Tim-3-Ig의 발현이 종양의 성장에 미치는 영향을 알기 위해서 3LL 세포에 Tim-3-Ig의 발현 벡터인 pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig과 벡터 대조군 pIRES2-EGFP를 각각 이입하여 Tim-3-Ig과 GFP를 안정적으로 발현하는 세포주 T1과 T2,GFP를 단독으로 발현하는 대조군 세포주 G1,G2를 확립하였다.확립된 세포주의 GFP 발 현을 유세포분석기로 분석하였다 (Fig.6-A).확립된 세포주 G1,G2의 형광 강도 가 T1,T2에 비해 강한 것을 알 수 있다.T1과 T2에서 Tim-3-Ig의 발현을 확인 하기 위해 RT-PCR을 시행하였다 (Fig.6-B).합성된 cDNA의 상태는
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-actin의 발현을 통하여 확인하였고,합성된 cDNA를 주형으로 하여 Tim-3-Ig의 5′쪽의 primer인 Tim-3F(NheI)와 사람 면역글로불린의 3′쪽의 primer인 HIgCR(BamHI) 을 사용하여 PCR을 수행하였다.그 결과,T1과 T2세포주에서 Tim-3-Ig의 유전 자 크기인 1.2Kb의 band가 증폭되었으며 G1,G2와 3LL 세포주에서는 이 band가 증폭되지 않는 것이 관찰되었다.따라서 T1,T2세포주가 Tim-3-Ig을 발현함을 확인할 수 있었다.A.
B.
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FFiiiggg... 666... EEEssstttaaabbbllliiissshhhmmmeeennnttt ooofff ssstttaaabbbllleee ccceeellllll llliiinnneeesss eeexxxppprrreeessssssiiinnnggg TTTiiimmm---333---IIIggg... pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig orpIRES2-EGFP wastransfected into3LL using Lipofectamin 2000.Transfected cells were selected with antibiotics,G418 and by FACS sorting.(A)GFP expression in stable celllines were examined by flow cytometry. T1 and T2 were established by transfection with pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig. G1 and G2 were established by transfection with pIRES2-EGFP.(B)To examineexpression ofTim-3-Ig,RT-PCR wasperformed using RNA isolated from each cellline.Upperpannel:RT-PCR using Tim-3-Ig specific primers Lowerpannel:RT-PCR using actin priemrs Lane Vector;PCR productfrom pIRES2-EGFP-Tim-3-Ig.
E.3LL 세포의 Tim-3-Ig발현이 종양 성장에 미치는 영향
종양 세포에서 Tim-3-Ig의 발현이 종양 성장에 미치는 영향을 알아보고자 C57BL/6마우스에 3LL 세포와 안정적으로 Tim-3-Ig을 발현하도록 한 T1,T2세 포,그리고 대조군 G1,G2세포 각각을 피하 주사하였다.주사한 후 2일째부터 3주간 종양의 크기를 측정하였다 (Fig7,8).
3LL 세포를 주사한 그룹에서는,주사한 지 6일째부터 세 마리의 마우스에 서 종양이 생성되기 시작하여 12일이 되자 네 마리 모두에서 종양이 생성되었 다.마우스는 종양세포 주사 후 16일째 이후부터 종양 성장 속도가 증가하였다.
G1세포를 주사한 그룹에서는,주사한 지 6일째부터 두 마리의 마우스에서 종양이 생성되기 시작하더니 10일 후에는 다섯 마리 모두에서 종양이 생성되었 다.그러나 처음 종양이 관찰되었을 때 종양의 크기는 3LL 세포 주사로 생긴 종 양 크기의 1/2정도 이었다.또한 G1종양 성장 속도가 3LL에 비해 느려 21일 후 종양 크기는 3LL의 1/3정도 이었다.G2세포를 주사한 그룹에서는 주사 후 8일째부터 세 마리의 마우스에서 종양이 생성되기 시작하여,10일 후에는 다섯 마리 모두에서 종양이 생성되었고,종양의 성장 속도는 G1세포와 비슷하였다.
반면에 Tim-3-Ig을 발현하는 T1과 T2 세포를 주사한 마우스에서는 3 주 동안 종양이 생성되지 않았다.이는 마우스에서 3LL 세포의 종양 성장이 이종 단백질 GFP의 발현으로도 의미 있게 억제되지만 3LL 세포의 Tim-3-Ig의 발현 으로 더욱 억제됨을 보여준다.
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FFiiiggg... 777... TTThhheee tttuuummmooorrr gggrrrooowwwttthhh iiinnn mmmiiiccceee iiinnnooocccuuulllaaattteeeddd wwwiiittthhh 333LLLLLL ccceeellllll llliiinnneeesss e
eexxxppprrreeessssssiiinnnggg TTTiiimmm---333---IIIggg...C57BL/6micewereinjectedwith3×105cells100㎕ to therightflank.From Day 2 tumorgrowth wasobserved by measuring the length(L)andwidth(w)oftumormass.Tumorvolumewascalculatedusing thefollowing formula;volume=0.523Lw2.Thedatarepresentedaremean±
SD offivemiceineachgroupexcept3LL (4mice).
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FFiiiggg...888...TTThhheeeppphhhoootttooogggrrraaappphhh ooofffmmmiiiccceeewwwiiittthhh tttuuummmooorrrsss...Micewerephotographedon 24thdayaftertumorinjection.*Photographtakenon22ndday.