 이입된 CHO 세포는 Tim-3-Ig융합 단백질을 분비하며 IRES sequence에 의해 Tim-3-Ig와 별도로 녹 색 형광 단백질을 생산한다.따라서 이입된 세포는 형광 현미경 하에서 녹색 형광 을 나타낸다 (Fig.3-A).이입된 세포의 배양액으로 western blotting을 시행하였 다 (Fig.3-B).Tim-3-Ig은 당화되지 않으면 약 45kD의 band로 관찰될 것으로 예측되었으나 이보다 큰 크기의 band가 관찰되었으므로 당화된 것으로 생각되었 다.Protein A sepharose를 이용하여 정제한 Tim-3-Ig은 SDS-PAGE에서 50kD 보다 크고 70kD보다 작은 band로 관찰되었으며 약 50kD 크기의 band와 25kD 보다 조금 큰 band가 적은 양으로 관찰되었다 (Fig.4-A).Anti-human Ig Ab를 이용한 Western blot분석 결과 50kD보다 크고 70kD보다 작은 band와 약 25 kD의 band가 관찰되므로 50kD보다 크고 70kD보다 작은 band는 Tim-3-Ig이며 약 25kD의 band는 Tim-3-Ig의 분해 산물일 것으로 생각되었다 (Fig.4-B).이렇 게 정제한 Tim-3-Ig의 ligand결합능을 분석하였다 (Fig.5).

Tim-3ligand가 발현되는 세포로 CD4+_CD25+_{regulatoryT cell(Treg)이 알}

려져 있으므로 (Sanchez-Fueyo 등,2003),마우스 CD4+_{T 세포를 분리하여 정제}

된 Tim-3-Ig과 반응시킨 후 human Ig에 대한 형광항체로 표지하여 유세포 분 석기로 분석하였다.CD4와 CD25에 대한 형광 항체를 이용하여 표지한 Treg 세 포를 gating한 후 Tim-3-Ig의 결합여부를 분석한 결과 사용한 농도의 Tim-3-Ig 이 약 41%의 Treg 세포와 결합하는 것을 관찰하였으므로 Tim-3-Ig의 ligand 결합능을 확인할 수 있었다.

A.untransfected transfected B. F FFiiiggg... 333... TTTiiimmm---333---IIIggg eeexxxppprrreeesssssseeeddd iiinnn CCCHHHOOO ccceeellllllsss tttrrraaannnsssfffeeecccttteeeddd wwwiiittthhh p

ppIIIRRREEESSS22-2--EEEGGGFFFPPP--T-TTiiimmm---33-3--IIIggg... (A) CHO cells were transfected with pIRES2-EGFP-Tim-3-Igand 2days later observedunderthefluorescence microscope(x200).(lowerpanel)Upperpanel:untransfectedCHO cellsLeft panel:CHO cellsunderthephasecontrastmicroscope.(B)Culturesupernatant was harvested and analyzed by western blotting with HRP conjugated anti-humanIgG antibodyforTim-3-Ig detection.

A . B.

F

FFiiiggg...444...PPPuuurrriiifffiiiccacaatttiiiooonnn oooffTfTTiiimmm---333---IIgIgg fffooorrrmmm ttthhehee tttrrraaannnsssfffeeecccttteeeddd CCCHHHOOO ccceeellllllsss...CHO cells were transfected with pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig were cultured for 48 hours.Culture supernatantwas loaded on protein A sepharose column and boudTim-3-Igwaseluated.

F

FFiiiggg... 555... TTThhheee bbbiiinnnddidiinnnggg aaaccctttiiivvviiitttyyy oooff TfTTiiimmm---333---IIIggg ppprrroooddduuuccceeeddd bbbyyy CCCHHHOO cO cceeellllllsss... Reactivity ofTim-3-Ig in CHO cellswith Tim-3L on CD4+ _CD25+_{T cells.}

MouseCD4T cellswerepurifiedandlabeledwithFITC conjugatedanti-CD4 Ab, PE-conjugated anti-CD25 Ab and purified Tim-3-Ig. Then Biotin-conjugated anti-human IgG Ab and Streptavidin-PerCP were used to stainTim-3-Ig.

41% Tim Tim Tim Tim----333-3---IgIgIgIg CD4 CD4 CD4 CD4 C D 2 5 C D 2 5 C D 2 5 C D 2 5 Gate: R2 and R3 Gate: R2 and R3Gate: R2 and R3 Gate: R2 and R3 open: unstained open: unstained open: unstained open: unstained filled: Tim filled: Timfilled: Tim

filled: Tim---3-333--Ig--IgIgIg----stainedstainedstainedstained

41% Tim Tim Tim Tim----333-3---IgIgIgIg CD4 CD4 CD4 CD4 C D 2 5 C D 2 5 C D 2 5 C D 2 5 Gate: R2 and R3 Gate: R2 and R3Gate: R2 and R3 Gate: R2 and R3 open: unstained open: unstained open: unstained open: unstained filled: Tim filled: Timfilled: Tim

D.Tim-3-Ig을 발현하는 3LL세포주 확립

Tim-3-Ig의 발현이 종양의 성장에 미치는 영향을 알기 위해서 3LL 세포에 Tim-3-Ig의 발현 벡터인 pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig과 벡터 대조군 pIRES2-EGFP를 각각 이입하여 Tim-3-Ig과 GFP를 안정적으로 발현하는 세포주 T1과 T2,GFP를 단독으로 발현하는 대조군 세포주 G1,G2를 확립하였다.확립된 세포주의 GFP 발 현을 유세포분석기로 분석하였다 (Fig.6-A).확립된 세포주 G1,G2의 형광 강도 가 T1,T2에 비해 강한 것을 알 수 있다.T1과 T2에서 Tim-3-Ig의 발현을 확인 하기 위해 RT-PCR을 시행하였다 (Fig.6-B).합성된 cDNA의 상태는 β-actin의 발현을 통하여 확인하였고,합성된 cDNA를 주형으로 하여 Tim-3-Ig의 5′쪽의 primer인 Tim-3F(NheI)와 사람 면역글로불린의 3′쪽의 primer인 HIgCR(BamHI) 을 사용하여 PCR을 수행하였다.그 결과,T1과 T2세포주에서 Tim-3-Ig의 유전 자 크기인 1.2Kb의 band가 증폭되었으며 G1,G2와 3LL 세포주에서는 이 band가 증폭되지 않는 것이 관찰되었다.따라서 T1,T2세포주가 Tim-3-Ig을 발현함을 확인할 수 있었다.

A.

B.

F

FFiiiggg... 666... EEsEsstttaaabbbllliiishsshhmmmeeennnttt oooff sf sstttaaabbbllleee ccceeellllll llliiinnneeesss eeexxxppprrreeesssssisiinnnggg TTTiiim-mm--333---IIIggg... pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig orpIRES2-EGFP wastransfected into3LL using Lipofectamin 2000.Transfected cells were selected with antibiotics,G418 and by FACS sorting.(A)GFP expression in stable celllines were examined by flow cytometry. T1 and T2 were established by transfection with pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig. G1 and G2 were established by transfection with pIRES2-EGFP.(B)To examineexpression ofTim-3-Ig,RT-PCR wasperformed using RNA isolated from each cellline.Upperpannel:RT-PCR using Tim-3-Ig specific primers Lowerpannel:RT-PCR using actin priemrs Lane Vector;PCR productfrom pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig.

E.3LL 세포의 Tim-3-Ig발현이 종양 성장에 미치는 영향 종양 세포에서 Tim-3-Ig의 발현이 종양 성장에 미치는 영향을 알아보고자 C57BL/6마우스에 3LL 세포와 안정적으로 Tim-3-Ig을 발현하도록 한 T1,T2세 포,그리고 대조군 G1,G2세포 각각을 피하 주사하였다.주사한 후 2일째부터 3주간 종양의 크기를 측정하였다 (Fig7,8). 3LL 세포를 주사한 그룹에서는,주사한 지 6일째부터 세 마리의 마우스에 서 종양이 생성되기 시작하여 12일이 되자 네 마리 모두에서 종양이 생성되었 다.마우스는 종양세포 주사 후 16일째 이후부터 종양 성장 속도가 증가하였다. G1세포를 주사한 그룹에서는,주사한 지 6일째부터 두 마리의 마우스에서 종양이 생성되기 시작하더니 10일 후에는 다섯 마리 모두에서 종양이 생성되었 다.그러나 처음 종양이 관찰되었을 때 종양의 크기는 3LL 세포 주사로 생긴 종 양 크기의 1/2정도 이었다.또한 G1종양 성장 속도가 3LL에 비해 느려 21일 후 종양 크기는 3LL의 1/3정도 이었다.G2세포를 주사한 그룹에서는 주사 후 8일째부터 세 마리의 마우스에서 종양이 생성되기 시작하여,10일 후에는 다섯 마리 모두에서 종양이 생성되었고,종양의 성장 속도는 G1세포와 비슷하였다. 반면에 Tim-3-Ig을 발현하는 T1과 T2 세포를 주사한 마우스에서는 3 주 동안 종양이 생성되지 않았다.이는 마우스에서 3LL 세포의 종양 성장이 이종 단백질 GFP의 발현으로도 의미 있게 억제되지만 3LL 세포의 Tim-3-Ig의 발현 으로 더욱 억제됨을 보여준다.

F

FFiiiggg... 777... TTThhheee tttuuummmooorrr gggrrrooowwwttthhh iiinnn mmmiiiccceee iiinnnooocccuuulllaaattteeeddd wwwiiittthh 3h 33LLLLLL ccceeellllll llliiinnneeesss e

eexxxppprrreeessssssiiinnnggg TTTiiimmm---333---IIIggg...C57BL/6micewereinjectedwith3×105_{cells100㎕ to}

therightflank.From Day 2 tumorgrowth wasobserved by measuring the length(L)andwidth(w)oftumormass.Tumorvolumewascalculatedusing thefollowing formula;volume=0.523Lw2_{.Thedatarepresentedaremean±}

F

FFiiiggg..8.88...TTThhheepepphhhoootttooogggrrraaappphhh oofoffmmmiiicecceewwwiiittthhh tttuuummmooorrrsss...Micewerephotographedon 24thdayaftertumorinjection.*Photographtakenon22ndday.

F.곤충 세포에서 Tim-3-Ig의 생산과 정제 및 이의 리간드 결합능 분석

곤충세포인 Sf9세포를 재조합 baculovirus로 감염시켜 생산한 Tim-3-Ig을 protein A column을 이용하여 분리하여 정제한 후 SDS-PAGE와 Western blotting으로 분석하였다 (Fig.9).SDS-PAGE상 50kD과 75kD 사이의 band가 관찰되었고 Westernblot에서 anti-humanIg Ab와 반응성을 보이므로 Tim-3-Ig 으로 판단되었다.또한 당화되지 않은 Tim-3-Ig의 분자량 (45kD)에 비해 높은 분자량으로 관찰되므로 CHO 세포에서 분리된 Tim-3-Ig과 마찬가지로 당화되어 있을 것으로 생각되었다.그러나 CHO 세포에서 정제한 Tim-3-Ig에 비해 Sf9세 포에서 정제한 Tim-3-Ig의 크기가 작으므로 Sf9세포에서 일어나는 당화가 CHO 세포에서 일어나는 당화와 차이가 있을 것으로 예상되었다. Sf9세포에서 생산 정제한 Tim-3-Ig의 ligand결합능을 알아보고자 정제한 Tim-3-Ig을 Treg세포와 반응시킨 후 유세포 분석기로 분석하였다 (Fig.10).Sf 9 세포에서 생산 정제한 Tim-3-Ig이 CHO 세포에서 생산된 Tim-3-Ig에 비해 Treg 세포에서 발현되는 ligand에 결합하는 능력이 현저히 떨어지는 것을 관찰 하였다 (Fig.10).따라서 Sf9세포를 이용한 Tim-3-Ig생산이 보다 경제적이고 효율적이었지만, 기능적인 면에서 문제가 있으므로, 종양 성장에 미치는 Tim-3-Ig 투여 효과 분석을 위해 CHO 세포를 이용하여 Tim-3-Ig을 대량생산 하고 정제하였다 (datanotshown).

A . B.

F

FFiiiggg...999...TTThheheeeeexxxppprrreeesssssisiiooonnnaaannndddppupuurrriiifffiiicccaaatttiiiooonnnooofffTTTiimimm---333---IIIgggppprroroottteeeiiinnnppprrroooddduuuccceeedddiiinnn S

SSfff999ccceeellllllsss...Tim-3-Igwasexpressedandpurifiedfrom Sf9cellsinfectedwith recombinantbaculovirus.Purified Tim-3-Ig was analysed by SDS-PAGE (A) andWesternblotting(B).

F

FFiiiggg...111000..T.TThhheee bbbiiinnndddiiinnnggg aaacccttitiivvviiitttyyy ooofff TTTiiimmm---333---IIIggg ppprrroooddduuucceceeddd iiinnn SSSfff999 ccceeellllllsss... Reactivity ofTim-3-Ig expressedinSf9cellswith Tim-3L on CD4+_CD25+

G.Tim-3-Ig의 투여가 종양의 성장에 미치는 영향 Tim-3-Ig 발현 종양 세포의 종양 성장 둔화가 Tim-3-Ig의 효과인지 알아 보고자 3LL 종양 모델에 Tim-3-Ig단백질을 투여한 후 종양 성장을 관찰하였다 (Fig.11).3LL 세포를 주사한 마우스에 종양 주사 직후와 2 일째 4 일째 Tim-3-Ig단백질을 정맥주사 하였다. PBS 혹은 human IgG를 주사한 대조군 마우스 그룹에서는 종양 세포를 주 사한 후 3일째 두 마리의 마우스에서 종양이 생성되기 시작하였고,5일째 세 마리 모두에서 종양이 생성되었다.반면 Tim-3-Ig을 주사한 세 마리의 마우스에 서는 7일 째 종양이 생성되었다.또한,PBS 또는 humanIgG를 주사한 대조군 마우스의 종양 성장 속도가 Tim-3-Ig을 주사한 마우스의 종양 성장 속도보다 빠른 경향을 보였다.마우스의 종양의 크기는 대조군에 비해서 50.5% 크기였다. 이로보아 Tim-3-Ig을 주사하였을 때 종양의 부피 증가가 둔화되는 것을 관찰할 수 있었다.이러한 결과는 Tim-3-Ig이 종양 성장을 억제할 수 있음을 보여준다.

F

FFiiiggg...111111..E.EEffffffeeeccctttooofffTTTiiimmm---333---IIIggg aaadddmmmiiinnniiissstttrrraaatttiiioononn ooonnn tttuuummmooorrrgggrrrooowwwttthhhiniinn vvviiivvvooo... C57BL/6 mice were injected with 3×105_{3LL cells ofintravenously injected}

intomice.Threedosesof150㎍ Tim-3-Ig wereinjected intothetailveins ofmiceon days0,2and 4after3LL injection.Ascontrol,sameamountof humanIgorPBS wasadministered.Thedatarepresentedaremeanoftumor volumeof3miceineachgroup.

Ⅳ

Ⅳ

Ⅳ.

.

.고

고

고 찰

찰

찰

본 연구에서는 종양의 성장에 미치는 Tim-3-Ig의 영향에 대해 알아보고자 하였다.3LL 종양 성장이 Tim-3-Ig 발현에 의해 저해되는 것이 관찰되었으며 정제한 Tim-3-Ig을 주사한 마우스에서는 종양 성장이 둔화되는 것이 관찰되었 다.따라서 Tim-3-Ig에 의해 종양 성장이 억제되는 것으로 생각된다. Tim-3-Ig을 발현하는 3LL 세포주 (T1,T2)의 성장이 모세포 3LL과 대조군 GFP 발현 3LL 세포주 (G1,G2)에 비해 억제된 것은 다음 두 가지에 의해 설명 될 수 있다.첫째,종양 세포에서 분비된 Tim-3-Ig이 면역 반응을 조절하였기 때문이다.둘째,종양 세포내 발현된 Tim-3-Ig의 사람 면역글로불린이 종양항원 으로 작용하였기 때문이다.대조군으로 사용된 G1과 G2세포가 모세포 3LL보다 종양 성장이 둔화된 것은 이종단백질 GFP가 강력한 종양 항원으로 작용한 것으 로 해석된다.GFP는 세포질 내에서 발현되는 단백질이며 종양세포 증식에 영향 을 미치지 않기 때문이다 (datanotshown).한편 T1과 T2는 G1과 G2보다 종양 성장이 억제되었다.T1과 T2의 GFP 발현 양이 G1과 G2보다 낮았으므로 이는 GFP 발현량에 의한 차이로 설명되지 않는다.비록 사람의 Ig constantregion과 마우스의 Igconstantregion의 유사성이 높지만,동일하지 않으므로 Tim-3-Ig의 Ig부분이 종양 항원으로 작용할 가능성이 배제되지 않는다.즉 T1과 T2는 GFP 와 사람 면역 글로불린을 발현하고 G1과 G2는 GFP만을 발현하므로 T1과 T2의 종양형성능이 G1과 G2에 비해 저하될 수 있다.이 영향을 배제하려면 사람 면역 글로불린과 GFP를 발현하는 세포주를 대조군으로 하여 T1과 T2의 종양 성장 속도를 비교하여야 할 것이다.본 연구에서는 Tim-3-Ig의 작용에 의하여 T1과 T2의 종양 성장이 억제된 것을 뒷받침하기 위해 정제한 Tim-3-Ig을 세 차례 주 사한 마우스에서 3LL의 종양 성장을 측정하였다.PBS 혹은 hIg을 세 차례 주사 한 대조군에 비해 Tim-3-Ig을 주사한 마우스에서 3LL의 종양 성장 속도가 감소 되는 경향을 관찰하였다.이를 종합하여 볼 때,Tim-3-Ig은 종양 성장을 억제 하는 것으로 생각된다.

본 연구 결과는 악성 흑색종 모델에서 Tim-3의 splicing variant(sTim-3) 가 종양에 미치는 영향을 분석한 최근 보고와 차이를 보인다.sTim-3는 활성림 프구에서 생산되어 분비되는 분자로서 Tim-3의 Ig V like domain을 포함하는 세포외 부분 일부와 일부 cytoplasmic domain으로 이루어져 있으며 Tim-3L와 결합한다.sTim-3발현 벡터를 마우스에 4회 정맥 주사함으로써 sTim-3가 발현 되도록 확립한 시스템에서 악성 흑색종의 성장 촉진이 관찰되었다 (Geng 등, 2006).sTim-3와 Tim-3-Ig은 모두 Tim-3L에 결합하며,Tim-3―Tim-3L의 결 합을 방해할 것으로 생각되고 있다.그렇다면 sTim-3와 Tim-3-Ig은 유사한 결 과를 보여야 할 것으로 예측되는데,sTim-3는 종양 성장을 촉진시킨 반면 Tim-3-Ig은 종양 성장을 억제하는 쪽으로 작용하였다. 또한, 본 연구에서 Tim-3-Ig은 종양 세포주를 주사한 시점부터 투여되기 시작하였으나 sTim-3발 현 벡터는 종양 세포 주사 후 이틀째부터 투여된 점에서 두 연구 간에 차이점이 발견된다.Tim-3-Ig은 세포막의 FcR에 결합할 수 있으나 sTim-3는 그렇지 않 다.Tim-3-Ig과 sTim-3에 의 한 면역 조절 현상의 차이를 이해하는 것은 Tim-3―Tim-3L에 의한 면역 반응 이해에 필요하므로 추후 연구되어야 할 문제 이다. Tim-3-Ig에 의한 종양 성장 억제 기전으로 다음과 같은 것을 생각해 볼 수 있다.(1)Th1과 Tc1의 세포사 억제를 통한 종양 특이 세포매개 면역 증진,(2) Tim-3―Tim-3L 경로 차단에 의한 Treg의 억제 작용 효과 감소,(3)단구/대식 세포의 증식과 활성을 통한 종양면역 증진 등이다.이러한 가능성은 Tim-3-Ig혹 은 Tim-3에 대한 항체를 이용한 연구보고에 바탕 한다.Tim-3-Ig 투여로 Th1 세포의 증식이 증가하였고,이는 Tim-3L에 의한 Th1의 세포사를 Tim-3-Ig이 억 제할 수 있기 때문으로 설명될 수 있다.활성 Th1과 Tc1모두 Tim-3를 발현하 므로 Tim-3-Ig은 Tim-3L에 의한 Th1과 Tc1의 세포사를 억제하고 Th1면역 반 응의 증가로 종양 특이 Tc면역 반응을 증진시킬 가능성이 있다.또한,Tim-3-Ig 투여로 Treg 기능 억제가 보고되었으며,종양에서 Treg 빈도와 활성이 증가한다 고 알려져 있으므로 Tim-3-Ig이 Treg에 의한 면역 억제를 차단함으로써 종양 성

장을 억제할 수 있다.Tim-3에 대한 항체 투여로 CD11b+_{단구 수와 기능이 항진}

됨이 보고되었으므로 Tim-3-Ig의 투여로 단구의 수와 활성의 증가가 일어나 종 양 면역 증진을 유도할 가능성이 있다.

본 연구에서는 baculovirus를 이용하여 Tim-3-Ig을 생산하고 이의 ligand결 합력을 분석함으로써 Tim-3가 ligand에 결합할 때 Tim-3의 glycosylation이 매우 중요한 역할을 하는 것을 밝혔다.CHO 세포에서 생산된 Tim-3-Ig과 마찬가지로 baculovirus에 감염된 곤충세포에서 생산한 Tim-3-Ig도 glycosylation이 되었으 나 ligand에 잘 결합하지 않았다.이는 곤충세포에서 일어나는 glycosylation이 CHO 세포에서 일어나는 것과 차이가 있음을 시사한다.또한 이는 효소를 이용 하여 Tim-3의 glycosylation을 제거하거나 혹은 lactose가 있는 조건에서는 Tim-3가 Tim-3L와 결합하지 않는다는 보고와 상응한다.따라서 baculovirus를 이용한 발현 시스템의 장점에도 불구하고 이 시스템은 Tim-3-Ig 생산에는 적합 하지 않음을 알 수 있었으며, 포유동물 세포에서 일어나는 glycosylation이 Tim-3의 ligand결합에 필요함을 알게 되었다.

요약하면,본 연구에서 Tim-3-Ig의 종양 억제 효과가 밝혀졌으며,부수적으 로 Tim-3 당화가 Tim-3―Tim-3L 결합에 중요함이 밝혀졌다.본 연구 결과는 Tim-3경로 조절을 통한 종양 면역 증진 가능성을 보여주며 Tim-3경로 조절 을 위한 Tim-3-Ig생산 방법 선택에 도움을 주리라 생각한다.

Ⅴ

Ⅴ

Ⅴ.

.

.결

결

결 론

론

론

본 연구에서는 Tim-3-Ig이 종양의 성장에 미치는 영향을 연구하고자,포유 동물 세포인 CHO 세포에서 Tim-3-Ig 단백질을 발현시키고 이를 분리․정제하 는 방법을 확립하고,아울러 마우스에 종양을 발병시키는 실험계도 확립하였다. Tim-3-Ig를 종양 세포인 3LL 세포에서 발현하게 하여 이 세포를 피하 주사한 마우스에서 종양의 성장을 관찰하였다.그 결과,대조군 세포와 달리 Tim-3-Ig 가 발현되는 종양 세포를 주사한 마우스에서 종양이 성장하지 않음을 관찰하였 다.이러한 결과가 3LL에서 발현하고 있는 Tim-3-Ig의 영향인지 확인하기 위하 여 3LL 세포를 피하 주사한 마우스에 정제한 Tim-3-Ig을 정맥 주사하고 종양의 성장을 관찰한 결과 Tim-3-Ig을 주사한 마우스에서 종양 성장이 PBS와 사람의 면역 글로불린을 주사한 대조군에 비해 둔화되어 3LL 주사 3주 후 종양의 크기 를 비교할 때 Tim-3-Ig을 주사한 마우스의 종양 크기가 대조군 마우스의 종양 크기의 50% 정도임이 관찰되었다.따라서 Tim-3-Ig은 종양의 성장을 저해하는 기능이 있음을 알 수 있었다.

참

참

참고

고

고문

문

문헌

헌

헌

1.Anderson AC and Anderson DE :TIM-3 in autoimmunity.Curr.Opi. Immunol.18:1-5,2006

2.AntonyPA andRestifoNP :CD4+_CD25+_{T regulatorycells,immunotherapy}

ofcancer,andInterleukin-2.J.Immunother.28;120-128,2005

3.Baecher-Allan C, Viglietta V and Hafler DA : Human CD4+ _CD25+

regulatoryT cells.SeminarsinImmunol.16;89-97,2004

4.BerendtMJ and North RJ :T-cell-mediated suppression ofanti-tumor immunity.J.Exp.Med.151:69-80,1980

5.Bloom MB,Perry-LalleyD,RobbinsPF,LiY,El-GamilM,RosenbergSA and Yang JC :Identification ifTyrosinase-related Protein 2 as a tumor rejectionantigenfortheB16melanoma.J.Exp.Med.185;453-459,1997 6.Chen ML,PittetMJ,Gorelik L,FlavellRA,WeisslederR,BoehmerHV

and Khazaie K :Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicitythroughTGF-β signalsinvivo.PNAS.102;419-424,2005

7.Choileain NN,M.D.,andRedmondHP,M.Ch.,FRCSI:Regulatory T-cells andautoimmunity.JournalofSurgicalResearch,130;124-135.2006

8.Curiel TJ, Coukos G, Zou L, Alvarez X, Cheng P, Mottram P, Evdemon-Hogan M,Conejo-GarciaJR,Zhang L,Burow M,Zhu Y,WeiS,

Kryczek I,DanielB,Gordon A,Myers L,LacknerA,Disis ML,Knutson KL,Chen L and Zou W :Specific recruitmentofregulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat.Med.10;942-949,2004

9.Finn OJ :Cancervaccines:between the idea and the reality.Nat.Rev. Immunol.3;630-641,2003

10.FranckenAB,BastiannetE andHoekstraHJ:Follow-upinpatientswith localisedprimarycutaneousmelanoma.LancetOncology.6;608-621,2005 11.Frisancho-Kiss S,Nyland JF,Davis SE,Barrett MA,Gatewood SJL,

Njoku DB,Cihakova D,Silbergold EK,RoseNR and FairweatherD :T cellIg mucin-3reducesinflammatory heartdiseaseby increasing CTLA-4 duringinnateimmunity.J.Immunol.176:6411-6415,2006

12.Geng H,Zhang GM,LiD,Zhang H,Yuan Y,Zhu HG,XiaoH,Han LF andFengZH :Solubleform ofT cellIgMucin3isaninhibitorymolecule inT cell-mediatedimmuneresponse.J.Immunol.176;1411-1420,2006 13.GhiringhelliF,MenardC,TermeM,FlamentC,TaiebJ,ChaputN,Puig

PE,Novault S,Escudier B,Vivier E,Lecesne A,Robert C,Blay JY, Bernard J, Caillat-Zucman S, Freitas A,Tursz T, Wagner-Ballon O, Capron C,Vainchencker W,Martin F and Zitvogel L : CD4+ _CD25+

regulatory T cells inhibitnaturalkiller cellfunctions in a transforming growthfactor-β-dependentmanner.J.Exp.Med.202;1075-1085,2005

14.Gielen AW,LobellA,Lidman O,KhademiM,Olsson T and PiehlF : Expression of T cell immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecules-1 and -3(TIM-1 and -3) in the rat nervous and immune systems.J.Neuroimmunology.??;???-???,2005

15.GoldszmidRS,IdoyagaJ,BravoAI,SteinmanR,MordohJandWainstok R :Dendritic cells charged with apoptotic tumorcells induce long-lived protective CD4+ _{and CD8}+ _{T cellimmunity against B16 melanoma.J.}

Immunol.171;5940-5947,2003

16.Hiura T,Kagamu H,Miura S,Ishida A,Tanaka H,Tanaka J,Gejyo F andYoshizawaH :Bothregulatory T cellsandantitumoreffectorT cells areprimedinthesamedraining lymphnodesduring tumorprogression.J. Immunol.175;5058-5066,2005

17.Hoves S,Krause SW,Scholmerich J and Fleck M :The JAM-assay: optimized conditions to determine death-receptor-mediated apoptosis. Methods.31;127-134,2003

18.Huang CT,Workman CJ,FliesD,Pan X,Marson AL,Zhou G,Hipkiss EL,RaviS,KowalskiJ,Levitsky HI,PowellJD,PardollDM,DrakeCG and Vignali DAA : Role of LAG-3 in regulatory T cells.Immunity. 21;503-513,2004

19.Ikonomou L,Schneider J and Agathos SN : Insect cell culture for industrialproduction ofrecombinantproteins.ApplMicrobiol.Biotechnol. 62:1-20,2003

20.JonesE,Dahm-VickerM,GolgherD andGallimoreA :CD25+_regulatory

T cellsandtumorimmunity.Immunologyletters.85;141-143,2003

21.KhademiM,IllesZ,GielenAW,MartaM,TakazawaN,Baecher-AllenC, Brundin L,Hannerz J,Martin C,Harris RA,HaflerDA,Kuchroo VK, Olsson T, Piehl F and Wallstrom E : T cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-3 (TIM-3) and TIM-1 molecules are differentially expressedon human Th1andTh2cellsandincerebrospinal fluid-derived mononuclear cells in multiple sclerosis. J. Immunol. 172:7169-7176,2004

22.King IL and SegalBM :Cutting Edge:IL-12inducesCD4+_{CD25- T cell}

activationinthepresenceofT regulatorycells.J.Immunol.175:641-645,2005 23.KostTA,CondreayJP andJarvisDL :Baculovirusasversatilevectorsfor

protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23(5):567-575,2005

24.KronenbergM andRudenskyA :Regulationofimmunitybyself-reactive T cells.Nature.435;598-604,2005

25.Kuchroo VK,Umetsu DT,DeKruyffRH and Freeman GJ :The TIM genefamily:emerging rolesin immunity and disease.Nat.Rev.Immunol. 3;454-462,2003

elusive targets of T-cell-based active immunotherapy. TRENDS in Immunology,24:334-341,2003

27.MeyersJH,SabatosCA,ChakravartiS andKuchrooVK :TheTIM gene family regulates autoimmune and allergic diseases. TRENDS in Immunology,11(8):362-369,2005

28.Monney L,Sabatos CA,Gaglia JL,Ryu A,Waldner H,Chernova T, Manning S,GreenfieldEA,CoyleAJ,SobelRA,FreemanGJandKuchroo VK :Th-1 specific cellsurface protein Tim-3 regulates machrophage activation and severity of an autoimmune disease.Nature,415:536-540, 2002

29.Needham DJ,LeeJX andBeilharzMW :Intra-tumoralregulatoryT cells: A potentialnew targetin cancerimmunotherapy.Biochem.and Biophys. ResearchCommu.343:684-691,2006

NishiboriT,Tanabe Y,Su L and David M :Impaired developmentof CD4+ _CD25+ _{regulatory T cells in the absence of STAT1: Increased}

susceptibilitytoautoimmunedisease.J.Exp.Med.5;25-34,2004

30.NishikawaH,KatoT,TawaraI,SaitoK,IkedaH,KuribayashiK,Allen PM,SchreiberRD,SakaguchiS,OldLJandShikuH :Definitionoftarget antigens fornaturally occurring CD4+ _CD25+ _{regulatory T cells.J.Exp.}

Med.10;681-686,2005

antigens recognized by T cells: March 2004 update.Cancer Immunol Immunother.54:187-207,2005

32.Nurieva RI,MaiXM,Forbuch K,Bevan MJ and Dong C :B7h is required forT cellactivation,differentiation,and effectorfunction.PNAS, 100;14163-14168,2003

33.OnizukaS,TawaraI,ShimizuJ,sakaguchiS,FujitaT andNakayamaE :Tumor rejection by in vivo administration ofanti-CD25 (Interleukin-2 receptorα)monoclonalantibody.Canc.Res.59;3128-3133,1999

34.PaulWE and Seder RA :Lymphocyte responses and cytokines.Cell 76(2);241-251,1994

35.PrabhalaRH,NeriP,BaeJE,TassoneP,ShammasMA,Allam CK,Daley JF, Chauhan D, Blanchard E, Thatte HS, Anderson KCMunshi NC : DysfunctionalT regulatory cells in multiple myeloma.Blood.107;301-304, 2006

36.SabatosCA,ChakravartiS,ChaE,SchubartA,Sanchez-FueyoA,Zheng XX,Coyle AJ,Strom TB,Freeman GJand Kuchroo VK :Interaction of Tim-3 and Tim-3 ligand regulates T helper type 1 responses and inductionofperipheraltolerance.Nat.Immunol.11;1102-1110,2003

37.SakaguchiS :Naturally arising Foxp3-expressing CD25+_CD4+_regulatory

T cells in immunologicaltolerance to selfand non-self.Nat.Immunol. 6;345-352,2005

38.Sanchez-Fueyo A,Tian J,Picarella D,Domenig C,Zheng XX,Sabatos CA,ManlongatN,BenderO,KamradtT,Kuchroo VK,Gutierrez-Ramos JC,Coyle AJand Storm TB :Tim-3 inhibits T helpertype 1-mediated auto- and alloimmune responses and promites immunological tolerance. Nat.Immunol.4;1093-1101,2003

39.Shevach EM :Fatalattraction:tumors beckon regulatory T cells.Nat. Med.9;900-901,2004

40.Simmons WJ,Koneru M,Mohindru M,Thomas R,Cutro S,Singh P, DeKruyffRH,InghiramiG,CoyleAJ,Kim BS and Ponzio NM :Tim-3+

T-bet+ _{tumor-specific Th1 cells colocalize with and inhibitdevelopment}

andgrowthofmurineneoplasms.J.Immunol.174;1405-1415,2005

41.Smyth MJ,Teng MWL,Swann J,Kyparissoudis K,Godfrey DI,and hayakawa Y :CD4+_CD25+ _{T regulatory cellssuppressNK cell-mediated}

immunotherapyofcancer.JofImmunol.176:1582-1587,2006

42.Steitz J,Bruck J,Lenz J,Knop J and Tuting T :Depletion ofCD25+

CD4+ _{T cellsand treatmentwith Tyrosinase-related Protein 2-transduced}

dendritic cells enhance the interferon α-induced,CD8+ _{T-cell-dependent}

immunedefenseofB16melanoma.CancerRes.61;8643-8646,2001

43.TurkMJ,Guevara-PatinoJA,RizzutoGA,EngelhornME,HoughtonAN : Concomitant tumor immunity to a poorly immunogenic melanoma is preventedbyregulatoryT cells.J.Exp.Med.200:771-782,2004

44.Viguier M,Lemaitre F,Verola O,Cho MS,Gorochov G,DubertretL, BachelezH,KourilskyP andFerradiniL :Foxp3expressingCD4+_CD25high

regulatory T cells are overrepresented in human metastatic melanoma lymph nodes and inhibitthe function ofinfiltrating T cells.J.Immunol. 173;1444-1453,2004

45.Wang B,Fujisawa H,Zhuang L,Freed I,HowellBG,Shahid S,Shivji GM,Mak TW and SauderDN :CD4+_{Th1and CD8}+_{type1cytotoxicT}

cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity.J.Immunol.165;6783-6790,2000

46.WangHY,LeeDA,PengD,GuoZ,LiY,KiniwaY,ShevachEM,Wang RF :Tumor-specifichuman CD4+ _{regulatory T cellsand theirligands:}

ImplicationsforImmunotherapy.Immunity20:107-118,2004

47.Wang RF : Immune suppression by tumor-specific CD4+ _regulatory

T-cellsincancer.SeminarsinCancerBiology,16;73-79,2006

48.WooEY,ChuCS,GoletzTJ,SchliengerK,YehH,CoukosG,RubinSC, KaiserLR andJuneCH :Regulatory CD4+_CD25+_{T cellsin tumorsfrom}

patientswithearly-stagenon-smallcelllungcancerandlate-stageovarian cancer.CancerRes.61;4766-4772,2001

49.Yakov C, Paul AK, and Amy EA : Melanoma genetics and the development of rationaltherapeutics.J Clin.Investigation 115:813-824, 2005

50.ZhuC,Anderson AC,SchubartA,Xiong H,ImitolaJ,Khoury SJ,Zheng XX,Strom TB andKuchrooVK :TheTim-3ligandgalectin-9negatively regulatesT helpertype1immunity.NatImmunol.6(12):1245-1252,2005

ABSTRACT

-T

T

Th

h

he

e

eE

E

Ef

f

ff

f

fe

e

ec

c

ct

t

to

o

of

f

fT

T

Ti

i

im

m

m-

-

-3

3

3-

-

-I

I

Ig

g

g o

o

on

n

nT

T

Tu

u

um

m

mo

o

or

r

rG

G

Gr

r

ro

o

ow

w

wt

t

th

h

h

Heo,YooMi

DepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity (SupervisedbyAssociateProfessorParkSun)

Tim-3,a member of the novel TIM (T cell immunoglobulin- and mucin-containing-domain)familyofmolecules,isthefirstmoleculeidentified to be specifically expressed on CD4+ _{Th1 and noton Th2 cells.Tim-3}

negatively regulates Th1 immunity and induces tolerance,butit's function has notbeen clarified in tumor immunity.To explore the effectofTim pathway blockade on tumor growth using Tim-3-Ig fusion protein,two approaches were adopted. First, it was investigated whether Tim-3-Ig expression in lung carcinoma cells (3LL) affects tumor growth in mice. Second,itwasinvestigatedwhetheradministrationofpurifiedTim-3-Ig into mice influences tumor growth. Tumor growth of 3LL cells expressing Tim-3-Ig wassuppressed ascompared with controlmousegroups.Further tumor growth in mice injected with purified Tim-3-Ig was inhibited as compared with controlmouse groups injected with human Ig and PBS, respectively. Additionally, Mammal I revealed the importance of Tim-3 glycosylation for its binding activity to Tim-3 ligand using Tim-3-Ig expressed by mammalian cells and by Sf9 cells.My results showed

suppressive effectofTim-3-Ig on tumorgrowth,implying significance of Tim-3-Tim-3ligandpathwayintumorimmunology.

K

KKeeeyyy wwwooorrrdddsss:T cellimmunoglobulin- and mucin domain-3 (Tim-3),tumor growth, glycosylation, mammalian expression vector system, Baculovirus expressionvectorsystem,tumorimmunity